Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:50

Thêm vào BST

Báo xấu

46
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận tốt nghiệp đại học này được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen; nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens; nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen; nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen; xây dựng quy trình chuyển gene tối ưu cho giống lúa Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HOA Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG LÚA J02 VÀ BẮC THƠM SỐ 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K48 CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2016 - 2020 Người hướng dẫn : 1. TS. Bùi Tri Thức 2. TS. Nguyễn Tiến Dũng THÁI NGUYÊN – NĂM 2020
i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và BắcThơm số 7”. Trước hết em xin gửi tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa lời chúc sức khỏe và lời cảm ơn sâu sắc, với sự chỉ bảo, quan tâm và đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS. Bùi Tri Thức, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã chỉ bảo, quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn em hoàn thành tốt trong quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời, em xin cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Tiến Dũng, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ và đồng hành với tôi trong suốt thời gian qua. Trong quá trình thực tập, cũng như làm báo cáo thực tập với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế không thể tránh được những sai sót. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để em có điều kiện bổ sung, nâng cao ý thức của mình để đề tài được hoàn thiện hơn và phục vụ tốt hơn công tác thực tế sau này. Sau cùng, em xin kính chúc quý thầy, cô trong nhà trường, trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nhệ Thực phẩm dồi dào sức khỏe, tiếp tục sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ sau. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày… tháng ….năm 2020 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Hoa
ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................. i MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ...................................................... v DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH..................................................................................................... vii Phần 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề.................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát ................................................................................... 2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể ......................................................................................... 3 1.3 Ý nghĩa khoa học ........................................................................................ 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 4 2.1 Giới thiệu về cây lúa ................................................................................... 4 2.1.1 Vai trò của lúa gạo ................................................................................... 4 2.1.2 Giá trị kinh tế và chất lượng dinh dưỡng của cây lúa .............................. 5 2.1.3 Cây trồng biến đổi gen ............................................................................. 7 2.1.4 Các phương pháp - kỹ thuật biến đổi gen (chuyển gen) cây trồng .......... 8 2.1.5 Chỉ thị chọn lọc trong chuyển gen vào thực vật .................................... 13 2.2 Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới ...................................... 14 2.2.1 Tình hình trong nước.............................................................................. 14 2.2.2 Tình hình thế giới ................................................................................... 18 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 23 3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu .......................................... 23 3.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 24
iii 3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm............................................................... 24 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn Agrobacterium................................................................................................. 25 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen....................................................................................................... 26 3.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy ........ 26 3.3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc .......... 27 3.3.6. Phương pháp nhuộm GUS................................................................................. 28 3.3.7. Hoàn thiện quy trình chuyển gen ...................................................................... 28 3.4 Các phương pháp xử lý số liệu.................................................................. 28 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 29 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chủng khuẩn Agrobacterium............ 29 4.1.1 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2 ... 29 4.1.2 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Bắc Thơm .................................................................................................................... 30 4.2. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen ................ 31 4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2 ........................................................................................................................................ 31 4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Bắc thơm 7 ............................................................................................................................ 32 4.3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy hiệu quả chuyển gen ................ 33 4.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống J02 .................................................................................................................................. 33 4.3.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống Bắc Thơm số 7 .............................................................................................................. 34 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen............ 35
iv 4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa J02 .................................................................................................................................. 35 4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen đến giống lúa Bắc Thơm số 7. ............................................................................................................. 36 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 38 5.1 Kết luận ..................................................................................................... 38 5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 39 PHẦN PHỤ LỤC
v DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ viết tắt (cả tiếng Anh và tiếng Việt) CRISPER/Cas Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat GMO Genetically Modified Organisms NST Nhiễm sắc thể CT Công thức GM Genetically Modified 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu .......................................................... 23 Bảng 4.1. Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống J02. .................................................................................................. 29 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Bắc thơm 7 ...................................................................................... 30 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2 .................................................................................. 31 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống Bắc Thơm số 7. ..................................................................... 32 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian đồng lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa J02 ............................................................................ 33 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa Bắc Thơm số 7 ......................................................... 34 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa J02 ................................................................................... 35 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen đến giống lúa Bắc Thơm số 7. ............................................................... 36
vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gene cần chuyển (T-DNA). Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực vật tiết ra hợp chất bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand và một số protein vir chuyển vaoftees bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực vật, các protein vir tương tác với T-trand tạo ra phức hệ (T-complex). Phức hệ này vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm. ...................................................................................12 Hình 2.2: Sản lượng lúa gạo của Việt Nam từ năm 2013-2018 ................................15 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen ở lúa [6] ........................................................24
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Để đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng tăng và hạn chế các tác nhân làm giảm năng suất và chất lượng lúa gạo, hiện nay xu hướng sử dụng các giống lúa biến đổi gen đang được các nhà nghiên cứu khoa học đặc biệt quan tâm. Một số các nhà nghiên cứu cũng đã thành công trong tạo giống lúa biến đổi gen như: Daisuke Tokuhara và cộng sự đã tạo ra giống lúa chuyển gen MucoRice-ARP1có khả năng cung cấp kháng thể chống Rotavirus [7]; nhóm nghiên cứu tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã chuyển gen thành công vào giống lúa IR64 [13]; Phan Tố Phượng và cộng sự đã thành công trong việc chuyển gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vào cây lúa thông qua A.tumerfaciens [17]. Trên thực tế hiệu quả chuyển gen ở lúa còn gặp nhiều hạn chế: tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ nhân nhanh và hiệu quả tái sinh còn thấp, còn phụ thuộc khả năng xâm nhiễm của A.tumerfaciens dẫn tới hiệu quả biến nạp gen còn thấp (chỉ khoảng 11%). Ngoài ra, các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa trên các phương pháp lai tạo, chọn giống truyền thống nên hiệu quả đạt được không thực sự cao. Hơn thế nữa, giống lúa Việt Nam còn có những hạn chế như: chịu hạn kém, hạt ngắn đem lại năng suất và chất lượng kém. Sử dụng một số phương pháp tạo giống mới như: Chỉnh sửa vector, dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến, lai tạo chọn giống truyền thống,… còn tồn đọng một số hạn chế nhất định. Một số ứng dụng mới trong chọn giống cây trồng nhờ dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến... tuy đã đạt được một số kết quả nhất định nhưng vẫn có những hạn chế. Thách thức đặt ra không riêng gì Việt Nam mà là vấn đề chung của các quốc gia trên toàn thế giới, đặc biệt là các nước nông nghiệp là phải tạo ra nguồn lương thực lớn mà chỉ sản xuất và canh tác trên một diện tích không thay đổi và có nguy cơ bị thu hẹp. Phương pháp chuyển gen ra đời được ví như “chìa khóa đa năng” để mở những nút thắt vốn gây rất nhiều khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm
2 tạo ra một giống cây trồng “hoàn hảo” hơn khi chúng được kết hợp với nhau. Với hướng nghiên cứu này, các gen quy định những tính trạng quan tâm được chủ động chuyển vào lúa, từ đó tạo ra các giống lúa mang các đặc tính như mong muốn của con người. Vì vậy phương pháp chuẩn gen bằng vi khuẩn Agrobacterium bằng nuôi cấy phôi non biến nạp gen vào lúa đang được nghiên cứu giải pháp mới trong chọn tạo các giống lúa. Giải pháp sử dụng các kĩ thuật chuyển gen để cải tạo giống lúa mới có chứa hàm lượng các vi chất dinh dưỡng cao hơn, hạt dài hơn, năng suất và hiệu quả cao. Hơn thế nữa, quy trình chuyển gen vào giống lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium có những ưu điểm như: gen ít bị đào thải; số lượng bản sao ít hơn do đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau; tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do sự phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thống protein Vir, còn ở những phương pháp khác gen mục tiêu được tái tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu nhưng dễ dàng bị tách ra ngay sau đó. Tuy nhiên vẫn còn một số những hạn chế như: có phổ tấn công giới hạn; gây khối u cho cây hai lá mầm ( do cây một lá mầm là cây thuộc nhóm tiến hóa nhất, nó tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn cây hai lá mầm như khi bị thương các tế bào có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá mầm…) [10]. Do vậy, tôi tiếp tục nghiên cứu về quy trình chuyển gen vào giống lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Với mục tiêu góp phần trong nghiên cứu tạo giống lúa có kích thước hạt dài, đáp ứng nhu cầu thị trường gạo thế giới, tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7”. 1.2 Mục tiêu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
3 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen - Nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen. - Xây dựng quy trình chuyển gene tối ưu cho giống lúa Việt Nam. 1.3 Ý nghĩa khoa học - Xây dựng và hoàn thiện được quy trình nghiên cứu chuyển gen của hai giống lúa Việt Nam là J02 và Bắc Thơm số 7. - Giúp sinh viên tiếp cận với nghiên cứu khoa học, ứng dụng lý thuyết vào thực tiễn, nâng cao năng lực nghiên cứu và kỹ năng thực hành trong phòng thí nghiệm - Giúp sinh viên tiếp cận với nghiên cứu khoa học, ứng dụng lý thuyết vào thực tiễn, nâng cao năng lực nghiên cứu và kỹ năng thực hành trong phòng thí nghiệm. - Đề tài hoàn thiện quy trình chuyển gene trên hai giống lúa J02 và Bắc thơm số 7 góp phần tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về chuyển gene vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7 Việt Nam, phục vụ công tác cải tạo năng xuất, chất lượng giống lúa Việt Nam.
