Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc Neomycin Sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:40

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Neomycin sulfate của màng VLC lên men từ một số môi trường (môi trường chuẩn, môi trường"nước vo gạo, môi trường nước dừa"già), để nâng cao hiệu quả chữa các bệnh về da do nhiễm khuẩn ở người của thuốc neomycin sulfate. Tìm ra được loại vật liệu cellulose lên men từ ba loại môi trường thì môi trường nào hấp thu thuốc cao hơn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc Neomycin Sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN HOÀNG THỊ TRANG NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lí học người và động vật HÀ NỘI, 2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN HOÀNG THỊ TRANG NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lí học người và động vật Người hướng dẫn khoa học TS. Cao Bá Cường HÀ NỘI, 2019 HÀ NỘI, 2019
LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn TS. Cao Bá Cường, Trường Đại học“Sư phạm Hà Nội 2, người đã hướng dẫn, chỉ dạy và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khoá luận”này. Em“xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong Tổ bộ môn Sinh lý người”và động vật, Khoa Sinh – KTNN, và các thầy, cô trong Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện cho em trong việc thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Mặc dù đã cố gắng rất nhiều nhưng bài khóa luận tốt nghiệp này vẫn còn nhiều những hạn chế, sai sót. Vì vậy, em rất mong nhận được các ý kiến nhận xét từ thầy cô và các bạn để bài khoá luận của em hoàn thiện hơn. Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Hoàng Thị Trang
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Khoá luận “Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường” là nghiên cứu do cá nhân tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn của TS. Cao Bá Cường cùng các thầy, cô trong Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng. Các kết quả mà tôi trình bày trong khoá luận là trung thực, khách quan, không trùng lặp với các nghiên cứu trước đây. Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Hoàng Thị Trang
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài .....................................................................................................1 2. Mục đích nghiên cứu ...............................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.................................................................................2 NỘI DUNG ................................................................................................................3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. Vật liệu Cellulose vi khuẩn (VLC) ......................................................................3 1.1.1. Vi khuẩn sinh ra màng cellulose .......................................................................3 1.1.2. Một số môi trường nuôi cấy G. xylinus ............................................................3 1.1.3. Cấu trúc, một tính chất của màng Cellulose vi khuẩn ......................................5 1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn làm vật liệu nạp thuốc ..........................................................................................................................6 1.2.1.Trên thế giới .......................................................................................................6 1.2.2.Tại Việt Nam ......................................................................................................6 1.3.Tổng quan về thuốc Neomycin sulfate .................................................................7 1.3.1. Công thức ..........................................................................................................7 