Khảo sát tình trạng chuyển hóa sắt trên mô hình chuột nhắt trắng mô phỏng bệnh gan ở người nghiện rượu

Chia sẻ: Hạnh Hoa | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

60
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu "Khảo sát tình trạng chuyển hóa sắt trên mô hình chuột nhắt trắng mô phỏng bệnh gan ở người nghiện rượu" với mục tiêu nhằm xây dựng mô hình mô phỏng bệnh gan và tình trạng sắt thừa ở người nghiện rượu trên chuột nhắt trắng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khảo sát tình trạng chuyển hóa sắt trên mô hình chuột nhắt trắng mô phỏng bệnh gan ở người nghiện rượu

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 KHẢO SÁT TÌNH TRẠNG CHUYỂN HÓA SẮT TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT NHẮT TRẮNG MÔ PHỎNG BỆNH GAN Ở NGƯỜI NGHIỆN RƯỢU Tất Chí Hùng*, Đỗ Thị Hồng Tươi* TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng mô hình mô phỏng bệnh gan và tình trạng sắt thừa ở người nghiện rượu trên chuột nhắt trắng. Phương pháp: Chuột được cho uống dung dịch ethanol 20% (g/ml), sau đó theo dõi lượng rượu tiêu thụ, trọng lượng cơ thể và tình trạng dinh dưỡng mỗi ngày . Sau 8 tuần, thu nhận mẫu máu xác định hoạt tính men gan, các chỉ số sắt huyết thanh, tách lấy gan xác định nồng độ protein, sắt và phân tích mô học. Kết quả: chuột được cho uống dung dịch ethanol 20% biểu hiện tình trạng viêm gan nhưng chưa có sự xơ hóa thể hiện qua chỉ số AST, ALT tăng và hình ảnh vi thể. Ngoài ra, chuột được gây bệnh có hiện tượng thừa sắt trong gan thể hiện qua nồng độ sắt trong gan tăng và sắt tích tụ trong tế bào khi phân tích vi thể bằng phương pháp nhuộm Perls. Kết luận: mô hình gây được tình trạng viêm gan do rượu và sắt thừa tích tụ trong gan. Từ đó có thể sử dụng những mô hình này để nghiên cứu tác dụng phòng và điều trị bệnh gan do rượu của các chất mới hoặc dược liệu theo cơ chế loại bỏ sắt thừa trong gan. Từ khóa: bệnh gan do rượu, chuyển hóa sắt, rượu ABSTRACT INVESTIGATION ON IRON METABOLISM IN MICE MODEL MIMICKING ALCOHOLIC LIVER DISEASE Tat Chi Hung, Đo Thi Hong Tuoi * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 418 - 423 Objectives: The aim of this work is to establish a mice model mimicking alcoholic liver disease (ALD) and to study iron homeostasis. Methods: Mice were used to induce liver injury by feeding ethanol in water at a final concentration of 20% (g/ml). Alcohol consumption, body weight and diet were daily determined. After 8-week treatment, blood samples were used for biochemical assays, liver tissues were excised for total protein and iron assays as well as histological analysis. Results: Mice fed ethanol in water at 20% (g/ml) exhibited hepatitis without fibrosis, as measured by rise in AST, ALT activity and histological photomicrographs. Moreover, a hepatic iron overload was observed in ethanolfed mice by increase in liver iron concentration and iron-laden hepatocytes at histological examination using Perls staining. Conclusions: Results showed that in mice, ethanol induced hepatitis and hepatic iron overload paralleling alcohol-induced liver injury in human ALD. Thus, ethanol-fed mice model could be applied to study prevention and treatment effect of novel molecules or plants extracts on alcoholic liver disease by removing excessive iron. Key