Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:219

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận án "Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam" nhằm nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam nhằm khảo sát đa dạng nhóm vi sinh vật này và góp phần xây dựng quỹ gen phục vụ phát triển nông nghiệp.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- VŨ THỊ LAN HƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÁT SINH LOÀI, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM CÁC CHỦNG VI KHUẨN ACETIC KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT PHÂN LẬP TẠI CÁC TỈNH PHÍA NAM VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh – 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- VŨ THỊ LAN HƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÁT SINH LOÀI, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM CÁC CHỦNG VI KHUẨN ACETIC KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT PHÂN LẬP TẠI CÁC TỈNH PHÍA NAM VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Lê Thanh Bình 2. GS. TS. Naoto Tanaka Tp. Hồ Chí Minh – 2022
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tp. HCM, ngày 24 tháng 9 năm 2022 Tác giả luận án Vũ Thị Lan Hương
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Thanh Bình - Viện Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và GS. TS. Naoto Tanaka - Bộ Sưu tập chủng giống Vi sinh NODAI, Đại học Nông nghiệp Tokyo, Nhật Bản đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi thực hiện luận án này. Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Yuzo Yamada, Khoa Nông nghiệp, Đại học Shizuoka, Nhật Bản và TS. Pattaraporn Rattanawaree, Trung tâm nghiên cứu Tài nguyên Sinh học Thái Lan (TBRC), Cơ quan Quốc gia về Khoa học và Phát triển Công nghệ, Thái Lan đã dẫn dắt tôi đến với nghiên cứu hệ thống học vi khuẩn, luôn dõi theo và hỗ trợ tôi khi cần thiết. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Nhà trường, Khoa, Thầy Cô, Đồng nghiệp Khoa Sinh học – Công nghệ Sinh học và Đồng nghiệp Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh luôn giúp đỡ tận tình, động viên, ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện, Chuyên viên phụ trách đào tạo, Viện Sinh học Nhiệt đới và Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cám ơn sự giúp đỡ tận tình, động viên, ủng hộ từ ThS. Bùi Thị Thu Vân, ThS. Bùi Thị Tú Uyên, ThS. Nguyễn Khánh Linh, TS. Kiều Phương Nam, Thầy Cô đồng nghiệp, các bạn Học viên, Sinh viên tại Bộ môn Vi sinh, Khoa Sinh học – Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Tôi xin chân thành cám ơn sự giúp đỡ quý báu và hỗ trợ của GS.TS. Somboon Tanasupawat, Khoa Khoa học Dược, Đại học Chulalongkorn, Thái Lan, TS. Yuki Muramatsu, Trung tâm Quốc gia về Tài nguyên Sinh học (NBRC), Khoa Công nghệ sinh học, NITE, Nhật Bản, nhà nghiên cứu Taweesak Malimas và các Nhà khoa học ở các Bộ
iii Sưu tập chủng giống VTCC, Việt Nam; BCC và TBRC, Thái Lan; NRIC và NBRC, Nhật Bản. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Bạn bè đã luôn ở bên động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu luận án. Trên hết cả, tôi đã không thể học tập và thực hiện luận án nếu không có tình yêu vô bờ bến, sự động viên và hỗ trợ tốt nhất từ Bố Mẹ, Chồng, hai Con và tất cả Người thân yêu. Tôi vô cùng biết ơn và hạnh phúc được là thành viên trong Gia đình và hai Gia đình lớn. Tp. HCM, ngày 24 tháng 9 năm 2022 Tác giả luận án Vũ Thị Lan Hương