4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây lúa 2.1.1 Vai trò của lúa gạo Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu nuôi sống hàng tỷ người trên thế giới. Sản lượng lúa gia tăng trong thời gian qua đã mang lại sự an sinh cho con nguời, đặc biệt đối với dân nghèo: gạo là nguồn cung cấp thức ăn chủ yếu. Các nước nghèo thường dùng gạo là nguồn lương thực chính, khi thu nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu hướng giảm xuống, thay thế bằng các loại thức ăn cung cấp nhiều protein và vitamin hơn là năng lượng. Bangladesh và Thái Lan có mức tiêu thụ gạo cao nhất vào những năm 1960 (tương đương 180 kg/người/năm), đến năm 1988 giảm xuống còn khoảng 150 kg. Ở Việt Nam hiện nay mức tiêu thụ gạo bình quân vẫn còn ở mức cao, khoảng 120 kg/người/năm. Tuy nhiên có thể nói, trên khắp thế giới, ở đâu cũng có dùng đến lúa gạo hoặc các sản phẩm từ lúa gạo. Khoảng 40% dân số trên thế giới lấy lúa gạo làm nguồn lương thực chính. Trên thế giới có hơn 110 quốc gia có sản xuất và tiêu thụ gạo với các mức độ khác nhau. Lượng lúa được sản xuất ra và mức tiêu thụ gạo cao tập trung ở khu vực Châu Á. Năm 1980, chỉ riêng ở Châu Á đã có hơn 1,5 tỷ dân sống nhờ lúa gạo, chiếm trên 2/3 dân số Châu Á. Con số này theo ước đoán đã tăng lên gần gấp đôi [6]. Như vậy bên cạnh sự thu hút về nguồn lực con người thì sự thu hút nguồn lực đất đai cũng lại khẳng định rõ vị trí của lúa gạo trong nền kinh tế quốc dân. Trong những năm gần đây, Việt Nam có tổng sản lượng lúa hàng năm đứng thứ 5 trên thế giới, nhưng lại là nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 thế giới hiện nay với sản lượng gạo xuất khẩu bình quân trên dưới 4 triệu tấn/năm. Thái Lan luôn là nước xuất khẩu gạo dẫn đầu thế giới, hơn hẳn Việt Nam (thứ 2) cả về số lượng và giá trị, do có thị trường truyền thống rộng hơn và chất lượng gạo cao hơn. Mỹ, Ấn Độ, Pakistan cũng là những nước xuất khẩu gạo quan trọng, sau Việt Nam.
