Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:80

Thêm vào BST

Báo xấu

46
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận tốt nghiệp đại học này được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch HgCl2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng; xác định ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum; xác định môi trường nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum tái sinh từ mầm ngủ... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ THU HOÀI Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI MỐC HỒNG (PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2015-2019 Thái Nguyên, năm 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ THU HOÀI Tên đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI MỐC HỒNG (PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K47 - CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2015-2019 Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2019
i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro ”. Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài. Đồng thời, em xin cám ơn ThS. Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian có hạn không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ, thành công trong cuộc sống. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 03 tháng 6 năm 2019 Sinh viên thực hiện Dương Thị Thu Hoài
ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] ...............................................................8 Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ....................................................................25 Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của dung dịch HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) ....35 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) ........................37 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). ......................................39 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ....................................................41 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ) ........44 Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ............................47 Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P.micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) .......................49 Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) .......................51
iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum micranthum tại nhà lưới khoa CNSH-CNTP ...........................................................................................11 Hình 2.2. Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật ...... Error! Bookmark not defined. Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ của cây lan Hài P.micranthum...........................................................................................28 Hình 4.1. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) .......................36 Hình 4.2. Một số hình ảnh tạo vật liệu vô trùng. ......................................................37 Hình 4.3. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum ......38 Hình 4.4. Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) ..............................39 Hình 4.5. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). ..........40 Hình 4.6. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). ......................................41 Hình 4.7. Biêu đồ ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ........................................................42 Hình 4.8. Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ). .............................43 Hình 4.9. Biểu đồ ảnh hưởng của BA tốt nhất kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ............45 Hình 4.10. Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy )...................46 Hình 4.11. Biểu đồ ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum(sau 20 ngày nuôi cấy ) .......................................47
iv Hình 4.12. Hình ảnh ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) .......................................48 Hình 4.13. Biểu đồ ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) .......................................50 Hình 4.14. Hình ảnh ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) ......................................51 Hình 4.15. Biểu đồ ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum(sau 40 ngày nuôi cấy ) .......................................52 Hình 4.16. Hình ảnh ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) ......................................53
v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT B5 : Gamborg cs, 1976 BAP : 6-Benzyl amino purine CS : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation – Hệ số biến động Đ/C : Đối chứng LSD : Least Singnificant DifferenceTest MS : Murashighe và Skoog, 1962 MT : Môi trường GA3 : Gibberellic acid NAA : α-Napthalene acetic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế P. micranthum : Paphiopedilum micranthum P. malipoens : Paphiopedilum malipones WPM : Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980
vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. ii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................v MỤC LỤC ..................................................................................................................vi Phần 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................2 1.3. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................3 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................3 1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ..............................................................................3 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................4 2.1. Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum) ................................................................4 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc .....................................................................................4 2.1.2. Đặc điểm hình thái ...........................................................................................5 2.1.3. Sinh thái ............................................................................................................6 2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam ......................................................................7 2.2. Tổng quan về lan Hài P. micranthum ................................................................10 2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố lan Hài P. micranthum ở Việt Nam ......................10 2.2.2. Hình thái ..........................................................................................................10 2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hài P. micranthum ..................11 2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính lan Hài Mốc Hồng ..............................12 2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật .......... Error! Bookmark not defined. 2.3.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật........... Error! Bookmark not defined. 2.3.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.............. Error! Bookmark not defined. 2.3.3. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................13