words: alcoholic liver disease, iron metabolism, alcohol * Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp.HCM Tác giả liên lạc: TS. Đỗ Thị Hồng Tươi 418 ĐT: 0908683080 Email: hongtuoid99@gmail.com Chuyên Đề Dược Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Một số nghiên cứu báo cáo tình trạng thừa sắt trong gan ở những bệnh nhân bệnh gan do rượu và sắt thừa làm tăng độc tính của rượu trên gan(6,7). Những nghiên cứu in vitro cho thấy một số chất hoặc dược liệu chứa polyphenol có tác dụng bảo vệ gan nhờ cơ chế loại bỏ sắt thừa trong gan(1,2,4). Những kết quả này cần được khẳng định ở cấp độ in vivo trên động vật nhưng mô hình chuột nhắt mô phỏng bệnh gan do rượu ở Việt Nam còn rất hạn chế. Vì vậy, chúng tôi thực hiện xây dựng mô hình chuột nhắt trắng mô phỏng bệnh gan ở người nghiện rượu và khảo sát tình trạng chuyển hóa sắt trên mô hình này với hy vọng tìm được mô hình thích hợp để nghiên cứu tác dụng phòng và điều trị bệnh gan do rượu của các chất mới hoặc dược liệu theo cơ chế loại bỏ sắt thừa trong gan. ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Chuột nghiên cứu Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss albino, 68 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 22 ± 2 g, được cung cấp bởi Viện Vaccin và Sinh phẩm Nha Trang. Chuột được nuôi riêng lẻ trong các ô ngăn cách bằng khung lưới của lồng có kích thước 35 x 25 x 15 cm (6 ô/lồng). Chuột được cung cấp thức ăn và nước uống theo điều kiện của mô hình thí nghiệm. Hóa chất và trang thiết bị Ethanol (Guangdong), dung dịch đỏ trung tính (neutral red) 0,1%, ferrocyanid 20%, HCl 20%, đệm PBS 1X, NaCl 0,9%, nước cất đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích. Nghiên cứu Y học Cung cấp cám viên không giới hạn. Mô hình này đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu để mô phỏng tình trạng nghiện rượu ở người (3). Xác định lượng ethanol tiêu thụ mỗi ngày methanol (g) = [Vdung dịch ban đầu (ml) – Vdung dịch sau 24 giờ (ml)] × 0,2. Khảo sát tình trạng dinh dưỡng của chuột thử nghiệm mỗi ngày mthức ăn (g) = mthức ăn ban đầu (g) – mthức ăn sau 24 giờ (g) Theo dõi trọng lượng cơ thể chuột Sự thay đổi trọng lượng cơ thể của chuột được ghi nhận bằng cách cân chuột 3 lần/tuần. Xác định hoạt tính men gan (AST, ALT) Sau 8 tuần, chuột được giết, lấy máu tim xét nghiệm hoạt tính ALT, AST tại Khoa Sinh hóa, Bệnh viện Chợ Rẫy, TP.HCM trên máy Hitachi 917 lần lượt với các kit 80327 và 80325 (Biolabo) bằng phương pháp đo động học enzym. Phân tích mô học xác định mức độ tổn thương gan Sau 8 tuần, chuột được giết, tách lấy gan, rửa sạch bằng NaCl 0,9% lạnh. Thấm khô, cân và ghi nhận trọng lượng. Quan sát đại thể về màu sắc, tình trạng bề mặt, tổn thương. Một phần gan được cố định trong formol 10% để làm xét nghiệm vi thể bằng phương pháp nhuộm HE (hematoxylin và eosin), trichrom tại khoa Sinh hóa – Bệnh viện Nhi Đồng 1, TP.HCM. Quan sát cấu trúc, hình thái tế bào gan dưới kính hiển vi, đánh giá mức độ tổn thương gan. Mô hình cho chuột uống dung dịch ethanol 20% (g/ml) Xác định protein toàn phần trong gan Chuột được chia thành 2 lô, mỗi lô 6 con: lô chứng cho uống nước cất và lô thử cho uống dung dịch ethanol nồng độ tăng dần: 10% (g/ml) cho 2 ngày đầu, 15% cho 5 ngày tiếp theo, 20% từ tuần thứ 2. Dung dịch ethanol hoặc