5 2.1.2 Giá trị kinh tế và chất lượng dinh dưỡng của cây lúa Giá trị kinh tế Trên thế giới cơ cấu sản xuất lương thực, lúa gạo chiếm 26,5%. Sản lượng lúa đã vượt lên đứng thứ nhất trong các cây lương thực với tổng sản lượng là 650 triệu tấn/năm. Mặc dù diện tích trồng lúa gạo đứng sau lúa mì nhưng sản lượng lúa năm 1993 đã đứng vị trí thứ nhất với tổng sản lượng là 573 triệu tấn/năm. Đặc biệt trong những năm gần đây với sự phát triển của khoa học kỹ thuật trong công tác chọn tạo giống và canh tác, phân bón thì năng xuất và chất lượng lúa gạo không ngừng tăng lên [7]. Trên thế giới khoảng 40% dân số coi lúa gạo là cây lương thực chính, tới 25% dân số sử dụng lúa gạo trên 1/3 khẩu phần ăn hàng ngày. Ở Việt Nam 100% dân số sử dụng gạo làm lương thực chính. Trong lúa gạo chứa đầy đủ các thành phần dinh dưỡng như tinh bột (62,5%), protein (7-10%), lipit (1-3%), xenlulo (10,9%), nước 11%...[22]. Ngoài ra gạo còn chứa một số chất khoáng và vitamin nhóm B, các axit amin thiết yếu như: lizin, triptophan, threonin... chất lượng gạo thay đổi theo thành phần axit amin, điều này phụ thuộc vào từng giống. Do thành phần các chất dinh dưỡng tương đối ổn định và cân đối nên lúa gạo đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Chất lượng dinh dưỡng của lúa Theo Yoshida (1981) [12], tinh bột là thành phần chủ yếu chiếm trên 80% trong hạt gạo, nó được hình thành từ hai đại phân tử là amylose và amylopectin. Hàm lượng amylose có thể được coi là tính trạng quan trọng nhất trong phẩm chất cơm vì nó có tính chất quyết định tới việc cơm dẻo, mềm hay cứng. Hàm lượng amylose càng thấp thì cơm càng mềm. Hàm lượng tinh bột trong hạt gạo thường có mối tương quan nghịch với hàm lượng đạm. Nếu hàm lượng đạm trong hạt tăng thì hàm lượng tinh bột trong hạt gạo thường giảm. Liều lượng phân bón thích hợp không những làm giảm hàm lượng đạm mà còn làm tăng hàm lượng tinh bột. Theo IRRI (2013), hàm lượng amylose khác nhau ở các giống lúa, hàm lượng này càng thấp thì cơm càng mềm dẻo. Các giống lúa nếp thường có hàm lượng
6 amylose nhỏ hơn 2%, các giống lúa tẻ thường có hàm lượng amylose cao hơn. Các giống lúa thuộc nhóm Japonica có hàm lượng amylose thấp hơn các giống thuộc nhóm Indica. Hàm lượng amylose cũng tham gia quyết định tới độ bạc của hạt gạo. Những giống có hàm lượng amylopectin cao thường có cấu trúc phân tử khá lỏng lẻo vì thế đã tạo ra rất nhiều lỗ nhỏ trên bề mặt tinh bột và kết quả là toàn bộ nội nhũ có màu trắng đục, do đó hàm lượng amylose tỷ lệ nghịch với độ bạc của hạt gạo. Vì vậy, hướng nghiên cứu trong thời gian tới là phải dung hòa được cả hai yếu tố tỷ lệ trắng trong và độ dẻo [4]. Japonica, nhiệt độ tăng vào thời gian này làm giảm hàm lượng amylose trong hạt gạo. Hàm lượng amylose cũng biến động trong cùng một giống lúa; Tuy nhiên, mức biến động thường chỉ dưới 2%. Các chân đất khác nhau cũng tạo ra sự biến động hàm lượng amylose trên cùng một giống lúa, lúa trồng ở vùng đất phèn thường có hàm lượng amylose cao hơn các vùng đất khác. Ngoài ra, lúa trồng ở vụ Mùa cũng cho hàm lượng amylose cao hơn vụ Xuân. Nhìn chung, sự biến động hàm lượng amylose của một số giống lúa dưới tác động của môi trường chỉ dao động trong khoảng 6%. Amylose có cấu tạo mạch thẳng không phân nhánh tạo thành từ 300 - 1000 gốc glucose nhờ vào liên kết α-(1-4) glucose. Amylose phân bố bên trong hạt tinh bột nên tan trong nước nóng, nhưng độ nhớt không cao, dễ lắng cặn, gây phản ứng tủa với butanol và pentanol, bị nhiệt hóa hồ. Ở lúa, amylose có trọng lượng phân tử là 100-200 kDa, chuỗi amylose tạo thành có dạng xoắn lò xo với 6 gốc glucose trên một vòng, mỗi vòng xoắn hấp thụ một phân tử iodine vào bên trong tạo thành dung dịch màu xanh, khi đun nóng thì iodine tách ra làm mất màu xanh. Người ta đã dựa vào đặc tính này để xác định hàm lượng amylose có trong tinh bột. Mặc dù hàm lượng protein trong gạo chỉ dao động khoảng 7%, nhưng protein trong lúa gạo vẫn được coi là protein có phẩm chất cao, do nó có hàm lượng lysine cao. Với các nước coi lúa gạo là thức ăn chính thì hàm lượng protein cao trong lúa gạo là nguồn bổ sung protein cực kỳ quan trọng [13]. Theo Vũ Tiên Hoàng và cs (1988) [9], hàm lượng protein không giống nhau ở các giống lúa. Thông thường, các giống lúa nếp có hàm lượng protein cao hơn các
