Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α-glucosidaza từ Aspergillus oryzae và hướng ứng dụng

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:174

Thêm vào BST

Báo xấu

80
lượt xem 17
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được tiến hành với những mục tiêu sau: Phân lập, tuyển chọn A.oryzae phù hợp (cho quá trình lên men bề mặt trên môi trường rắn) cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao; xác định điều kiện lên men mặt trên môi trường rắn phù hợp cho quá trình nhân giống, sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α-glucosidaza từ Aspergillus oryzae và hướng ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC TIẾN NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM α- GLUCOSIDAZA TỪ ASPERGILLUS ORYZAE VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC TIẾN NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM α- GLUCOSIDAZA TỪ ASPERGILLUS ORYZAE VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. HOÀNG ĐÌNH HÒA 2. PGS.TS. QUẢN LÊ HÀ Hà Nội - 2015
LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các Thầy Cô, bạn đồng nghiệp và các Cơ quan. Trước hết cho phép tôi bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Giáo Sư Tiến Sĩ Hoàng Đình Hòa, Phó Giáo Sư Tiến Sĩ Quản Lê Hà, là những người đã hướng dẫn, chỉ bảo, động viên và giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn Sở khoa học và Công nghệ Hà Nội đã cấp kinh phí cho tôi, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn đến các Thầy cô của Viện Công Nghệ Sinh Học Thực Phẩm - Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận án. Tôi xin cảm ơn các đồng nghiệp đã cùng tôi làm việc và động viên giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các Giáo Sư, Phó Giáo Sư, Tiến Sĩ là chủ tịch hội đồng, phản biện và Ủy viên hội đồng đã dành nhiều thời gian quý báu để đọc và tham gia hội đồng chấm luận án này với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn tất tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận án. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời biết ơn đến bố mẹ, gia đình và người thân của tôi với tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ đã dành cho tôi trong chặng đường để hoàn thành được luận án nghiên cứu này. Tác giả luận án NGUYỄN ĐỨC TIẾN
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2015 Tập thể giáo viên hướng dẫn Tác giả luận án 1. GS.TS. HOÀNG ĐÌNH HÒA NGUYỄN ĐỨC TIẾN 2. PGS.TS. QUẢN LÊ HÀ
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ............................................................................................................................ 1 2. Nội dung .............................................................................................................................. 2 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................................... 3 4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của luận án ............................... 4 5. Bố cục luận án ..................................................................................................................... 5 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 6 1.1. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) ............................................................................................. 6 1.1.1. Khái niệm ĐTĐ ............................................................................................................. 6 1.1.2. Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ ................................................................................... 7 1.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng AGIs đến quá trình trao đổi đường trong cơ thể......... 8 1.2.1. Enzyme α-glucosidase ................................................................................................... 8 1.2.1.1. Sơ lược về enzyme....................................................................................................... 8 1.2.1.2. Giới thiệu về enzyme α - glucosidase ......................................................................... 8 1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ.................................................... 9 1.3. Chất kìm hãm α-glucosidase (alpha-Glucosidase inhibitor) (AGIs) .............................. 11 1.3.1. Các AGIs từ tổng hợp .................................................................................................. 12 1.3.2. AGIs từ động vật ......................................................................................................... 12 1.3.3. AGIs từ thực vật .......................................................................................................... 12 1.3.4. AGIs từ vi sinh vật....................................................................................................... 14 1.3.5. AGIs từ A.oryzae ......................................................................................................... 15 1.4. Đỗ đen và các sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ........................................................ 16 1.4.1. Đỗ đen ......................................................................................................................... 16 1.4.2. Sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ ............................................................................ 17 1.5. A.oryzae và lên men bề mặt ............................................................................................ 19