iv MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt viii Danh mục hình xi Danh mục bảng xiv MỞ ĐẦU 1 Mục tiêu nghiên cứu 2 Nội dung nghiên cứu 2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 Những đóng góp mới của luận án 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 4 1.1. Đặc điểm chung vi khuẩn acetic 4 1.2. Sơ lược lịch sử hình thành nhóm vi khuẩn acetic 4 1.3. Các chi và loài vi khuẩn acetic 6 1.3.1. Các chi vi khuẩn acetic ít gặp 8 1.3.2. Các chi vi khuẩn acetic có nhiều loài 11 1.4. Vai trò ứng dụng của vi khuẩn acetic 15 1.4.1. Vi khuẩn acetic trong lên men giấm 15 1.4.2. Vi khuẩn acetic trong lên men sản xuất một số thực phẩm và thức uống 16 1.4.3. Vi khuẩn acetic lên men tạo màng cellulose và một số polysaccharide khác 17 1.4.4. Vi khuẩn acetic trong sản xuất vitamin C và một số hợp chất khác 17 1.4.5. Vi khuẩn acetic ứng dụng trong trồng trọt 18 1.5. Các chi và loài vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật 20 1.5.1. Chi Gluconacetobacter 20 1.5.2. Chi Swaminathania 27 1.5.3. Chi Acetobacter 28 1.5.4. Chi Asaia 30 1.5.5. Chi Komagataeibacter 31
v 1.6. Các phương pháp phân loại vi khuẩn acetic 33 1.4.1. Phân loại dựa vào các đặc điểm kiểu hình 34 1.4.2. Phân loại dựa vào đặc điểm hóa học 38 1.4.3. Phân loại dựa vào đặc điểm kiểu gen 39 1.7. Những nghiên cứu liên quan đến đa dạng vi khuẩn acetic ở Việt Nam 44 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 49 2.1. Vật liệu 49 2.1.1. Nguồn mẫu, chủng giống vi sinh vật và thực vật khảo nghiệm 49 2.1.2. Các trình tự DNA mồi 50 2.1.3. Hóa chất, enzyme và sinh phẩm khác 50 2.1.4. Máy móc và thiết bị chính 51 2.2. Phương pháp và bố trí thí nghiệm 51 2.2.1. Tuyển chọn vi khuẩn acetic theo định hướng kích thích sinh trưởng thực vật 51 2.2.2. Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa 52 2.2.3. Khảo sát đặc điểm hóa học 56 2.2.4. Khảo sát đặc điểm di truyền 58 2.2.5. Khảo sát đặc điểm kích thích sinh trưởng thực vật 61 2.2.6. Gửi lưu trữ chủng và gửi trình tự chủng vi khuẩn lên ngân hàng dữ liệu 62 2.2.7. Bố trí thí nghiệm 63 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 65 3.1. Thu thập và phân loại vi khuẩn acetic theo định hướng kích thích sinh trưởng thực vật 65 3.1.1. Thu thập, phân lập và chọn lọc vi khuẩn acetic có khả năng thuộc nhóm kích thích sinh trưởng thực vật 65 3.1.2. Phân tích phát sinh loài phân loại chủng vi khuẩn phân lập 69 3.1.3. Mã tra cứu trình tự các chủng phân lập trên GenBank/EMBL/DDBJ 85 3.1.4. Phân loại vi khuẩn acetic theo định hướng kích thích sinh trưởng thực vật thu thập ở phía nam Việt Nam 86 3.2. Xác định đặc tính kích thích sinh trưởng Nguyenibacter vanlangensis 91 3.2.1. Cố định đạm 91
vi 3.2.2. Chuyển hóa khoáng lân và kẽm về dạng hòa tan 93 3.2.3. Tạo hormone thực vật auxin 96 3.2.4. Tăng cường sự biểu hiện gen pr-1, gen kháng bệnh ở thực vật 97 3.3. Định danh và đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật của chủng phân lập Neoasaia sp. VTH-Ai107 100 3.3.1. Phân loại theo đặc điểm vật chất di truyền 100 3.3.2. Một số ghi nhận về đặc điểm N. chiangmaiensis AC28T và VTH-Ai107 103 3.3.3. Một số đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật của N. chiangmaiensis TBRC 1T và VTH-Ai107 106 3.4. Đặc điểm phân loại hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15; loài mới Acebacter sacchari sp. nov., chủng chuẩn VTH-Ai14T 107 3.4.1. Mối quan hệ phát sinh loài và trình tự gen 16S rRNA và tổ hợp gen dnaK, groEL và rpoB 108 3.4.2. Độ tương đồng DNA-DNA bộ gen và phần trăm thành phần nucleotide 112 3.4.3. Đặc điểm hình thái hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 113 3.4.4. Đặc điểm sinh lý hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 