Khảo sát tác động ức chế HMG-CoA reductase của quercetin, chalcon và dẫn chất in silico, in vitro và in vivo

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ HMG-CoA<br /> REDUCTASE CỦA QUERCETIN, CHALCON<br /> VÀ DẪN CHẤT IN SILICO, IN VITRO VÀ IN VIVO<br /> Nguyễn Thị Thanh Huyền, Nguyễn Thị Anh Thư, Phạm Nhị Hà Linh, Trần Thành Đạo, Trần Mạnh Hùng*<br /> <br /> TÓMTẮT<br /> Mở đầu: HMG-CoA reductase (HMGR) là enzym chính trong chu trình tổng hợp cholesterol, là đối<br /> tượng nghiên cứu các thuốc điều trị rối loạn lipid huyết.<br /> Mục tiêu: Khảo sát tác động ức chế HMGR in silico, in vitro và in vivo của quercetin (Q), chalcon và<br /> dẫn chất.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Chuột nhắt chủng Swiss albino, đực, trọng lượng 25 ± 2g<br /> được sử dụng. Hai mươi hợp chất gồm Q, chalcon và các dẫn chất được cung cấp bởi Viện Công Nghệ Hóa<br /> Học và Bộ môn Hóa Dược, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Docking được thực hiện bằng phần mềm<br /> LeadIT, cấu trúc 3D được vẽ bằng phần mềm Sybyl-X1.1 và phân tích kết quả docking bằng phần mềm<br /> FlexX. Tác động ức chế HMGR in vitro và in vivo được tiến hành theo bộ KIT Sigma Aldrich và đánh giá<br /> trên mô hình gây tăng lipid huyết bằng tyloxapol.<br /> Kết quả: Có 17 chất docking thành công vào vùng hoạt động của HMGR. Các chất có liên kết với<br /> Arg B590 ở vùng hoạt động đều có tác động ức chế HMGR in vitro. Chín chất có khả năng ức chế<br /> HMGR gồm Q, Q1, Q3, Q4, Q5; Ca, Ce, Ck, Cm; trong đó 4 chất ức chế HMGR với IC50 tương ứng<br /> là 11,2 g/ml (Q3), 3,94 g/ml (Q5), 13,65 g/ml (Ca) và 5,28 g/ml (Ce). Q3 liều 50 mg/kg và 100<br /> mg/kg, Ce liều 125 mg/kg và 200 mg/kg đều có tác động hạ cholesterol huyết nhưng không có tác động<br /> hạ triglycerid huyết.<br /> Kết luận: Quercetin, chalcon và một số dẫn chất có khả năng tương tác với HMGR in silico, thể hiện<br /> tác động ức chế HMGR in vitro và in vivo.<br /> Từ khóa: Quercetin, HMG-CoA reductase, docking, tyloxapol, chuột nhắt<br /> ABSTRACT<br /> STUDY ON INHIBITORY EFFECTS OF QUERCETIN, CHALCONE AND THEIR DERIVATIVES<br /> ON HMG-CoA REDUCTASE IN SILICO, IN VITRO AND IN VIVO<br /> Nguyen Thi Thanh Huyen, Nguyen Thi Anh Thu, Pham Nhi Ha Linh, Tran Thanh Dao,<br /> Tran Manh Hung<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 574 – 581<br /> <br /> Background: HMG-CoA reductase (HMGR) is a key enzyme in biosynthesis of cholesterol and a<br /> studying object for develope of anti-dyslipidemia drugs.<br /> Aim of the study: To investigate binding capacity of quercetin (Q), chalcone and its derivatives on<br /> HMGR in a docking model.