1.5.1. Đặc điểm hình thái A.oryzae ....................................................................................... 19 1.5.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae ................................................................................................................................. 21 1.5.2.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon .................................................................................. 22 1.5.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ....................................................................................... 23 1.5.2.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng .............................................................. 23 1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae ................................................................................................................................. 24 1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................. 24 1.5.3.2. Độ ẩm môi trường .................................................................................................... 24 1.5.3.3. Ảnh hưởng độ thoáng khí ......................................................................................... 25 1.5.3.4. Điều kiện pH ban đầu của môi trường ..................................................................... 25 1.5.3.5. Tỷ lệ giống ................................................................................................................ 26 1.5.3.6. Thời gian lên men ..................................................................................................... 27 1.6. Thu nhận AGIs ............................................................................................................... 27 1.6.1. Chiết xuất AGIs từ sản phẩm môi trường sau lên men ............................................... 27 1.6.2. Tinh sạch AGIs ............................................................................................................ 29 1.7. Ứng dụng sóng siêu âm trong chiết xuất ........................................................................ 30 1.8. Nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng AGIs từ đậu đỗ lên men trên thế giới ................ 35 1.9. Nghiên cứu và ứng dụng AGIs ở Việt Nam ................................................................... 39 Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 41 2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 41 2.1.1. Các nguồn vi sinh vật và vật liệu ................................................................................. 41 2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................................... 41 2.1.3. Môi trường ................................................................................................................... 42 2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy phân lập và giữ giống ............................................................. 42 2.1.3.2. Môi trường nghiên cứu định loại Aspergillus ......................................................... 42
2.1.3.3. Môi trường đậu đỗ giá thể rắn ................................................................................. 42 2.1.3.4. Các môi trường rắn cho nhân giống ........................................................................ 42 2.1.3.5. Đỗ đen lên men ......................................................................................................... 43 2.1.4. Thiết bị......................................................................................................................... 43 2.1.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu................................................................................ 43 2.1.5.1. Địa điểm nghiên cứu................................................................................................. 43 2.1.5.2. Thời gian nghiên cứu ................................................................................................ 43 2.2. Phương pháp phân tích và đo đạc ................................................................................... 44 2.2.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm mốc ........................................................... 44 2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ................................................................. 44 2.2.2.1. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men theo phương pháp của Yamaki và Mori (2006)............................................................................. 44 2.2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của dịch chiết xuất bằng dung môi ...... 45 2.2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo Toomoyuki và cộng sự, (1999) ...................................................................................................................... 45 2.2.2.4. Hoạt lực kìm hãm α-glucosidase (giá trị IC50) ......................................................... 45 2.2.3. Xác định hàm lượng protein, lipit, carbonhydrate và độ ẩm trong các sản phẩm thực phẩm .............................................................................................................................. 46 2.2.4. Phương pháp phân tích cảm quan ................................................................................ 46 2.2.5. Phương pháp tính toán, đánh giá hiệu quả tinh sạch chế phẩm AGIs kỹ thuật ........... 47 2.2.6. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu an toàn thực phẩm .............................................. 47 2.2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ...................................................................... 47 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................ 48 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ......................................................................................... 48 2.3.2. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao .................................. 49 2.3.2.1. Phân lập A.oryzae..................................................................................................... 49 2.3.2.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao ............................ 50