nước cất là nguồn cung cấp nước duy nhất đựng trong xilanh thiết kế đặc biệt cho chuột uống tự nhiên. (pH 7,4) theo tỉ lệ 1g/1ml. Ly tâm (12000g) Chuyên Đề Dược Học Gan được nghiền trong đệm PBS 1X lạnh trong 15 phút ở 4°C, lấy dịch trong cho vào eppendorf để định lượng protein toàn phần bằng phương pháp Biuret trên máy Hitachi 917, kit A42.600.16 (BioLabo) tại Khoa Sinh hóa, Bệnh viện Chợ Rẫy. 419 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Định lượng sắt huyết thanh và sắt toàn phần trong gan Huyết thanh và dịch gan sau ly tâm được Lượng thức ăn tiêu thụ Chuột uống dung dịch ethanol 20% tiêu thụ cám viên tăng dần nhưng ít hơn khoảng 2 g so dùng định lượng sắt trên máy Hitachi 917 với với chuột chứng (4 g/ngày so với 6 g/ngày). bộ kit 92108 (Biolabo) bằng phương pháp Sự thay đổi trọng lượng cơ thể Feren S. Định lượng transferrin huyết thanh Trọng lượng chuột ở lô chứng tăng nhanh liên tục (Hình 1). Sự tăng trọng lượng của chuột Định lượng transferrin huyết thanh thực ở lô thử có thể chia theo 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: hiện trên máy BS 300 (Mindray) với bộ kit trọng lượng giảm trong tuần 1. Giai đoạn 2: 1102134 (Spinreact) bằng phương pháp đo độ trọng lượng duy trì ổn định trong khoảng 2 tuần. đục miễn dịch. Giai đoạn 3: từ tuần 4-8 trọng lượng tăng với tỷ Xác định độ bão hòa của transferrin lệ thấp hơn so với lô chứng. Giá trị sắt và transferrin huyết thanh được dùng để tính độ bão hòa transferrin (TS) theo công thức TS = (Sắthuyết thanh/Transferrinhuyết thanh) x 4. Phương pháp nhuộm Perls Cố định gan trong formol 10%, xử lý bằng máy tự động tại khoa Sinh hóa – bệnh viện Nhi Đồng 1. Ngâm lam mẫu trong nước cất 10 phút, ủ 20 phút với kali ferrocyanid 20% trong HCl 20%. Rửa lam mẫu 3 lần với nước cất (5 phút/lần), nhuộm 15 phút với dung dịch đỏ trung tính 0,1%. Rửa sạch bằng nước, loại nước trong cồn tuyệt đối, để khô. Phân tích kết quả-xử lý số liệu thống kê Kết quả trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình và đánh giá ý nghĩa thống kê bằng test MannWhitney (phần mềm Minitab 14.0). Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Lượng rượu tiêu thụ Trong 2-3 tuần đầu lượng rượu tiêu thụ tăng dần đến mức tối đa, sau đó ổn định trong suốt thời gian thử nghiệm. 420 Mức độ tổn thương gan Tỉ lệ trọng lượng gan trên trọng lượng cơ thể Tỉ lệ trọng lượng gan trên trọng lượng cơ thể của chuột ở lô thử và lô chứng khác biệt không đáng kể (Bảng 1: p = 0,200) Lượng protein toàn phần trong gan So với chuột chứng, lượng protein toàn phần của gan chuột thử giảm hơn 60% (Bảng 1, p = 0,005). Bảng 1. Tỉ lệ trọng lượng gan/trọng lượng cơ thể và lượng protein toàn phần của gan. Kí hiệu ** biểu hiện cho p < 0,01 khi so sánh lô thử với lô chứng. Tỉ lệ TL gan/TL cơ Protein toàn phần thể của gan Lô chứng Lô thử Lô chứng Lô thử Chuột uống dung 100,0 ± 91,0 ± 100,0 ± 37,4 ± dịch ethanol 20% 7,5 13,9 13,2 8,5** Thay đổi hoạt tính men gan ALT, AST Hoạt tính ALT, AST của chuột thử tăng so với chuột chứng (Hình 2, ALT: +78,8%, p = 0,0131; AST: +74,3%, p = 0,036). Thay đổi về mặt mô học Chuột thử và chứng đều có gan màu đỏ tươi, bề mặt nhẵn, không phù nề, không sung huyết khi quan sát đại thể. Mô hình gây được tình trạng viêm gan trên 100% chuột ở lô thử tương tự viêm gan do rượu ở người thể hiện qua kết quả phân tích vi thể (Hình 3). Chuyên Đề Dược Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học Hình 1. Trọng lượng cơ thể chuột Hình 2. Hoạt tính men gan ALT, AST.