1.3.2. Tính chất lí hoá..................................................................................................7 1.3.3. Dược lý và dược động học ................................................................................7 1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định ...............................................................................8 1.4. Tình hình nghiên cứu Neomycin sulfate trên thế giới và Việt Nam ....................8 1.4.1.Trên thế giới .......................................................................................................8 1.4.2.Tại Việt Nam ......................................................................................................9 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU10 2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................10 2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu .........................................................10 2.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................10
2.3.1. Chủng vi khuẩn ...............................................................................................10 2.3.2. Nguyên liệu và hóa chất ..................................................................................10 2.3.3. Thiết bị và dụng cụ ..........................................................................................10 2.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................10 2.4.1. Phương pháp lên men thu màng cellulose vi khuẩn từ một số môi trường ....10 2.4.2. Phương pháp xử lý màng Cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc. ..........11 2.4.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của VLC ................................................12 2.4.4. Chế tạo VLC hấp thụ neomycin sulfate ..........................................................12 2.4.4.1. Chuẩn bị bộ đệm ..........................................................................................12 2.4.4.2. Phương pháp dựng đường chuẩn của Neomycin sulfate. ...........................12 2.4.5. Phương pháp xác định lượng thuốc Neomycin sulfate hấp thụ vào màng Cellulose vi khuẩn. ....................................................................................................13 2.4.6. Xử lý thống kê .................................................................................................14 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................15 3.1. Phương trình đường chuẩn của neomycin sulfate trong PBS (pH = 7,4) ..........15 3.2. Tạo VLC của Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường ..................16 3.3. Thu màng VLC thô từ môi trường .....................................................................16 3.4. Xử lý màng VLC thô trước khi hấp thụ thuốc ...................................................17 3.5. Kiểm tra độ tinh khiết của màng ........................................................................18 3.6. Tỷ lệ hấp thu Neomycin sulfate vào màng CVK trong 3 môi trường ...............18 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................24 1. Kết luận .................................................................................................................24 2. Kiến nghị ...............................................................................................................24 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................25 PHỤ LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Cs: Cộng sự MTC: Môi trường chuẩn G. xylinus Gluconacetobacter xylinus MTD: Môi trường dừa MTG: Môi trường gạo NS: Neomycin sulfate PBS: Phosphate bufered saline VLC: Vật liệu Cellulose