<br /> *<br /> Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Mạnh Hùng ĐT: 0937746596 Email: manhhung@ump.edu.vn<br /> <br /> <br /> 574 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Methods: Male Swiss albino mice weighting 25  2 g were used. Twenty substances including Q,<br /> chalcone and 18 derivatives were provided by Institute of Chemical Technology and department of<br /> Pharmaceutical Chemistry, HCM University of Medicine and Pharmacy. Docking was performed on<br /> LeadIT software, 3D structure was illustrated by Sybyl-X1.1 software and analyzed by Conj Grad method<br /> and FlexX software. Inhibitory effects of Q, chalcone and its derivatives on HMGR in vitro was evaluated<br /> by Sigma Aldrich KIT. Inhibition of HMGR in vivo was determined via serum cholesterol in tyloxapol-<br /> induced hypercholesteremia mice.<br /> Results: Seventeen substances were successfully docked into the active site of HMGR. Substances<br /> showing interaction with Arg B590 in the active site, exerted HMGR inhibitory effect in vitro. Nine<br /> substances, namely Q, Q1, Q3, Q4, Q5, Ca, Ce, Ck and Cm inhibited HMGR in vitro, of those Q3, Q5, Ca<br /> and Ce showed significantly inhibitory effects with IC50 of 11.2 g/ml (Q3), 3.94 g/ml (Q5), 13.65 g/ml<br /> (Ca) and 5.28 g/ml (Ce). Q3 at doses of 50 mg/kg and 100 mg/kg and Ce at doses of 125 mg/kg and 200<br /> mg/kg exerted cholesterol-lowering action in tyloxapol-induced hyperlipidemia but not for triglyceride.<br /> Conclusion: Quercetin, chalcone and its derivatives were able to interact with HMGR in silico and<br /> showed inhibitory effects on HMGR in vitro and in vivo.<br /> Key words: Quercetin, HMG-CoA reductase, docking, tyloxapol, mouse<br /> ĐẶTVẤNĐỀ ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> Rối loạn lipid huyết là nguyên nhân chính Động vật thử nghiệm<br /> gây xơ vữa động mạch. HMG-CoA reductase Chuột nhắt chủng Swiss albino 8 tuần tuổi,<br /> (HMGR) là enzym xúc tác đóng vai trò then chốt giống đực, thể trọng 25 ± 2g, khỏe mạnh, cung<br /> trong chu trình tổng hợp cholesterol, là đối cấp bởi Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh được<br /> sử dụng.<br /> tượng nghiên cứu chủ yếu trong điều trị rối loạn<br /> Hóa chất và thuốc thử nghiệm<br /> lipid huyết. Dự phòng và điều trị rối loạn lipid<br /> Quercetin và 9 dẫn chất (Q, Q1, Q2, Q3,<br /> huyết bằng các thuốc có nguồn gốc dược liệu<br /> Q4, Q5, Q6, Q7, Q8, Q9) và 10 dẫn chất<br /> ngày càng được quan tâm. Gần đây, một số<br /> chalcon (Ca, Cb, Cc, Cd, Ce, Cf, Cg, Ch, Ck,<br /> nghiên cứu về quercetin đã chứng minh rằng Cm) được cung cấp bởi Viện Công Nghệ Hóa<br /> quercetin có tác động làm giảm tích tụ lipid ở Học TP. Hồ Chí Minh và Bộ môn Hóa Dược –<br /> gan chuột thực nghiệm(4); làm giảm quá peroxyd Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Độ tinh<br /> hóa lipid và nồng độ lipid trong huyết thanh khiết và cấu trúc hóa học của các dẫn chất<br /> chuột(1); cải thiện sự chuyển hóa glucose và lipid được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lớp<br /> mỏng, phổ UV, phổ IR, phổ 1H-NMR trước khi<br /> trên mô hình chuột bị rối loạn chuyển hóa(6). Tuy<br /> đưa vào thử nghiệm với yêu cầu: độ tinh khiết<br /> nhiên, hiện chưa có nghiên cứu nào công bố về<br /> > 95%; có 2 đỉnh hấp thu UV đặc trưng nằm<br /> tác động ức chế HMGR của