115 3.4.5. Đặc điểm sinh hóa hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 120 3.4.6. Đặc điểm hóa học hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 130 3.4.7. Đặc điểm kích thích sinh trưởng thực vật hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 134 3.4.8. Mã lưu trữ hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 tại các bộ sưu tập vi sinh 137 3.4.9. Loài mới Acetobacter sacchari sp. nov., Vu et al. 2019 138 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 142 Kết luận 142 Kiến nghị 143 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 144 TÀI LIỆU THAM KHẢO 145 PHỤ LỤC PL1 Phụ lục hình PL1 Phụ lục bảng PL6
vii Phụ lục thông tin về các trình tự 16S rDNA đã nộp vào cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/ DDBJ PL7 Phụ lục các trình tự gen giữ nhà dnaK, groEL, rpoB thể hiện ở dạng FASTA trên cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ PL34 Phụ lục chứng nhận cấp mã lưu trữ chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 tại VTCC, BCC/TBRC và NRIC PL37
viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Chữ viết tắt của ARA phân tích phản ứng khử acetylene ma trận thử thay thế ngẫu nhiên đánh giá độ chính xác của nhánh boostrap phát sinh loài DHA dihydroxyacetone DNA acid dideoxyribonucleotide dnaK, groEL, các gen thuộc nhóm gen giữ nhà rpoB EDTA ethylenediaminetetra acetic acid et al. và cộng sự G+C guanine + cytosine GECA môi trường thạch glucose/ethanol/calcium carbonate gen. chi GPS hệ thống định vị toàn cầu GUS β-glucuronidase GYC môi trường glucose/cao nấm men/calcium carbonate HPLC sắc ký lỏng cao áp IAA hormone kích thích sinh trưởng thực vật auxin ITS vùng giữa các gen L. latin LGI môi trường vô đạm do Cavalcante và Döbereiner đề xuất MALDI-Tof MS phương pháp sắc ký khối phổ MALDI-TOF MEGA phân tích di truyền tiến hóa phân tử ML maximum likelihood MP maximum parsimony MUSCLE phương pháp so sánh đa trình tự dựa vào thuật toán kỳ vọng - Log
ix NBRIP một loại môi trường nuôi vi sinh vật làm tan phosphate NCS nghiên cứu sinh nif, fix các hệ gen liên quan hoạt tích cố định đạm ở vi khuẩn NJ neighbor-joining nov. mới PBS đệm muối phosphate PCR phản ứng khuếch đại chuỗi trình tự PR-1 protein 1 liên quan đến tính kháng bệnh ở thực vật Rf hệ số lưu giữ RNA acid ribonucleic RNase ribonuclease SDS sodium dodecyl sulphate sp. loài SSC dung dịch sodium chloride + sodium citrate T chủng chuẩn TE tris-EDTA UQ ubiquinone WGS trình tự toàn bộ bộ gen Tên viết tắt các đơn vị lưu trữ giống vi sinh vật và các cơ sở dữ liệu ATCC Bộ Sưu tập chủng giống Hoa Kỳ BCC Bộ Sưu tập chủng giống BIOTEC, Thái Lan DDBJ CSDL Trình tự DNA, Viện Di truyền Quốc gia, Nhật Bản EMBL Viện Sinh Tin học châu Âu, Vương quốc Anh GenBank Cơ sở dữ liệu trình tự DNA, Hoa Kỳ IFO Bộ Sưu tập chủng giống vi sinh vật thuộc Viện Lên men, Nhật Bản LMG Bộ Sưu tập chủng giống vi sinh vật Vương quốc Bỉ NBRC Trung tâm Quốc gia về Tài nguyên Sinh học, Nhật Bản NCBI Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ Sinh học, Hoa Kỳ NITE Viện Quốc gia về Công nghệ và Đánh giá, Nhật Bản
x NSTDA Cơ quan Quốc gia về Khoa học và Phát triển Công nghệ, Thái Lan TBRC Trung tâm nghiên cứu Tài nguyên Sinh học Thái Lan Ký hiệu viết tắt tên các chi A. Acetobacter Ac. Acidomonas Ar. Arabidopsis As. Asaia G. Gluconobacter Ga. Gluconacetobacter K. Kozakia Ko. Komagataeibacter N. Neoasaia Ne. Neokomagataea Ng. Nguyenibacter S. Swaminathania Sa. Saccharibacter Sw. Swingsia T. Tanticharoenia