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc Cellulose vi khuẩn ........................................................................5 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Neomycin sulfate [1] ..............................................7 Hình 3.1. Phương trình đường chuẩn của neomycin sulfate trong môi trường PBS (pH = 7,4). .................................................................................................................15 Hình 3.2. VLC được nuôi cấy trong một số môi trường ...........................................16 Hình 3.3. VLC thô có độ dày khác nhau 0,3 cm, 0,5 cm ..........................................17 Hình 3.4. Màng Cellulose sau khi hấp trong NaOH và xả dưới vòi nước 1 ngày ....17 Hình 3.5. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của glucose ................................................18 Hình 3.6. VLC tinh khiết hình dạng viên thuốc (đường kính 1,5 cm) ......................18 Hình 3.7. VLC đang hấp thụ neomycin sulfate ở 400C ............................................19 Hình 3.8. Tỷ lệ hấp thụ thuốc NS của các loại VLC.................................................23
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cao nấm men [21] .........................................3 Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già [10] ..........................................4 Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo ..................................................4 Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo vật liệu Cellulose ...............................................11 Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS với pH = 7,4 ..........................................................12 Bảng 3.1. Bảng giá trị đo OD trung bình của dung dịch thuốc NS ở các nồng độ ...15 Bảng 3.2. Giá trị OD của dung dịch thuốc Neomycin Sulfate khi ngâm VLC (n=3) ở các môi trường...........................................................................................................20 Bảng 3.3. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng CVK tại thời điểm 2 giờ (n=3) ........21
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Ngày nay, vật liệu sinh học được sử dụng phổ biến“trong các sản phẩm chăm sóc sức khoẻ, vì có khả năng tái tạo, tính tương thích sinh học, phân huỷ sinh học của chúng.”Một trong những vật liệu sinh học có những đặc tính trên là vật liệu Cellulose vi khuẩn (VLC), đã được các nhà khoa học trong và nước ngoài nghiên cứu. Vật liệu cellulose là một loại vật liệu mới, đã được ứng dụng trong các lĩnh vực như y học, hoá mỹ phẩm, công nghệ thực phẩm,..."Theo nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy màng cellulose vi khuẩn được tạo ra từ các nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền như nước vo gạo, nước dừa già"có thể thực hiện được trên quy mô lớn so với các vật liệu Cellulose khác thì VLC được tạo ra từ vi khuẩn có độ tinh sạch cao hơn, có khả năng phân huỷ sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, màng cellulose vi khuẩn còn có độ bền tinh thể cao, khả năng đàn hồi tốt, khối lượng thấp và kích thước ổn định; VLC có cấu trúc mạng siêu mảnh cỡ nano nên nó có khả năng hút và giữ nước tốt,"có tính xốp, độ ẩm cao và giải phóng nước kéo"dài. Vì vậy VLC đã được dùng làm vật liệu hấp thụ và giải phóng thuốc qua nhiều con đường khác nhau như da, đường uống và ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học…[4], [6], [10]. Ngày nay khi"nền công nghiệp ngày càng phát"triển, dẫn đến môi trường ngày càng ô nhiễm thì các bệnh liên quan về da cũng xuất hiện ngày càng nhiều, như"các bệnh viêm da do dị ứng, viêm da do nhiễm"trùng, hay nhiễm trùng đường tiêu hoá. Để chữa các"bệnh này thì thường dùng các loại thuốc kháng sinh trong đó có