2.3.2.3. Định danh chủng nấm tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 ........................................................................................................................... 50 2.3.3. Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của A.oryzae T6 trong nhân giống trên môi trường rắn ...................................................................................................... 52 2.3.3.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52 2.3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52 2.3.3.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52 2.3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52 2.3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ................... 52 2.3.3.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 53 2.3.3.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6.................. 53 2.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 .............. 53 2.3.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 .......................................................................................................... 53 2.3.4.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6........................................................................ 53 2.3.4.3. Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................... 53 2.3.4.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 54 2.3.4.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 .......................................................................................................... 54 2.3.4.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 54
2.3.4.7. Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 54 2.3.4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ........................................................................................................................................... 55 2.3.4.9. Sự biến động AGIs trong quá trình lên men bằng A.oryzae T6................................ 55 2.3.5. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng siêu âm ................................. 55 2.3.5.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ............ 55 2.3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ........................................................................................................................................ 55 2.3.5.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến khả năng chiết xuất AGIs ............................................................................................................................... 56 2.3.5.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men: ....................................................................................................................................... 56 2.3.5.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ......................................................................................................... 56 2.3.6. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men ....................................................... 56 2.3.6.1. Khảo sát dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs........................................................... 56 2.3.6.2. Khảo sát nồng độ ethanol cho tinh sạch sơ bộ AGIs................................................ 57 2.3.6.3. Thu nhận AGIs .......................................................................................................... 57 2.3.6.4. Tinh sạch AGIs bằng RP - HPLC ............................................................................. 57 2.3.6.5. Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs bằng khối phổ........ 57 2.3.6.6. Định lượng peptide AGIs bằng RP - HPLC ............................................................. 58 2.3.7. Ứng dụng AGIs ........................................................................................................... 58 2.3.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs ...... 59 2.3.7.2. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế phẩm AGIs ....................................................................................................................................... 59 2.3.7.3. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm AGIs để tạo bột uống liền AGIs ........................... 60 Với A: là T3;.......................................................................................................................... 61
2.3.8. Đề xuất công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.oryzae T6............................................................................................................................ 62 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 63 3.1. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao ..................................... 63 3.1.1. Phân lập Aspergillus oryzae ........................................................................................ 63 3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao ............................... 64 3.1.3. Định danh chủng tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1- 5,8S - ITS2 ..................................................................................................................................... 66 3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của A.oryzae T6 trong nhân giống trên môi trường rắn ....................................................................................................................... 68 3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ........................................................................................................................................... 68 3.2.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 70 3.2.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 71 3.2.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ........................................................................................................................................... 72 3.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ...................... 73 3.2.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ........................................................................................................................................... 74 3.2.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ..................... 76 3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................. 77 3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 77 3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ........................................................................ 79 3.3.3. Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4, KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ......................................................... 80