7 giống lúa tẻ. Trong thời gian qua, các nhà chọn tạo giống trên Thế giới và Việt Nam đã có nhiều thành công trong việc chọn tạo ra giống lúa có hàm lượng protein cao. Gần đây nhất, các nhà chọn tạo giống của Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã tạo ra các giống lúa P4, P6… có hàm lượng protein trên 10%. Hàm lượng protein là tính trạng có cơ chế di truyền rất phức tạp và chịu tác động mạnh mẽ của môi trường. Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ không khí và nhiệt độ nước trong ruộng đến hàm lượng protein. Nguyễn Trọng Khanh (2016) [10] đã kết luận: nhiệt độ không khí hoặc nhiệt độ nước trong ruộng cao sau khi lúa trỗ sẽ làm tăng hàm lượng protein và tỷ lệ hạt chắc. Qua đó làm tăng năng suất hạt và năng suất protein trên một đơn vị diện tích. Bên cạnh đó, hàm lượng protein cũng có quan hệ chặt chẽ với lượng phân bón đặc biệt là phân đạm. Phân đạm có tác dụng tăng cường quá trình tổng hợp protein mà không thay đổi đặc tính, phẩm chất của giống. 2.1.3 Cây trồng biến đổi gen Một loài cây điển hình có từ 20.000 đến 40.000 gen. Các gen này chứa thông tin chuyên biệt và cần thiết để cây hình thành lá, rể, hoa và hạt; nẩy mầm và sinh trưởng; tiến hành quá trình quang hợp và hô hấp; sản sinh ra các loại hợp chất dự trữ và hợp chất giúp cây chống chọi lại bệnh hại và sâu bọ; và giúp cây thích nghi với các điều kiện môi trường như nóng, lạnh hoặc khô hạn [4]. Toàn bộ thông tin chứa trong DNA của cây lúa, nếu được thể hiện đầy đủ các nucleotide (ATGC) sẽ có độ dài của khoảng 40.000 trang giấy. Mỗi gen trung bình ít hơn một trang. Từ xa xưa, việc gen cây trồng được “chuyển đổi”, “biến đổi” đã xảy ra trong tự nhiên thông qua các hình thức như chọn lọc tự nhiên; thuần hóa cây trồng, lai tạo giống, ghép cây ... Sinh học hiện đại gần đây đã bổ sung phương thức “biến đổi gen” một cách chủ động bằng các kỹ thuật sinh học có kiểm soát. Cây trồng chuyển gen (Genetically Modified Crop - GMC) là một trong các loại sinh vật biến đổi gen. Cũng như sinh vật biến đổi gen, cây chuyển gen là một thực vật
8 mang một hoặc nhiều gen “lạ” được đưa vào bằng công nghệ hiện đại. Những gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn với vật chủ [4]. 2.1.4 Các phương pháp - kỹ thuật biến đổi gen (chuyển gen) cây trồng Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một thực vật những gen mong muốn từ những sinh vật sống khác nhau, không chỉ giữa các loài cây lương thực hay những loài có họ gần. Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. Chuyển gen cụ thể trên từng đối tượng sinh vật có phương pháp kỹ thuật đặc trưng, gọi chung là kỹ thuật di truyền. 2.1.4.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp - Kỹ thuật siêu âm - Kỹ thuật điện xung - Kỹ thuật PEG - Kỹ thuật vi tiêm - Kỹ thuật bắn gen - Kỹ thuật chuyển gen bằng sốc nhiệt 2.1.4.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp a) Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium - Vi khuẩn Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes là hai loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. A. tumefaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây. Khi cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện bệnh rõ nhất là các khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm. Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được do A. tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh [11].