neomycin"sulfate. Neomycin sulfate là loại thuốc"kháng sinh nhóm"aminoglycosid, có tác dụng với phần"lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây nên các bệnh nhiễm khuẩn ngoài"da. Chế phẩm của Neomycin sulfate như dưới dạng viên nén, dung dịch uống, dịch nhỏ mắt, nhỏ tai, mỡ tra mắt, mỡ và kem bôi ngoài da. Tuy nhiên, khi ở dạng chế phẩm thì khả năng thẩm thấu qua da của thuốc không cao chỉ đạt 45%, thuốc nhanh khô bề mặt; hay ở dạng dung dịch uống thì kém hấp thu qua đường tiêu hoá 97% liều uống được bài tiết ra ngoài dưới dạng không đổi [1]. Để tăng hiệu quả của Neomycin sulfate, làm giảm các nhược điểm của thuốc, khắc phục hạn chế của neomycin sulfate thì giải pháp cần đặt ra là"sử dụng vật liệu có khả năng giữ ẩm vết thương"và cản trở vi sinh vật gây nhiễm trùng vết thương,… Vật liệu Cellulose (VLC) có tiềm năng như"hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc"do cấu trúc siêu mảnh và kích thước nano của nó vì vậy hệ mạng lưới cấu trúc 1
CVK được nạp Neomycin sunlfate có thể tạo hệ trị liệu phóng thích kéo dài để giảm thiểu những tác dụng phụ không mong muốn từ thuốc Neomycin sunlfate. Từ những nghiên cứu về CVK, và đặc điểm của neomycin sulfate trong điều trị bệnh về da, tôi quyết định chọn đề tài “ Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc Neomycin Sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường ” 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Neomycin sulfate của màng VLC lên men từ một số môi trường ( môi trường chuẩn, môi trường"nước vo gạo, môi trường nước dừa"già), để nâng cao hiệu quả chữa các bệnh về da do nhiễm khuẩn ở người của thuốc neomycin sulfate. Tìm ra được loại vật liệu cellulose lên men từ ba loại môi trường thì môi trường nào hấp thu thuốc cao hơn. 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo màng và xử lý màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn (MTC), môi trường nước vo gạo (MTG), môi trường nước dừa già (MTD). - Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc của màng CVK thu từ một số môi trường. - Khảo sát so sánh sự hấp thụ thuốc neomycin sulfate của VLC thu từ 3 môi trường. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học Việc nghiên cứu và ứng dụng màng cellulose vi khuẩn để làm giảm tác dụng không mong muốn của thuốc neomycin sulfate sẽ mở ra hướng đi mới [5]. Việc hạn chế được nhược điểm của neomycin sẽ"mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới cho nhiều thuốc khác nhau, từ đó giúp nền y học phát triển"hơn. Từ quá"trình thực hiện nghiên cứu có thể phát hiện ra ưu và nhược điểm của VLC, từ đó sẽ tìm được cách phát huy những ưu điểm và hạn chế"được nhược điểm của màng Cellulose vi khuẩn. Tìm ra"được thời gian hấp thu thuốc Neomycin sulfate cao hơn trong ba"loại VLC. Ý nghĩa thực tiễn Khắc"phục những nhược điểm của Neomycin sulfate như hấp thu qua da kém, bề mặt khô"nhanh,… nhờ vào việc sử dụng VLC lên men từ một số môi trường nghiên cứu, được dùng làm vật liệu nạp thuốc Neomycin sulfate. Có thể áp dụng"kết quả nghiên cứu"vào thực tiễn. 2
NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vật liệu Cellulose vi khuẩn (VLC) 1.1.1. Vi khuẩn sinh ra màng cellulose VLC là sản phẩm thải của vi khuẩn có khả năng sinh màng thải ra trên bề mặt môi trường"nuôi"cấy"như"những"loài"thuộc"chi"Acetobacter,"Achromobacter, Gluconacetobarter, Rhizobium, trong đó có"chi Gluconacetobacter xylinus tạo cellulose hiệu quả nhất. Các giống vi khuẩn trong chi Acetobacter trước đây được dùng để lên men thu màng Cellulose vi khuẩn đều được chuyển sang chi Gluconacetobacter dựa trên nghiên cứu trình tự gen 16S rARN và đặc tính sinh màng của nó [6]. Giống vi khuẩn G. xylinus sử dụng được mua giống từ Nhật Bản. 1.1.2. Một số môi trường nuôi cấy G. xylinus Gluconacetobacter xylinus thuộc nhóm vi sinh vật