3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 82 3.3.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ......................................................................................................... 83 3.3.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 84 3.3.7. Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 86 3.3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ........................................................................................................................................... 87 3.3.9. Sự biến động AGIs trong quá trình lên men bề mặt trên môi trường rắn bằng A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 88 3.4. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.oryzae T6 (đỗ đen lên men) bằng sử dụng sóng siêu âm .................................................................................................... 90 3.4.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men .............. 90 3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ... 91 3.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến khả năng chiết xuất AGIs ...................................................................................................................................... 93 3.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ................ 95 3.4.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ......................................................................................................... 97 3.5. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men ........................................................ 103 3.5.1 Khảo sát dung môi để tinh sạch sơ bộ AGIs .............................................................. 103 3.5.2. Khảo sát nồng độ ethanol để tinh sạch sơ bộ AGIs ................................................... 104 3.5.3. Tinh sạch AGIs .......................................................................................................... 105 3.5.4. Xác định khối lượng phân tử và trình tự axit amin của peptide AGIs từ đỗ đen lên men bằng khối phổ .............................................................................................................. 108 3.5.5. Định lượng peptide AGIs của đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6 ............................. 109
3.6. Ứng dụng AGIs ............................................................................................................ 110 3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs ........ 110 3.6.2. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế phẩm AGIs 111 3.6.7. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm AGIs cho sản xuất thử nghiệm bột uống liền AGIs cho người bệnh ĐTĐ ................................................................................................. 115 3.6.7.1. Xác định hàm lượng chế phẩm AGIs cho bột uống liền ......................................... 115 3.6.7.2. Xác định cơ chất phù hợp phối chế với chế phẩm AGIs cho công thức tạo sản phẩm bột uống liền. ............................................................................................................. 115 3.6.7.3. Xác định công thức tạo sản phẩm bột uống liền .................................................... 117 Chương 4: ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AGIs TỪ ĐỖ ĐEN XANH LÒNG LÊN MEN BẰNG A.ORYZAE T6 ..................... 119 Chương 5: KẾT LUẬN ....................................................................................................... 122 KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO.................................................... 123 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ............................... 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 125 PHỤ LỤC ........................................................................................................................... 141
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ AGIs alpha-Glucosidase inhibitor (chất kìm hãm α-glucosidaza ) ( chất kìm hãm α-glucosidase) (chất ức chế α-glucosidase) A.oryzae Aspergillus oryzae Bp Base pair CFU Colony forming unit ĐTĐ Đái tháo đường đỗ đen lên đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.oryzae T6 men Da Dalton DNJ 1 – deoxynojirimycin PCR polymerase chain reaction GABA Gamma-Aminobutyric acid GLP Glucagon peptide GLP-1 peptide-1 dạng glucagon GLP-2 peptide-2 dạng glucagon HDL High Density Lipoprotein – Lipoprotein tỷ trọng cao HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography) IC50 Nồng độ kìm hãm 50% (Haft maximal inhibitory concentration) ITS Inter-Transcribed Spacer KDa Kilodalton LC-MS/MS Sắc ký lỏng – song song khối phổ (Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry) TE 10M Tris, - pH 8,0 - HCl, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid TPCN Thực phẩm chức năng WHO World Health Organization – Tổ chức Y tế thế giới p NPG p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside RP - HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (Reverse phase-high performance liquid chromatography)