quercetin, chalcon trong các dãy: 310-350 nm, 250-280 nm; phổ IR<br /> và dẫn chất. Đề tài này định hướng nghiên cứu cho thấy sự có mặt của các đỉnh đặc trưng của<br /> tác động ức chế HMGR của quercetin, chalcon các nhóm chức trong phân tử như nhóm -OH,<br /> và một số dẫn chất với mục tiêu sau “Khảo sát -CH, -C=O, -C=C, -C-O-, phổ NMR tương ứng<br /> khả năng gắn kết với HMGR và tác động ức chế với cấu trúc xác định. Công thức hóa học của<br /> các mẫu khảo sát như sau: quercetin (Q):<br /> HMGR của quercetin, chalcon và dẫn chất trên<br /> 3,3’,4’,5,7-pentahydroxy flavon, Q1: 3,3’,4’,5,7-<br /> mô hình docking in silico, in vitro và in vivo.<br /> pentahydroxy-8-((4-methyl-piperazin-1-<br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 575<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> yl)methyl) flavon, Q2: 3-hydroxy-3’,4’,5,7- lượng bằng phương pháp Conj Grad với<br /> tetramethoxy flavon, Q3: 5-hydroxy-3,3’,4’,7- điểm dừng là thay đổi năng lượng dưới<br /> tetraallyloxy flavon, Q4: 3,3’,4’,5,7- 0,0001 kcal.mol-1, số bước lặp lại tối đa là<br /> pentahydroxy-8-(morpholin-1- ylmethyl) flavon, 10.000 bước. Ứng dụng phương pháp động<br /> Q5: 3,3’,4’,5,7-pentapropioyloxy flavon, Q6: lực học phân tử để thu cấu dạng năng lượng<br /> 3,3’,4’,5,7-pentamethoxy flavon, Q7: 3,3’,4’,7- thấp nhất.<br /> tetrakis(N-n-butylcarbamoyloxy)- 5-hydroxy Docking phối tử vào mục tiêu tác động<br /> flavon, Q8: 3,3’,4’,5,7-pentaacetoxy flavon, Q9:<br /> Docking bằng phần mềm LeadIT 2.0.2.<br /> 3,3’,4’,5,7-pentahydroxy-6,8-bis(pyrolidin- 1-<br /> Số kết quả tối đa cho mỗi bước lặp là 1000,<br /> ylmethyl) flavon, Ca (3-(furan-2-yl)-1-(pyridin-2-<br /> cho mỗi sự phân mảnh phối tử là 200, giữ lại<br /> yl) propen-1-on), Cb (1-(furan-2-yl)-3-(pyridin-3-<br /> 10 cấu dạng tốt nhất của mỗi phân tử hợp<br /> yl)propen-1-on, Cc (E)-1-(furan-2-yl)-3-(3-<br /> chất trong phức hợp gắn kết để phân tích.<br /> hydroxyphenyl)prop-2-en-1-on, Cd (E)-1-<br /> Cấu dạng tốt nhất là cấu dạng có điểm số<br /> (pyridin-2-yl)-3-(pyridin-4-yl)prop-2-en-1-on, Ce<br /> docking âm nhất.<br /> (E)-3-(pyridin-3-yl)-1-(thiophen-2-yl)prop-2-en-<br /> 1-on, Cf (E)-1-(pyridin-2-yl)-3-(thiophen-2- Docking lại phối tử đồng kết tinh<br /> yl)prop-2-en-1-on, Cg (E)-3-(furan-2-yl)-1- Docking lại phối tử đồng kết tinh trong<br /> (thiophen-2-yl)prop-2-en-1-on, Ch (E)-3- cấu trúc tinh thể protein để đánh giá mức<br /> (pyridin-4-yl)-1-(thiophen-2-yl)prop-2-en-1-on, độ phù hợp.<br /> Ck (E)-1-(2,4-dihydroxy-5-(morpholinomethyl) Phân tích kết quả docking<br /> phenyl)-3-(pyridin-3-yl)prop-2-en-1-on và Cm Phân tích các tương tác giữa phối tử với mục<br /> (E)-1-benzyl-3-(3-(4-(benzyloxy)-2- tiêu tác động: liên kết hydro, tương tác π-π,<br /> hydroxyphenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)pyridin-1- cation-π, tương tác Val der Waals… (phần mềm<br /> ium iodid. FlexX). Chọn ra những chất có điểm số tương<br /> Bộ Kit thử hoạt tính HMGR của Sigma- đối tốt để thử nghiệm in vitro để tìm ra mối liên<br /> Aldrich, bảo quản ở nhiệt độ -70oC. quan giữa cấu trúc và tác dụng.