khuyết dưỡng, để nuôi cấy được G. xylinus cần cung cấp các nhân tố sinh trưởng, các vitamin cho sự phát triển của chúng [7]. Môi trường nuôi cấy G. xylinus là các môi trường tổng hợp và bán tổng hợp như môi trường cao nấm men (MTC), môi trường nước dừa già và môi trường nước vo gạo. Các môi trường trên là những môi trường có đầy đủ chất hữu cơ cần thiết như cacbon hiđrat, protêin, lipit,…các chất vô cơ chứa các nguyên tố vi lượng như Zn, Mn, Fe, Cu, Mn, P, S,… các chất hữu cơ khác như axit amin, vitamin,… thích hợp cho nuôi cấy G.xylinus. Thành phần dinh dưỡng của 3 loại môi trường trên được trình bày ở Bảng 1.1, 1.2, 1.3. Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cao nấm men [21] Thành phần Hàm lượng trong 100 g Prôtêin 24 g Cacbohyđrat 20 g Vitamin B12 0,5 µg Các"nguyên tố vi lượng" Fe (4 mg), Mg (180 mg), Ca (67 mg), Kali (2,1 mg) Đường 1,6 g Thành phần dinh dưỡng có trong cao nấm men thích hợp cho sự nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus. Nhu “cầu sử dụng đường của G. xylinus là rất lớn giữ vai trò quan trọng trong quá trình tạo màng, trong khi đó môi trường nước dừa già có hàm lượng đường khá lớn thích hợp cho”nuôi cấy G. xylinus [9]. 3
Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già [10] Thành phần Hàm lượng Nước 94,99% Prôtêin 7,2% Chất béo 0,2% Cacbohyđrat 3,17% Đường 2,16% Vitamin B6 0,032 (mg/100 g) Vitamin C 7,68 mg/l Canxi 24 mg/100 g Magie, Sắt 25 mg/100 g, 0,29 mg/100 g Phot pho, Kali 0,29 mg/100 g; 250 mg/100 g Đồng, Mangan, Selen 0,04 mg/100 g; 0,142 mg/100 g; 1 mg/100 g Thành phần dinh dưỡng có trong nước dừa già có chứa nhiều khoáng chất, các chất hữu cơ thiết yếu cần cho chu trình sống của G. xylinus để tạo vật liệu Cellulose vi khuẩn. Ngoài ra, nước vo gạo cũng được dùng để nuôi cấy G. xylinus vì trong nước vo gạo có chứa nhiều chất dinh dưỡng như protein, đường, nhiều loại vitamin nhóm B, acid amin, và khoáng chất phù hợp với sự nuôi cấy G. xylinus. Thành phần các chất dinh dưỡng có trong nước vo gạo được trình bày ở bảng 1.3. Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo Thành phần Hàm lượng Protein 15,7% Đường 2% Sắt 7% -8% Kẽm 12% - 13% Acid amin Leucine, Valine, Lysine Vitamin nhóm B (B1,B2,B5,B6) 30% -60% Trong vòng ba tiếng sau khi vo, nước vo gạo phải được sử dụng, không sử dụng nước đã để quá lâu có mùi chua, vì các chất dinh dưỡng có trong nước gạo đã mất, dẫn đến hiệu quả nuôi vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus kém. 4
1.1.3. Cấu trúc, một tính chất của màng Cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mảnh, đường kính sơi nhỏ hơn đường kính của cellulose thực vật, và các sợi nhân tạo khác được tổng hợp hoá học. Cellulose vi khuẩn là một polyme không phân nhánh gồm các gốc glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4. Các nghiên cứu cơ bản đã cho thấy cấu trúc của Cellulose vi khuẩn giống cấu trúc cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc cao phân tử và một số đặc tính [14]. Theo AJ. Brown (1886) Cellulose vi khuẩn được cấu tạo từ các sợi sơ cấp (subfibril) là những sợi mảnh nhất đường kính 1,5 nm, có nguồn gốc tự nhiên, các sợi này lại kết hợp với nhau thành các vi sợi (microfibril), các vi sợi tập hợp thành bó (bundle), cuối cùng tạo thành các dải (rinbon), mỗi dải dài khoảng 100 nm, rộng 3 – 8 nm [3,9]. Hình 1.1. Cấu trúc Cellulose vi khuẩn Một số tính chất của Cellulose vi khuẩn như: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học, độ bền hoá học cao, có khả năng giữ nước, giữ ẩm tốt nhờ cấu trúc mạng lưới cellulose, có thể bị thủy phân bởi enzyme, có thể tái chế và dễ dàng bị một số nhóm vi sinh vật phân huỷ, thân thiện với môi trường, an toàn sinh học... Màng Cellulose vi khuẩn đã được công nhận là an toàn bởi FAD (Park et al. 2009; Ullahet al. 2016a), và nó