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Một số chất kìm hãm α-glucosidase thu nhận từ vi sinh vật ............................... 15 Bảng 1.2 Một số sản phẩ m đâ ̣u tương lên men bề mặt và tác nhân vi sinh vâ ̣t .................. 18 Bảng 1.3 Các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng, nguồn gốc và chức năng đối với tế bào nấm mốc Aspergillus spp ............................................................................. 22 Bảng 1.4 Các ứng dụng của siêu âm năng lượng cao trong công nghiệp thực phẩm ......... 33 Bảng 2.1 Hàm lượng một số chất khoáng trong môi trường lên men ................................ 53 Bảng 2.2 Tỷ lệ phối trộn các thành phần tạo ra sản phẩm bột uống liền ............................ 60 Bảng 2.3 Mười trật tự trình bày mẫu tuân theo nguyên tắc hình vuông Williams tương ứng với 5 mẫu khảo sát ....................................................................................... 61 Bảng 3.1 Kết quả phân lập Aspergillus spp từ các nguồn khác nhau ................................. 63 Bảng 3.2 Kết quả đánh giá mức độ tương đồng của trình tự đoạn vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 của chủng T6 với GenBank database sử dụng công cụ BLAST ................ 67 Bảng 3.3 So sánh phương pháp chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng siêu âm và không sử dụng sóng siêu âm ........................................................... 102 Bảng 3.4 Đánh giá sản phẩm sau các bước tinh sạch AGIs từ đỗ đen lên men................ 109 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy chân không đến chất lượng cảm quan, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và thời gian cô đến chất lượng chế phẩm AGIs... 110 Bảng 3.6 Kết quả phân tích hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, dinh dưỡng và các chỉ tiêu lý hóa của chế phẩm AGIs ......................................................................... 111 Bảng 3.7 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật, kim loại nặng và các chất không mong muốn trong sản phẩm chế phẩm AGIs. ................................................... 113 Bảng 3.8 Số liệu thử độc tính cấp của chế phẩm AGIs .................................................... 114 Bảng 3.9 Kết quả điểm đánh giá cảm quan cho các chỉ tiêu của sản phẩm bột uống liền ..................................................................................................................... 117
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Mô phỏng tiêu hóa Carbohydrate (tinh bột và đường sucrose) trong cơ thể ...... 10 Hình 1.2 Cấu trúc bộ gen của A.oryzae .............................................................................. 21 Hình 1.3 Quá trình hình thành, phát triển và vỡ tung của bọt khí ...................................... 31 Hình 2.1 Thang thị hiếu chín điểm ..................................................................................... 46 Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ................................................................................. 48 Hình 3.1 Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của một số A.oryzae phân lập được .............. 65 Hình 3.2 Sản phẩm PCR của chủng T6 .............................................................................. 66 Hình 3.3 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 ......................................................................................................... 69 Hình 3.4 Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến mật độ tế bào của A.oryzae T6.................................................................................................... 70 Hình 3.5 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 .......................................................................................................... 72 Hình 3.6 Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 ......................................................................................................... 73 Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 ........... 74 Hình 3.8 Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 ......................................................................................................... 75 Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 ......... 76 Hình 3.10 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α – glucosidase và mật độ tế bào của A.oryzae T6 ............... 78 Hình 3.11 Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase .................................... 80 Hình 3.12 Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4, KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ........... 81 Hình 3.13 Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ................................................................................ 82 Hình 3.14 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ........................................................................ 84
Hình 3.15 Ảnh hưởng độ đầy của khối khối môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α - glucosidase ...................................................................... 85 Hình 3.16 Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α - glucosidase .............................................................................. 86 Hình 3.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ....................................................................................................... 88 Hình 3.18 Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase trong quá trình lên men bề mặt trên môi trường rắn bằng A.oryzae T6............................................................................... 89 Hình 3.19 Ảnh hưởng của dung môi chiết xuất đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men ......................................................... 90 Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hoạt tính kìm hãm α- glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men ...................................... 