xi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các loài trong chi Acetobacter Beijerinck 1898 12 Bảng 1.2. Các loài trong chi Gluconobacter Asai 1935 13 Bảng 1.3. Các loài trong chi Gluconacetobacter Yamada et al. 1998 14 Bảng 1.4. Các loài trong chi Asaia Yamada et al. 1998 14 Bảng 1.5. Các loài trong chi Komagataeibacter Yamada et al. 2013 15 Bảng 1.6. Nguồn phân lập và đặc điểm các vi khuẩn mang đặc tính cố định đạm trong họ Acetobacteraceae 19 Bảng 1.7. Đặc điểm phân biệt giữa các chi vi khuẩn acetic 21 Bảng 1.8. Đặc điểm phân biệt As. spathodeae sp. nov. trong chi Asaia 37 Bảng 1.9. Đặc điểm phân biệt A. oryzifementans sp. nov., A. ascendens sp. nov., comb. nov. với các chủng Acetobacter có quan hệ họ hàng gần 37 Bảng 1.10. Thành phần base và giá trị tương đồng DNA bộ gen giữa chủng chuẩn As. astilbes và các chủng chuẩn Asaia 43 Bảng 1.11. Đặc điểm chung bộ gen và đặc điểm kiểu hình từ kết quả phân tích bộ gen chủng A. ozyzoeni B6T và các chủng chuẩn Acetobacter có họ hàng gần 43 Bảng 1.12. Khác biệt đặc điểm kiểu hình từ kết quả thí nghiệm khảo sát cổ điển chủng A. ozyzoeni B6T và chủng chuẩn của các loài Acetobacter có họ hàng gần 44 Bảng 1.13. Nguồn phân lập và phân loại 100 chủng vi khuẩn acetic thu thập từ các mẫu thu tại khu vực canh tác và các mẫu hoa, quả 46 Bảng 2.1. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu 50 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng khuếch đại các vùng trình tự gen 16S rRNA, dnaK, groEL và rpoB 59 Bảng 3.1. Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm đặc trưng vi khuẩn acetic của 141 chủng phân lập 66 Bảng 3.2. Mức độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA giữa các chủng phân lập và chủng chuẩn Gluconacetobacter có mối quan hệ gần gũi 77 Bảng 3.3. Mức độ tương đồng trình tự gen mã hóa 16S rRNA giữa các chủng phân lập và các chủng Nguyenibacter 81
xii Bảng 3.4. Mã tra cứu một phần hay toàn bộ trình tự gen mã hóa 16S rRNA trên cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ của 141 chủng phân lập 85 Bảng 3.5. Nguồn mẫu phân lập và kết quả định danh 141 chủng phân lập dựa vào phân tích phát sinh loài và tương đồng trình tự gen 16S rRNA 87 Bảng 3.6. Hoạt tính sinh tổng hợp IAA của hai chủng Ng. vanlangensis TN01LGIT và VTH-AC01 97 Bảng 3.7. So sánh khoảng cách nhánh phát sinh loài tính từ điểm phân nhánh giữa chủng VTH-Ai107 và AC28T với S 60-1T và GB 23-2T trên các cây phát sinh loài theo phương pháp NJ, MP và ML 102 Bảng 3.8. Mức độ tương đồng DNA-DNA bộ gen giữa chủng Neoasaia sp. VTH-Ai107 với N. chiangmaiensis AC28T (=TBRC 1T) và K. baliensis NBRC 16664T 102 Bảng 3.9. Hàm lượng IAA do chủng N. chiangmaiensis VTH-Ai107 và TBRC 1T sinh ra sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường LGI 107 Bảng 3.10. Độ tương đồng trình tự gen mã hóa 16S rRNA giữa hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 với các chủng chuẩn ở các nhánh phát sinh loài gần nhất trên cây phát sinh loài xây dựng theo phương pháp ML 109 Bảng 3.11. Mã trình tự các gen dnaK, groEL và rpoB của hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 do ngân hàng dữ liệu Genbank cấp 112 Bảng 3.12. Thành phần G+C và mức độ tương đồng DNA-DNA bộ gen giữa hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 với A. nitrogenifigen RG1T (=TBRC 15T) và A. aceti NBRC 14818T 113 Bảng 3.13. Đặc tính sinh trưởng của VTH-Ai14, VTH-Ai15, NBRC 14818T, TBRC 15T và TN01LGIT ở môi trường chứa 0,0%, 1,0% hoặc 30,0% D-glucose 117 Bảng 3.14. Đặc tính sinh trưởng của VTH-Ai14, VTH-Ai15, NBRC 14818Tvà TBRC 15T trong môi trường chứa 0,0%, 0,5%, 1,0%, 3,0% và 10,0% ethanol 118 Bảng 3.15. Đặc điểm sinh trưởng trong điều kiện pH môi trường khác nhau của các chủng VTH-Ai14, VTH-Ai15, TBRC 15T và NBRC 14818T 118 Bảng 3.16. Đặc tính sinh trưởng của VTH-Ai14, VTH-Ai15, NBRC 14818T và TBRC 15T trong môi trường chứa hàm lượng NaCl khác nhau 119