9 - Plasmid Trong thế giới động-thực vật đều tồn tại các thể plasmid, đó là các vòng DNA tự sinh sản độc lập. Ở vi khuẩn và động-thực vật, plasmid liên quan tới yếu tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh... Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập. Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng vào công nghệ gen thực vật ở hai dạng vector cis và trans. Đây là hai dạng vector rất thuận lợi để tái tổ hợp gen ngoại lai và chuyển vào tế bào thực vật. Dạng cis chỉ sử dụng Ti-plasmid và tế bào vật chủ là Agrobacterium tumefaciens mà không có sự tham gia của plasmid và vi khuẩn khác. Vùng T-DNA của Ti-plasmid được thiết kế lại để gắn những gen ngoại lai mong muốn, các phần còn lại của Ti-plasmid vẫn được giữ nguyên. Agrobacterium tumefaciens được dùng làm tế bào vật chủ để nhân lên nhiều bản sao của Ti-plasmid và chuyển gen. Dạng trans hay binary là dạng sử dụng hai hay nhiều loại plasmid và vi khuẩn cùng lúc, ví dụ: vi khuẩn E. coli và Agrobacterium, plasmid trong trường hợp này thích ứng với cả E. coli và Agrobacterium. Trước tiên, plasmid của E. coli chứa đoạn T-DNA được giới hạn bởi bờ phải (right border-RB) và bờ trái (left border-LB) mang gen ngoại lai được thiết kế và nhân lên trong vi khuẩn E. coli. Tiếp đến plasmid mang gen ngoại lai được chuyển nạp vào vi khuẩn Agrobacterium nhờ một helper plasmid (quá trình triparental matting). Vi khuẩn Agrobacterium đã mang sẵn một loại plasmid khác chứa vùng vir (virulence region) có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gen ngoại lai. Sự tồn tại song song hai plasmid này đã tương tác lẫn nhau trong việc chuyển gen vào tế bào thực vật. Như vậy, gen ngoại lai và vùng DNA giúp quá trình chuyển gen (vùng vir) không nằm trên cùng một plasmid nên hệ chuyển gen này được gọi là hệ trans [11]. - Vùng T-DNA Vùng T-DNA được nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn DNA có kích thước 25 kb trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u (oncogenes). Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng RB
10 và LB. Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có các vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism) [9]. Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2, virC1... Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn [8]. Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn”. Nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid. Cơ chế lây nhiễm của A. rhizogenes đối với cây hai lá mầm cũng tương tự, nhưng trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gen sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh [8]. Trên thực tế bệnh cây, Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy người ta cho rằng chúng chỉ có thể đưa T-DNA vào hệ gen các cây hai lá mầm. Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây một lá mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng biến nạp gen của Agrobacterium vào cây một lá mầm. - Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào và mô thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A. tumefaciens) hoặc rễ tơ (trường hợp A. rhizogenes). Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn.
11 Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hoá một protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA [8]. Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của cây chủ. Thực chất chỉ riêng T-DNA của Ti-plasmid được chuyển vào genome tế bào thực vật, mà không còn phần nào khác. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hoá nhờ tác động của các hợp chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE. Trước đó, khi gen virD được hoạt hoá, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid thành các sợi đơn [8]. Đồng thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm xuất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn. Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự
12 tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T- DNA đã được chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng xâm nhập vào genome tế bào thực vật (integration) được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác [8]. Hình 2.1: Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gene cần chuyển (T- DNA). Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực vật tiết ra hợp chất bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand và một số protein vir chuyển vaoftees bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực vật, các protein vir tương tác với T-trand tạo ra phức hệ (T-complex). Phức hệ này vào nhân tế bào thực vật, T- DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm. b) Chuyển gen nhờ virus và phage Kỹ thuật làm biến đổi gen cho cây trồng (chuyển gen) là một số trong các kỹ thuật di truyền trong sinh học, dùng để gắn một gen mới, quy định cho một đặc tính (tính trạng) có lợi (ví dụ như tính kháng bệnh hoặc sâu bọ). Kỹ thuật chính trong chuyển gen gồm có: DNA tái tổ hợp/Biến nạp; Gắn DNA thành các cấu trúc tái tổ hợp mới và đưa DNA vào một sinh vật mới.