92 Hình 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) của dịch chiết đỗ đen lên men ....................................... 93 Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men ............................................................................. 96 Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men .................................. 98 Hình 3.24 So sánh giá trị IC50 của AGIs thu được ở phần kết tủa và phần tan khi sử dụng methanol, ethanol và isopropyl alcohol ................................................... 103 Hình 3.25 So sánh giá trị IC50 của chất khô ở phần tủa và phần tan khi sử dụng các nồng độ ethanol khác nhau để làm sạch chế phẩm AGIs chiết xuất từ đỗ đen lên men . 104 Hình 3.26 Sắc ký đồ có píc của AGIs (a). Hình dạng píc của AGIs (b) ............................ 106 Hình 3.27 Sắc ký đồ môi trường đỗ đen xanh lòng trước khi lên men (a). Sắc ký đồ dịch sau khi lên men, trước tinh sạch (b). Sắc ký đồ AGIs sau khi tinh sạch (c) ...................................................................................................................... 107 Hình 3.28 Khối lượng phân tử và trình tự axit amin của peptide AGIs từ đỗ đen lên men được thực hiện bằng khối phổ. R.YIYEIAR.R ......................................... 108 Hình 4.1 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men .......... 119
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Xã hội ngày càng phát triển với những thành tựu lớn của khoa học công nghệ và sự nghiệp Công nghiệp hóa – Hiện đại hóa. Bên cạnh những thành tựu đạt được là hậu quả ảnh hưởng tới môi trường sống của nhân loại mà con người là đối tượng trực tiếp gánh chịu hậu quả đó. Môi trường ô nhiễm kéo theo sự ảnh hưởng không nhỏ tới lương thực thực phẩm dẫn tới những căn bệnh hiểm nghèo trong số đó phải kể đến bệnh đái tháo đường (ĐTĐ). Theo dự báo của Hiệp hội đái tháo đường Quốc tế IDF, trong một thập kỉ trở lại đây, bệnh ĐTĐ có xu hướng phát triển nhanh chóng. Ước tính năm 2010, thế giới có khoảng 221 triệu người mắc bệnh ĐTĐ và dự báo đến năm 2025 sẽ lên tới 330 triệu người (chiếm khoảng 6% dân số toàn cầu). Tỷ lệ người mắc bệnh ĐTĐ ở các nước phát triển khoảng 42%, tỷ lệ này tăng lên 170% ở các nước đang phát triển (như Việt Nam) [1]. Theo Tổ chức Y tế thế giới WHO (World Health Organization), trong vòng 20 năm tới chỉ tính riêng châu Á, bệnh ĐTĐ bùng phát với khoảng 330 triệu người mắc bệnh sẽ nguy hiểm hơn AIDS hay cúm gà. Ở châu Âu, năm 2005 có khoảng 19 triệu người mắc tương đương với 4% dân số và con số này được dự báo tăng lệ 26 triệu vào năm 2030 [160]. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) và thừa cân béo phì đã trở thành căn bệnh phổ biến không chỉ ở các nước phát triển mà còn ở nước đang phát triển, do thay đổi trong lối sống của người dân và thói quen ăn uống. Chất kìm hãm α-glucosidase (AGIs) thường được sử dụng để ngừa bệnh ĐTĐ loại II [53]. Với cơ chế tác dụng là AGIs kết hợp với α- glucosidase ở ruột làm kìm hãm sự thủy phân tạo thành glucose, ngăn hấp thụ glucose đường huyết sau ăn [85]. AGIs có thể được tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như: Chiết xuất từ thực vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc bằng con đường sinh học nhờ các vi sinh vật. Các AGIs có nguồ n gố c tự nhiên đươ ̣c đă ̣c biê ̣t quan tâm vì không gây phản ứng phu ̣, do đó AGIs tự nhiên là một trong những liệu pháp hấp dẫn để điều trị tăng đường huyết và thừa cân béo phì. Gầ n đây có nhiề u nghiên cứu về các AGIs từ nguồ n vi sinh vâ ̣t như Bacillus subtilis, Actinoplanes spp, Aspergillus oryzae (A.oryzae). AGIs được tìm thấy trong nhiều thực phẩm lên men, được đánh giá cao về hoạt tính kìm hãm α- glucosidase, ứng dụng hỗ trợ trị bệnh ĐTĐ và thừa cân béo phì. Sử dụng A.oryzae bằng lên men bề mặt trên môi trường rắn đỗ tương đang là hướng mới cho chất chiết xuất có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, sản phẩm AGIs từ đỗ tương lên men bề mặt trên môi trường
2 rắn bằng A.oryzae hiện đang được phát triển ở nhiều quốc gia, với mục đích hỗ trợ kiểm soát đường huyết, hỗ trợ kiểm soát thừa cân béo phì. Trong các nghiên cứu đã công bố chủ yế u sử du ̣ng đỗ tương (Glycine max) lên men bằ ng A.oryzae để thu nhâ ̣n AGIs. Tuy nhiên các thông tin công bố về bản chất và cơ chế hình thành AGIs từ các loại đậu đỗ lên men bề mặt trên môi trường rắn băng A.oryzae còn hạn chế. Chính vì thế, việc nghiên cứu có hệ thống thu nhận AGIs từ A.oryzae lên men trên các nguồn nguyên liệu trong nước và hướng ứng dụng ở điều kiện hiện tại của Việt Nam là vấn đề cấp thiết, mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao“Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α-glucosidaza từ Aspergillus oryzae và hướng ứng dụng” là một việc làm cấp thiết hiện nay, được tiến hành với những mục tiêu sau: (1) Phân lập, tuyển chọn A.oryzae phù hợp (cho quá trình lên men bề mặt trên môi trường rắn) cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao. (2) Xác định điều kiện lên men mặt trên môi trường rắn phù hợp cho quá trình nhân giống, sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu. (3) Xác định điều kiện chiết xuất phù hợp cho tạo chế phẩm AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu. (4) Tinh chế, xác định thành phần hóa học AGIs hình thành bằng A.oryzae nghiên cứu. (5) Hướng ứng dụng và đề xuất quy trình công nghệ sản xuất AGIs hình thành bằng A.oryzae nghiên cứu. Để đạt được mục tiêu đề ra, luận án được tiến hành với nội dung sau: 2. Nội dung - Phần 1: Tuyển chọn A.oryzae cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao: + Phân lập A.oryzae từ các mẫu tương, mẫu đỗ đen mốc; đỗ xanh mốc; đỗ tương mốc và gạo mốc lấy ở Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội và Chợ Đồng Xuân – Hà Nội. + Tuyển chọn A.oryzae phân lập được, có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao. + Định danh A.oryzae tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2.