<br /> Bộ kit định lượng triglycerid, cholesterol<br /> trong huyết tương của Human Co., Đức<br /> Hóa chất, thuốc thử khác đều đạt tiêu<br /> chuẩn thí nghiệm.<br /> Mô hình docking phân tử quercetin và các<br /> dẫn chất quercetin trên HMGR<br /> Lựa chọn, chuẩn bị cấu trúc mục tiêu tác<br /> động<br /> Sử dụng ngân hàng cơ sở dữ liệu protein<br /> (PDB) để tìm cấu trúc nhiễu xạ tinh thể tia X của<br /> HMGR người, có phối tử đồng kết tinh là một<br /> thuốc nhóm statin, có độ phân giải cao.<br /> Chuẩn bị cấu trúc phối tử<br /> Tập hợp cấu trúc phối tử được xây dựng<br /> từ các chất đã tổng hợp và các tài liệu tham<br /> khảo. Cấu trúc 3D được vẽ bằng phần mềm<br /> Sybyl–X 2.0 sau đó được tối thiểu hóa năng<br /> <br /> <br /> 576 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Khảo sát tác động ức chế HMGR in vitro của DMSO 5% 0,1 ml/10g/ngày (DMSO được dùng<br /> quercetin, chalcon và dẫn chất để hòa tan các chất thử nghiệm).<br /> Hoạt tính HMGR được xác định bằng cách - Lô Tyloxapol 250 mg/kg: IV dung dịch<br /> đo độ giảm hấp thu của NADPH ở bước sóng tyloxapol liều 250 mg/kg, sau đó uống nước<br /> 340 nm (mỗi 15 giây trong 5 phút) theo phản ứng 0,1 ml/ngày.<br /> xảy ra với sự xúc tác của HMGR như sau(3): - Lô Atorvastatin 64 mg/kg: IV tyloxapol 250<br /> HMG-CoA + 2NADPH + 2H → mevalonat + mg/kg, sau đó uống atorvastatin 64 mg/kg/ngày.<br /> + 2NADP+ + CoA-SH - Các lô điều trị: IV tyloxapol 250 mg/kg, sau<br /> Hoạt độ enzym tính theo công thức sau: đó uống chất thử nghiệm với các liều khác nhau.<br /> Sau 24 giờ IV tyloxapol, lấy máu tĩnh mạch<br /> đuôi chuột và định lượng cholesterol,<br /> triglycerid.<br /> Trong đó:<br /> Phương pháp định lượng nồng độ<br /> 12,44 = εmM – độ hấp thu của NADPH là 6,22 mM-<br /> 1<br /> cm-1; 12,44 = 2 NADPH tiêu thụ<br /> cholesterol và triglycerid huyết<br /> TV = Tổng thể tích phản ứng (1 ml nếu đo bằng ống đo Định lượng cholesterol và triglycerid theo<br /> và 0,2 ml nếu đo bằng đĩa). nguyên tắc enzym màu theo bộ KIT của<br /> V = thể tích enzym sử dụng trong định lượng (ml). Human Co.<br /> 0,6 = Nồng độ enzym tính bằng mg-protein (mgP)/ml KẾTQUẢ<br /> (0,50-0,70 mgP/ml)<br /> Docking phân tử atorvastatin, quercetin,<br /> LP = độ dài đường truyền tính bằng cm (1 đối với ống<br /> chalcon và các dẫn chất trên HMGR<br /> đo và 0,55 đối với đĩa).<br /> Trong 19 cấu trúc nhiễu xạ tinh thể tia X<br /> Khi thêm vào hỗn hợp phản ứng các chất<br /> ức chế HMGR (pravastatin hoặc các chất thử có 13 protein không có phối tử đồng kết tinh<br /> nghiệm), mức độ phản ứng xảy ra thấp hơn và (PDB code: 3CCT, 3CCW, 3CCZ, 3CD0,<br /> làm độ hấp thu tăng lên so với khi không có 3CD5, 3CD7, 3CDA, 3CDB, 2R4F, 3BGL,<br /> chất ức chế. Khả năng ức chế HMGR của chất 2Q1L, 2Q6B, 2Q6C) và 6 protein có phối tử<br /> thử nghiệm được tính theo công thức: đồng kết tinh: mevastatin (1HW8),<br /> simvastatin (1HW9), fluvastatin (1HWI),<br /> cerivastatin (1HWJ), atorvastatin (1HWK) và<br /> Chất thử nghiệm được hòa tan trong rosuvastatin (1HWL). Dựa vào cấu trúc<br /> DMSO 5% và thử ở 3 nồng độ khác nhau (sàng protein và mục tiêu nghiên cứu (ức chế<br /> lọc) hoặc tối thiểu 5 nồng độ khác nhau (xác HMGR của người in vitro, in vivo với chất<br /> định IC50). Ảnh hưởng của DMSO lên hoạt đối chiếu là pravastatin và atorvastatin), chỉ<br /> tính của HMGR được kiểm tra trước khi đánh có HMGR 1HWK đáp ứng yêu cầu.<br /> giá tác động ức chế enzym của chất khảo sát.<br /> Docking 20 chất nghiên cứu cùng<br /> Khảo sát tác động của dẫn chất tiềm năng atorvastatin trên protein HMGR 1HWK cho<br /> trên mô hình tăng lipid cấp bằng tyloxapol kết quả có 17 hợp chất được dock vào vùng<br /> Chuột sau khi ổn định, được cho nhịn đói tác động của HMGR với điểm số docking từ<br /> tối thiểu 8 giờ và chia ngẫu nhiên thành các lô: -30,38 kJ/mol đến -4,23 kJ/mol. Có 3 hợp<br /> - Lô chứng: tiêm IV dung dịch NaCl 0,9% chất không tương tác được với HMGR<br /> (0,1 ml/10 g chuột). Sau đó, chuột được uống (bảng 1).<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 577<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> Bảng 1: Kết quả docking trên enzym HMGR 1HWK<br /> STT Công thức Điểm docking(kJ/mol) Liên kết hydro<br /> 1 Q -24,79 Asp B690, Lys B691, Asn A755, GluA559, Cys A561, Ser B684, Lys A735<br /> 2 Q1 -30,38 Lys B691, Asn A755, Ala A751, Ser B684, Glu A559<br /> 3 Q2 -15,97 Asn B658, Lys B691<br /> 4 Q3 -4,23 Arg B590, Ser A565<br /> 5 Q4 -25,55 Asn B658, Lys B691, Gly A560, Arg B590, Glu A559<br /> 6 Q5 -14,14 Arg A568, Asn A755, Lys B691, Arg B590, Ser B684<br /> 7 Q6 -13,80 Ser A565, Lys B691<br /> 8 Ca -20,083 Lys B691, Arg B590 (π-cation)<br /> 9 Cb -18,236 Lys A735, Arg B590 (π-cation)<br /> 10 Cc -18,235 Glu A559, Asn A755, Lys B691, Arg B590 (π-cation)<br /> 11 Cd -17,710 Lys A735, Arg B590<br /> 12 Ce -21,177 Lys A735, Arg B590 (liên kết hydro và π-cation)<br /> 13 Cf -16,139 Asn A755<br /> 14 Cg -16,946 Arg B590, Lys B692 (π-cation)<br /> 15 Ch -17,627 Asn A755, Lys A735, Ser B684, Lys B591, Arg B590 Lys A735, Arg B590 (π-cation)<br /> <br /> 16 Ck -18,293 Glu A559, Lys A735, Asp B690, ArgB590, Lys B691 (π-cation), Arg B590 (π-cation)<br /> 17 Cm -18,926 Lys B591, Lys B592<br /> 18 Atorvastatin -39,725 Ser A565, Glu A59, Asn A755, Asp B690, Lys A735, Arg B590, Ser B684<br /> 19 Pravastatin -35,353 Lys A735, Glu A559, Asn A755, Lys B691, Asp B690, Arg B590, Ser B684, Lys B692<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Docking lại phối tử đồng kết tinh atorvastatin (Ator) trên HMGR 1HWK (A) và tương tác của Q1<br /> (B), Q3 (C), Ce (D) với các acid amin của HMGR 1HWK<br /> <br /> <br /> 578 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Các hợp chất Q1, Q4, Q, Ca, Ce (< -20 KJ/mol) mục tiêu tác động. Q1 tạo được liên kết hydro<br /> là những hợp chất tương tác mạnh; Q2, Q5, Q6, với Lys B691 tại nhóm –OH (chiếm 52% liên<br /> Cb, Cc, Cf, Cg, Ch, Ck, Cm (-20 KJ/mol-