đã được sử dụng làm phụ gia thực phẩm (Khan etal. 2007) [20]. Ngoài ra, màng cellulose vi khuẩn còn được sử dụng để làm mặt nạ dưỡng da,..."từ những nghiên cứu trên đã xác nhận màng Cellulose vi khuẩn là an toàn và phù hợp để sử dụng trong các công thức thuốc, và được sử dụng như để phân phối thuốc"là nguyên liệu cho y sinh và dược phẩm [18]. Trong y học, VLC"thu được từ điều kiện nuôi cấy tĩnh được nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo"để điều trị vết thương lớn do bỏng, làm mạch máu nhân tạo, sử dụng trong nha khoa. Ở Philipines, màng Cellulose vi khuẩn được dùng nhiều trong thực phẩm, bao gồm BC gel, và được tiêu thụ như một món tráng miệng truyền thống ở đây [15]. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng VLC có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng được thực nghiệm ở thỏ. Kết quả cho thấy VLC giúp vết thương nhanh lành và làm giảm sự nhiễm trùng vết thương 5
do các yếu tố ngoài môi trường gây ra [7]. Ngoài ra, VLC còn được sử dụng như vật liệu thay thế gạc thông thường trong băng bó vết thương, trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [10]. 1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn làm vật liệu nạp thuốc 1.2.1. Trên thế giới Celllose"vi khuẩn có tính chất hút nước và giữ nước"cao, độ tinh khiết cao, tính an toàn cao và"cấu trúc mạng siêu mảnh cỡ nano, nên nó được sử dụng để vận chuyển và phân phối thuốc"đến vết thương. Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng nạp thuốc của màng Cellulose vi khuẩn, như nghiên cứu của tác giả Hanif Ullah và Cs (2017) [19]; đã nghiên cứu và chế tạo vỏ nang bao thuốc từ màng Cellulose vi khuẩn thay cho vỏ nang bao thuốc thông thường bằng gelatin; nghiên cứu này chỉ ra VLC"có khả năng cản khuẩn để tránh sự nhiễm trùng từ bên ngoài, làm giảm đau, giúp vết thương mau lành, giảm sự hình thành"sẹo, giúp cho việc tháo ra, kiểm tra vết thương một cách dễ dàng ( Cazaja et al (2006)). Ngoài ra, VLC không làm mất độ ẩm của da, tránh tình trạng da bị khô đối với những vết thương lớn, rộng, nhiễm trùng trên da. Muhammad Mustafa Abern và Cs (2014) đã có"nghiên cứu đánh giá về hệ thống phân phối thuốc dựa trên màng cellulose vi khuẩn, kết quả của nghiên cứu cho thấy VLC có tính linh hoạt và tiềm năng của nó đối với điều trị tại"chỗ, đúng vị trí bị bệnh, một trong những ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn trong dược phẩm và y sinh đó là nó được áp dụng chủ yếu cho các công thức qua da để cải thiện kết quả lâm sàng [17]. Các"đánh giá của các tác giả trên cho thấy tính khả thi và lợi ích tiềm năng lớn của VLC trong việc phát triển hệ thống phân phối thuốc"của nhiều loại thuốc khác nhau. 1.2.2. Tại Việt Nam Tại Việt Nam tác giả Đinh Thị Kim Nhung và Cs đã tiến hành nuôi cấy màng Cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum trong điều trị bỏng trên thỏ. Kết quả nghiên cứu cho thấy màng Cellulose vi khuẩn dùng để băng vết thương có tỉ lệ lành vết thương cao hơn so với dùng gạc có tẩm các chất có hoạt tính tương ứng, màng CVK làm giảm hiện tượng nhiễm trùng, hoại tử vết thương, so với việc bôi trực tiếp kem nghệ và tinh dầu mù u lên vết thương [6]. Tác giả Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobactor xylinum” đã tạo ra được màng trị bỏng từ 6