3 - Phần 2: Xác định một số yếu tố (độ ẩm, pH ban đầu, cơ chất môi trường lên men, nhiệt độ, tỷ lệ trấu môi trường rắn, độ dày khối môi trường lên men và thời gian nhân giống) ảnh hưởng tới quá trình nhân giống A.oryzae nghiên cứu. - Phần 3: Xác định một số yếu tố (độ ẩm, pH ban đầu, cơ chất môi trường lên men, thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường, nhiệt độ, tỷ lệ tiếp giống ban đầu, tỷ lệ trấu môi trường rắn, độ dày khối môi trường lên men và thời gian nhân giống) ảnh hưởng tới khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu bằng lên men bề mặt trên môi trường rắn. - Phần 4: Nghiên cứu ảnh hưởng dung môi, nồng độ, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ môi trường đỗ đen xanh lòng sau lên men bề mặt trên môi trường rắn bằng A.oryzae nghiên cứu (mục tiêu 3). - Phần 5: Nghiên cứu tinh sạch, xác định thành phần hóa học và định lượng AGIs được hình thành bằng A.oryzae nghiên cứu: Xây dựng phương pháp xác định dung môi, nồng độ dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs; Thu nhận AGIs bằng các enzyme thủy phân lần lượt với pepsin, trypsin, pancreatin, α- amylase và maltase; Xây dựng phương pháp tinh sạch và kiểm tra độ tinh sạch AGIs bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP - HPLC); Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs tinh sạch được phân tích bằng thiết bị MALDI-TOF/TOF mass spectrometer. Phổ AGIs được phân tích bằng phần mềm Mascot và dữ liệu ngân hàng Ludwig NR hoặc SwissPro; Định lượng hàm lượng AGIs bằng RP – HPLC. - Phần 6: Xây dựng hướng ứng dụng AGIs và đề xuất công nghệ sản xuất AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu: + Xây dựng phương pháp cô sấy dịch chiết AGIs cho tạo chế phẩm AGIs. + Đánh giá tính an toàn về độc tính cấp, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và an toàn thực phẩm của AGIs tạo ra bằng A.oryzae nghiên cứu. + Đề xuất công nghệ sản xuất AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nước ta có nguồn nguyên liệu đậu đỗ rất đa dạng và nấm mốc A.oryzae phân lập từ tự nhiên là rất phong phú. Trong sản xuất AGIs từ nấm mốc A.oryzae người ta thường dùng đỗ tương làm môi trường lên men bề mặt trên môi trường rắn [100]. Sản phẩm AGIs
4 từ môi trường sau lên men bề mặt trên môi trường rắn từ đỗ tương bằng A.oryzae cho hiệu quả giảm đường huyết đối với người bệnh ĐTĐ cao, sử dụng an toàn và không có tác dụng phụ. Đó là lý do thúc đẩy nghiên cứu chọn các đậu đỗ trong nước làm nguyên liệu để lên men A.oryzae cho sản xuất AGIs. Các A.oryzae bản địa phân lập từ các nguồn nguyên liệu mẫu tương, mẫu đỗ đen mốc; đỗ xanh mốc; đỗ tương mốc và gạo mốc lấy ở Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội và Chợ Đồng Xuân – Hà Nội. Phương thức lên men bề mặt trên môi trường rắn được chọn lựa dựa trên điều kiện thí nghiệm đơn giản. Tinh sạch AGIs dùng cho nghiên cứu thành phần, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và định lượng AGIs được hình thành bằng A.oryzae nghiên cứu. Chế phẩm AGIs kỹ thuật, chỉ qua chiết xuất, làm sạch sơ bộ có khả năng ứng dụng thực tiễn trong cải thiện AGIs giúp hỗ trợ điều trị ở người bệnh ĐTĐ. 4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của luận án Luận án nghiên cứu hệ thống từ việc lựa chọn, định tên A.oryzae, xác định bản chất của AGIs và đưa ra phương án thích hợp nhất về điều kiện lên men, tách chiết hoạt chất và hoàn thiện để có sản phẩm dạng bột chứa AGIs. Bằng quy trình công nghệ tạo ra chế phẩm đã đề xuất và bản chất của AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae có thể ứng dụng để sản xuất sản phẩm cho người bệnh ĐTĐ, góp phần nâng cao chất lượng sức khoẻ cộng đồng. Về mặt khoa học, đề tài đã đưa ra một số điểm mới: Đây là một nghiên cứu đầu tiên của Việt Nam tuyển chọn được A.oryzae cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao trên môi trường đỗ đen xanh lòng (Vigna Cylindrica Skeels), nghiên cứu được một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống và lên men hình thành AGIs. Nghiên cứu đầu tiên sử dụng sóng siêu âm để chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men, tinh sạch được AGIs từ đỗ đen lên men, xác định được khối lượng phân tử và bản chất của AGIs này là peptide. Nghiên cứu đầu tiên đề xuất được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6. Dựa vào kết quả khoa học của đề tài cho thấy tiềm năng sản xuất chế phẩm AGIs ở quy mô lớn, tạo chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men cho chế biến thực phẩm cho người bênh ĐTĐ và béo phì.