* và ** lần lượt biểu hiện cho p < 0,05 và p < 0,01 khi so sánh lô thử với lô chứng. A B C D E F Hình 3. Hình ảnh vi thể gan chuột (X400). Lô chứng: nhuộm HE (A, B); nhuộm trichrom (C); lô thử: tế bào viêm xâm nhập khoảng cửa (E), tế bào kupffer phình to (D), không xơ hóa (F). Tình trạng chuyển hóa sắt Chuyên Đề Dược Học Chuột gây bệnh có sắt toàn phần trong gan 421 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 tăng đáng kể so với chuột chứng (Hình 4A). Kết quả này được củng cố thêm bởi những hình ảnh vi phẫu nhuộm Perl tế bào gan (Hình 4B,C): 70% chuột lô thử có tế bào gan nhuộm màu xanh thể hiện tình trạng tích lũy sắt thừa. A B C \ Hình 4. Nồng độ sắt toàn phần trong gan chuột (A) và hình ảnh vi thể (X1000) tế bào gan sau khi nhuộm Perls: lô chứng (B); lô thử (C). Màu xanh dương đậm, dạng hạt là hemosiderin. trong những nguyên nhân làm tình trạng viêm Các chỉ số sắt huyết thanh gồm sắt, gan. Thật vậy, sắt làm tăng sinh các gốc tự do transferrin huyết thanh; độ bão hòa transferrin gây ra bởi ethanol làm tăng độc tính của ethanol, của chuột gây bệnh gan do rượu khác biệt gây peroxyd hóa lipid màng tế bào dẫn đến phá không đáng kể so với chuột chứng (dữ liệu hủy tế bào gan(4). không trình bày). BÀN LUẬN Từ thực nghiệm cho thấy, chuột lô thử trong mô hình có tình trạng tiêu thụ ethanol tăng dần, trong khi đó trọng lượng cơ thể tăng nhẹ hơn so với lô chứng. Mô hình gây được tình trạng viêm gan do rượu, chưa thấy xuất hiện xơ hóa, thể hiện qua các hình ảnh rất đặc trưng khi so sánh trên lâm sàng ở người bệnh gan do rượu(5). Kết quả được củng cố bởi tăng AST, ALT trong xét nghiệm hoạt tính men gan. Về tình trạng chuyển hóa sắt, chuột được gây bệnh gan do rượu đều có lượng sắt toàn phần trong gan tăng rất đáng kể so với lô chứng. Kết quả này củng cố cho thực tế lâm sàng rằng người nghiện rượu có 50-60% trường hợp thừa sắt trong gan và hoàn toàn phù hợp nghiên cứu in vitro cho thấy ethanol làm tăng sắt nội bào do làm tăng biểu hiện các gen mã hóa cho protein dự trữ sắt L-ferritin, vận chuyển sắt như transferrin…(4). Thừa sắt tích tụ trong gan là một 422 Các chỉ số sắt huyết thanh gồm sắt, transferrin huyết thanh; độ bão hòa transferrin của chuột gây bệnh gan do rượu trên mô hình không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng. Điều này cho thấy tình trạng thừa sắt ở giai đoạn đầu, sắt mới chỉ tăng trong gan, chưa ảnh hưởng đến sắt hệ thống. KẾT LUẬN Mô hình cho chuột uống dung dịch ethanol 20% (g/ml) gây được tình trạng viêm gan và thừa sắt tích tụ trong gan như bệnh gan ở người nghiện rượu. Có thể sử dụng mô hình này để nghiên cứu tác dụng loại bỏ sắt thừa trong gan của các chất/dược liệu theo hướng phòng và điều trị bệnh gan. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. 2. 3. Acker Saskia ABE van (1998). Influence of Iron Chelation on the Antioxidant Activity of Flavonoids. Biochemical Pharmacology 56:935-943. Brittenham GM (2003). Iron chelators and iron toxicity. Alcohol. 30:151-158. Coleman Ruth A et al. (2008). A Pratical Method of Chronic Ethanol Administration in Mice, in Alcohol: Methods and Chuyên Đề Dược Học