vii 2.3.4. Môi trường dinh dưỡng ...................................................................................14 2.3.5. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào ...........................................................18 2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước .......19 2.4.1. Trên thế giới ....................................................................................................19 2.4.2. Trong nước ......................................................................................................21 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......25 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ............................................................25 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu ........................................................................25 3.1.2. Hoá chất sử dụng .............................................................................................25 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu...........................................................................25 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................26 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................26 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................26 3.2.3. Thời gian nghiên cứu ......................................................................................26 3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................26 3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian cuả dung dịch khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. .......................................................26 3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum..................................................................26 3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân mang mầm ngủ. .........................................................................................................26 3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P. micranthum. ..............................................................................................................27 3.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................27 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro ............................................................27 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống ..............................................28 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................................28 3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu ..............................................................33
viii 3.5.1. Thu thập số liệu ...............................................................................................33 3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu ...............................................................................34 Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................35 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng .................................................................35 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum ............................................37 4.3. Kết qủa nghiên cứu của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân mang mầm ngủ ....................................................................................................................39 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng cuả NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum ....................................................................................................39 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum ...........................................................................................................41 4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum ..........................................................................43 4.3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum .............................................................................................46 4.4 .Kết quả nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ ...........................................................................................48 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum. .............................................................................49 4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P.micranthum ...............................................................................51 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................54 5.1. Kết luận ..............................................................................................................54 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
ix
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Việt Nam là một trong các quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất trên thế giới, được công nhận là một quốc gia ưu tiên cao cho bảo tồn toàn cầu. Hệ sinh thái của Việt Nam giàu có và đa dạng với nhiều kiểu rừng, nhiều loài động, thực vật độc đáo không có ở nơi nào trên thế giới [14]. Phong lan mọc khắp nơi trên thế giới tuy nhiên tập trung những loài phong lan đẹp nhất phải kể đến hai khu vực là Châu Mỹ và Châu Á nhiệt đới. Việt Nam nằm trong khu vực châu Á nhiệt đới - nơi phát sinh một trong nhiều loài phong lan đẹp. Theo đánh giá của giáo sư Averyanov, Việt Nam có 158 chi và khoảng 900 loài. Theo tác giả Trần Duy Quý và cs đã thống kê và phát hiện, ở Việt Nam có 160 chi và 1004 loài lan. Đây là quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật và đặc biệt là họ Lan phong phú bậc nhất trong khu vực Châu Á. Trong các loài phong lan Việt Nam phải kể đến lan hài, lan hài Việt Nam không chỉ đẹp -phong phú mà đặc hữu hẹp chỉ có ở Việt Nam. Theo Tác giả Trần Duy Quý không có nơi nào mà sự đa dạng của các loài lan hài lại cao hơn ở Việt Nam.. Có thể thấy 22 loài lan hài thuộc chi Paphiopedilum cùng với vô số các dạng lai tự nhiên của chúng đã tạo lên sự đa dạng cho các loài lan hài Việt Nam. Các loài lan hài Việt Nam đa dạng về màu sắc và kiểu dáng không chỉ thu hút người chơi lan trong nước mà còn hấp dẫn khách chơi lan ngoại quốc do vậy những người đi săn lan hài sẵn sàng trèo lên những vỉa đá dốc ở những vùng xa xôi hẻo lánh để khai thác. Việc thu hái như vậy đã gây nên những tác động tàn phá thiên nhiên nghiêm trọng. Điều này đã đẩy các loài lan hài của Việt Nam rơi vào nguy cơ tuyệt chủng, hoặc mức độ cực kỳ nguy cấp [18]. Hài Mốc Hồng hay Hài ngọc nữ (Paphiopedilum micranthum) là một trông số loài lan có hoa to, màu sắc sặc sỡ, kiểu dáng đặc biệt với hình dáng của cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống như một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa và môi là điều hấp dẫn nhất đối với những người trồng và lai tạo Lan Hài. Hoa thường nở vào dịp tết. Vùng phân bố của loài hẹp hiện chỉ tìm thấy ở miền Bắc Việt Nam (tập trung tại các tỉnh Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Thái Nguyên) và vùng Quảng Tây,
2 Quý Châu, Vân Nam (Trung Quốc). Là loài Hài rất quý mới được phát hiện và được ưa chuộng ở thị trường trong và ngoài nước [30]. Giống như thực trạng các loài lan Hài khác loài lan Hài P.micranthum cũng bị khai thác ồ ạt, cộng với phá nương rẫy khiến chngs mất nơi sinh sống vì vậy lan Hài Mốc Hồng cũng bị đe dọa tiêu diệt và đang biến mất nhanh chóng khỏi nơi sống tự nhiên của chúng. Trước thực trạng bị đe doạ nghiêm trọng như vậy việc bảo tồn, phát triển loài lan này hết sức cần thiết. Đặc thù riêng của lan Hài P. micranthum là cây sinh trưởng chậm, tỷ lệ nảy mầm của hạt trong tự nhiên thấp người dân khai thác ồ ạt đã đẩy lan Hài Mốc Hồng có nguy cơ rơi vào danh mục các loài nguy cấp cần phải bảo tồn. Vì vậy việc nghiên cứu nhân giống lan Hài rất được chú trọng nhằm mục đích thương mại và bảo tồn nguồn gen thực vật quý hiếm. Trước đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nhân giống các loài lan Hài bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như chất lượng cây không đồng đều, chất lượng cây thấp và số lượng cây ít…Để khắc phục được điều này, phương pháp nhân giống in vitro đã ra đời nhằm khắc phục những hạn chế trên. Phương pháp này cho số lượng cây lớn, chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh. Đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được. Hiện nay, nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đang phát triển mạnh mẽ có thể tạo ra số lượng cây con lớn, sạch bệnh, ổn định về mặt di truyền trong một thời gian ngắn và đáp ứng được giá cả phải chẳng của thị trường được coi là một giải pháp lý tưởng để bảo tồn loài lan Hài khỏi nguy cơ bị tuyệt chủng. Trước thực trạng đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro ”. 1.2. Mục đích nghiên cứu Nhân giống thành công chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro.