màng Cellulose tinh chế có tẩm tinh dầu mù u, kháng khuẩn tốt hơn so với gạc thông thường, khả năng lành vết thương nhanh hơn. Kết quả"nghiên cứu của các tác giả trên cho thấy tiềm năng của VLC trong việc sử dụng màng Cellulose vi khuẩn như hệ thống vận chuyển và phân"phối thuốc. Đây cũng là một hướng trong nghiên cứu sử dụng VLC để hấp thu thuốc neomycin sulfate nhằm hạn chế những tác dụng phụ không mong muốn của thuốc đối với cơ thể. 1.3. Tổng quan về thuốc Neomycin sulfate Neomycin sunlfate"là thuốc kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside. Neomycin sulfate có tác dụng với phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây nên các bệnh nhiễm khuẩn"ngoài da. 1.3.1. Công thức Công thức phân tử:C23H46N6O13.xH2SO4. Khối lượng phân tử: 712,72 g/mol Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Neomycin sulfate [1] 1.3.2. Tính chất lí hoá Ở dạng"tinh khiết, neomycin sulfate có màu trắng hoặc trắng ngà, hút ẩm, tan dễ trong"nước, khó tan trong ethanol 96%, không tan trong aceton. Quang"phổ hấp thụ cực đại của neomycin sulfate ở bước sóng Abs"277 nm. Các chế phẩm của thuốc ở dạng viên nén, dung dịch, kem bôi da, để tiến hành"định tính neomycin sulfate trong các chế"phẩm dùng phương pháp sắc kí lớp mỏng [1]. 1.3.3. Dược lý và dược động học Neomycin sulfate là thuốc kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid, có"tác dụng với phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây nên các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da. Những vi khuẩn nhạy cảm với neomycin như: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Neomycin không có tác dụng với 7
Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus bao gồm cả Streptococcus pneumonia hoặc Streptococcus tan"máu. * Cơ chế tác dụng: Neomycin là chất ưa nước, tan trong nước, thuộc nhóm kháng sinh aminoglycoside. Cơ chế tác dụng là ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn, bằng cách liên kết với tiểu đơn vị 30S của Ribosome của vi khuẩn, làm đọc sai thông tin của t-ARN, làm cho vi khuẩn không thể tổng hợp được các protein quan trọng đối với sự phát triển của nó. Ngoài ra, còn làm tách các polysomes thành các monosome phi chức năng [1,13]. * Dược động học: Neomycin"được hấp thu kém qua đường tiêu hoá, khảng 97% liều uống được bài tiết dưới dạng không đổi qua phân. Sau khi uống 3 g, nồng độ huyết thanh đạt được 4 microgam/ml và khi thụt sự hấp thu cũng tương tự. Hấp thu thuốc có thể tăng lên khi niêm mạc bị viêm hoặc bị tổn thương. Khi thuốc đã được hấp thu, nó sẽ giải trừ nhanh qua thận dưới dạng hoạt"tính. Thời gian bán thải của Neomycin khoảng 2-3 giờ [2]. 1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định Neomycin sulfate được"dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và mắt do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm với neomycin sulfate. Thuốc còn được chỉ định để sát khuẩn đường ruột trước khi phẫu thuật và làm giảm vi khuẩn NH3 trong ruột khi bị hôn mê"gan. Không được sử dụng neomycin sulfate qua đường tiêm hoặc toàn thân, tránh"sử dụng thuốc quá lâu tại một chỗ vì với liều lượng cao vì thuốc có thể gây khô da, khiến da dễ mẫn"cảm, và gây ra hiện tượng kháng chéo với các thuốc thuộc nhóm kháng sinh aminoglycosid khác [1-2]. 1.4. Tình hình nghiên cứu Neomycin sulfate trên thế giới và Việt Nam 1.4.1. Trên thế giới Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về Neomycin sulfate như: Amita H. Patel, và Riddhi M. Dave, có công trình xác định và đánh giá sự giải phóng bền vững của Neomycin sulfate trong Situophthalmic gel, thuốc có khả năng kháng khuẩn tốt trong hệ thống gelling tại chỗ [12]. Ngoài ra"nghiên cứu Blanchard C. (2015) [16] cho rằng khi có sự phối hợp giữa neomycin và sulfate thì ít gây dị ứng cho da hơn"khi chỉ có neomycin đơn thuần. Bên cạnh đó, Anjali, D. V. Gowda, Gowrav M. P., Atul Srivastava and Riyaz Ali M. Osmani (2016), đã nghiên cứu về các hạt nano Chitosan chứa Neomycin sulfate để chữa các vết thương, chỉ ra rằng các polyme"tự nhiên được sử dụng làm vật"liệu để phân phối thuốc và điều trị các bệnh khác nhau. Sự kết hợp giữa Neomycin sulfate và các sợi nano trong cấu trúc của polyme tự nhiên đã cải thiện được nhược 8