3 1.3. Yêu cầu của đề tài - Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch HgCl2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng. - Xác định ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum. - Xác định môi trường nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum tái sinh từ mầm ngủ. - Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P. micranthum. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn. - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này. - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học mới về nhân giống cây lan Hài P. micranthum bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan Hài P. micranthum bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tạo ra số lượng lớn cây lan Hài P. micranthum góp phần bảo tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học.
4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum) 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 2.1.1.1. Phân loại Lan Hài (Paphiopedium) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), nghành hạt kín (Angiospermatophyta). Lan Hài là một nhóm rất đặc trưng trong họ lan. Chúng dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa đặc biệt khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống như một chiếc Hài, nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ ngoài đặc sắc có thể dễ dàng phân biệt với các loại lan khác. Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, phân bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc. - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ. - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon. Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông, Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [1]. 2.1.1.2. Nguồn gốc Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất hạn chế. Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong gọi
5 là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong). Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan. Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa [1], [19]. 2.1.2. Đặc điểm hình thái Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn [1]. - Lá: Thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá. Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1]. - Cụm hoa: Thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều có cuống hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, xong rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn. - Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp
6 hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài [1]. Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài. Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ. Hai nhị đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này. Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn [1]. - Quả: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp. Quả mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1]. - Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn dạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm. Hạt không có nội nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1]. 2.1.3. Sinh thái Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độ cao từ 700- 2200m. Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe nứt hay rìa của các vách núi dựng đứng đá granit. Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Các loài sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn núi dốc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn. Các loài lan Hài mọc trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám trên vỏ
7 cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m. Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độ cao. Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự hình thành và phát triển của quần thể lan Hài. Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn núi. Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ở các sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi. Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi con người,sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam [1]. 2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới cũng như trong nước đang ngày càng gia tăng. Vì vậy, việc trồng lan đã trở thành một ngành kinh tế của nhiều nước trên thế giới và nhiều nước đang phát triển khu vực Đông Nam Á. Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưu tầm, tìm kiếm nhiều nhất thế giới. Với sự hiện hữu của hơn 22 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất. Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng [5]. Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên. Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng [6]. Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt chủng của tổ chức
8 bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] Tình trạng Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (tiếng Việt) Đã bị tuyệt chủng P. vietnamense Hài Việt ngoài thiên nhiên Đang bị tuyệt p. delenatii Hài Đỏ chủng trầm trọng P.  aspersum Chưa rõ tên gọi P. barbigerum var. lokianum Hài Lộc P. callosum Hài Vân P. dianthum Hài Xoắn P. emersonii Hài Hương Lan P. gratrixianum Hài Đuôi công P. hangiannum Hài Hằng Đang bị tuyệt P. helenae Hài hê len chủng P. henryanum Hài Henry P.  herrmannii Hài Herman P. malipoense var. jackii Hài Jack P. malipoense Hài Giáp P. micranthum Hài Mốc Hồng P. purpuratum Hài Tía P. tralienianum Hài Trần liên P. appletonianum Hài Cánh Sen P. concolor Hài Gia Định Sắp bị tuyệt chủng P. hirsutissimum var. chiwuawnum Hài Tiên biến dị P. hirsutissimum var. esquirolai Hài Tiên P. villosun var. annamense Hài Lông P.  affine Hài Hoà Thiếu dẫn liệu P.  datalanse Chưa rõ tên gọi P. villosum var. boxalli Chưa rõ tên gọi Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài Việt Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần đây do sự suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây, qua các đợt điều tra thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện rộng của những khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi đá vôi [17], [18], [19]. Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng số lượng
9 các loài lan Hài. Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam. Các loài lan Hài rất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều hơn và sẽ biến mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái. Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam trong những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địa phương để bán và xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên ra nước ngoài. Do không có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các loài thực vật hoang dã với sự giàu có nổi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam đã khuyến khích việc thu thập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên toàn bộ lãnh thổ [1]. Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp và hiệu quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong tương lai gần. Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn các loài hiếm và đặc hữu. Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng. Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1]. Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam. Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắk Lắk), Núi Bà (Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum. - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn loài P. callosum. - Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P. dalatensis. - Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P. micranthum.