điểm của Neomycin sulfate, làm vết thương nhanh lành so với việc chỉ sử dụng kem neomycin đơn thuần [13]. 1.4.2. Tại Việt Nam Neomycin sulfate là một loại thuốc thiết yếu có trong “Danh mục thuốc tân dược thiết yếu lần thứ” được bộ y tế chỉnh sửa và ban hành năm 2009 [2]. Chế phẩm của neomycin như dạng viên nén, dạng kem bôi da, thuốc nhỏ mắt. Tại Việt Nam"việc nghiên cứu và màng Cellulose vi khuẩn làm vật liệu nạp thuốc và vận chuyển thuốc đang còn khá"mới. Các nghiên cứu về màng Cellulose vi khuẩn hầu như chỉ dừng lại ở điều kiện phòng thí nghiệm, việc sản xuất màng CVK với quy mô lớn chưa nhiều. Trong"những năm gần đây, có rất nhiều các nghiên cứu về màng cellulose vi khuẩn"làm vật liệu mang thuốc, đã có nghiên cứu về thuốc Neomycin sulfate nhưng cũng chỉ dừng lại ở mức nghiên cứu chưa ứng dụng được vào trong thực tế. 9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: "Khả năng hấp thụ thuốc"Neomycin sulfate của VLC (tạo ra từ các môi trường nuôi cấy khác nhau). 2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu * Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở phòng thí nghiệm. * Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. 2.3. Vật liệu nghiên cứu 2.3.1. Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Gluconacetobarter xylinus lên men tạo vật liệu Cellulose, được mua tại Nhật Bản 2.3.2. Nguyên liệu và hóa chất Nguyên liệu: nước dừa già, nước vo gạo, nước cất hai lần, cao nấm men. Hóa chất: - Thuốc Neomycin sulfate dạng tinh khiết. - Vật liệu Cellulose (99% là nước) được thu nhận từ việc nuôi cấy gluconacetobacter trong các môi trường nuôi cấy khác nhau. - Đường glucose, acid acetic, acid citric, peptone, amoni sunfat, kali đihidrophotphat, axit clohidric,… đạt tiêu chuẩn phân tích. 2.3.3. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản). - Cân phân tích, cân kỹ thuật (Sartorius – Thụy Sỹ) - Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA - Buồng cấy vô trùng (Haraeus) - Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức), tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu,… 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp lên men thu màng cellulose vi khuẩn từ một số môi trường Bước 1: Chuẩn bị các môi trường nuôi cấy G. xylinus như Bảng 2.1 MT1: Môi trường chuẩn (MTC); MT2: môi trường nước già (MTD); MT3: môi trường nước vo gạo (MTG). 10
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo vật liệu Cellulose Môi trường Thành phần MTC MTD MTG Glucose 20 g 30 g 30 g Pepton 5g 10 g 10 g Diamoni photphat khan 2,7 g Amoni sulfat 0,5 g 0,5 g Cao nấm men 5g Diamoni photphat 0,3 g 0,3 g Acid citric 1,5 g Nước dừa già 1000 ml Nước vo gạo 1000 ml Nước cất 2 lần 1000 ml Môi trường ở sau khi pha được hấp khử trùng ở 113°C trong 15 phút. Sau khi hấp môi trường xong, đưa môi trường vào buồng cấy và khử trùng bằng tia UV trong 15 phút. Bước 2: Đưa các môi trường vào hấp khử trùng ở nhiệt độ 1130C trong 15 phút. Bước 3: Vệ sinh buồng cấy bằng cồn 700, sau đó tiến hành khử trùng buồng cấy bằng tia UV trong 30 phút. Bước 4: Lấy"môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút, để nguội"môi trường. Bước 5: Thêm 20-25% dịch giống, lắc đều tay cho dịch giống phân bố đều. Bước 6: Dùng"gạc vô trùng bịt kín miệng bình, nuôi cấy tĩnh trong thời"gian 5 -14 ngày ở nhiệt độ 260C. Bước 7: Thu"màng CVK thô, rửa sạch dưới vòi"nước. 2.4.2. Phương pháp xử lý màng Cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc. Mục đích: Đảm bảo không còn tồn dư các chất hoá học của môi trường nuôi cấy trong VLC,"phá huỷ thành tế bào và các độc tố của vi"khuẩn. Phương pháp: Màng Cellulose vi khuẩn thô sau khi thu được từ một số môi trường, màng có màu vàng, ép vật liệu loại bỏ môi trường. Trong vật liệu Cellulose thô có chứa nhiều vi khuẩn, nên cần hấp khử trùng màng trong NaOH nóng 3% ở 113°C trong 15 phút, làm cho thành tế bào của vi khuẩn bị vỡ và giải phóng độc tố của vi khuẩn. 11