xiii Bảng 3.17. Đặc điểm sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ môi trường khác nhau của các chủng VTH-Ai14, VTH-Ai15, TBRC 15T và NBRC 14818T 120 Bảng 3.18. Đặc tính sinh polysaccharide dạng levan từ các nguồn carbonhydrate khác nhau của VTH-Ai14, VTH-Ai15, TBRC 15T và NBRC 14818T 121 Bảng 3.19. Đặc tính sinh trưởng của VTH-Ai14, VTH-Ai15, NBRC 14818T, TBRC 15T và TN01LGIT trong môi trường chứa D-mannitol hay glutamate 122 Bảng 3.20. Sinh trưởng của VTH-Ai14, VTH-Ai15, NBRC 14818T và TBRC 15T trong môi trường chứa (NH4)2SO4, ethanol và không có vitamin 124 Bảng 3.21. Đặc điểm sinh acid từ các nguồn carbonhydrate khác nhau của hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 so với hai chủng chuẩn A. nitrogenifigens TBRC 15T và A. aceti NBRC 14818T 127 Bảng 3.22. Đặc điểm sử dụng các nguồn carbonhydrate khác nhau cho sinh trưởng hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 so với hai chủng chuẩn TBRC 15T và NBRC 14818T 129 Bảng 3.23. Đặc điểm thủy giải cấu trúc đại phân tử tinh bột tan và casein của VTH- Ai14, VTH-Ai15, TBRC 15T và NBRC 14818T 130 Bảng 3.24. Chỉ số tương đồng định danh khi so sánh dữ liệu MALDI-TOF MS giữa hai chủng VTH-Ai14, VTH-Ai15 và A. nitrogenifigens TBRC 15T 133 Bảng 3.25. Thành phần acid béo (%) của hai chủng VTH-Ai14, VTH-Ai15 và các chủng có mối quan hệ phát sinh loài gần nhất 133 Bảng 3.26. Hàm lượng IAA do chủng VTH-Ai14, VTH-Ai15, TBRC 15T và PAl5T sinh ra sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường LGI 137 Bảng 3.27. Mã lưu trữ tại hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 ở các bộ sưu tập chủng vi sinh VTCC, BCC, TBRC và NRIC 137 Bảng 3.28. Đặc điểm phân biệt giữa Acetobacter sacchari sp. nov., chủng VTH-Ai14T và VTH-Ai15, với các loài Acetobacter có quan hệ phát sinh loài gần gũi nhất 140
xiv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ của các chi vi khuẩn họ Acetobacteraceae 7 Hình 1.2. Mối quan hệ giữa các loài trong chi Gluconacetobacter và Komagagateibacter dựa trên vùng trình tự 16S rDNA 22 Hình 1.3. Các gen chính trong hệ gen nif và fix ở Ga. diazotrophicus 25 Hình 1.4. Khuẩn lạc các chủng Ga. diazotrophicus phân lập từ cà rốt, củ cải đỏ, củ dền đỏ và cà phê sau 74h nuôi cấy trên môi trường LGI 25 Hình 1.5. Vòng tan lân chung quanh khuẩn lạc chủng Ga. diazotrophicus PAl5T trên môi trường chứa 5g/l muối lân Ca3(PO4)2, Ca5(PO4)3OH và FePO4 26 Hình 1.6. Vòng tan kẽm của các chủng Ga. diazotrophicus R10, PA15T và L3 trên môi trường LGI chứa 10 g/1 glucose bổ sung 0,1% ZnO, ZnCO3 hay Zn3(PO4)2 26 Hình 1.7. Mối quan hệ phát sinh loài trong chi Acetobacter dựa theo trình tự vùng 16S rDNA 28 Hình 1.8. Hình ảnh hiển vi chùm tiên mao ở các chủng Gluconobacter do Asai et al. ghi nhận 36 Hình 1.9. Thành phần acid béo chính trong tế bào chủng G. oxydans NCIB 9013 và A. aceti IFO 3283 38 Hình 1.10. Cây phát sinh loài trình tự gen 16S rDNA trong công bố chi mới Asaia 40 Hình 1.11. Cây phát sinh loài vùng trình tự các gen dnaK, groEL và rpoB trong công bố đề xuất loài mới A. sicerae 41 Hình 1.12. Các chủng Acetobacter VTH-AE75, VTH-AH37, VTH-Ai14 và VTH-Ai15 hình thành 3 nhánh riêng biệt có khả năng là 3 loài mới 47 Hình 2.1. Bố trí thí nghiệm thu thập và phân loại vi khuẩn acetic có tiềm năng thuộc nhóm kích thích sinh trưởng thực vật 63 Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu xác định loài Ng. vanglangensis cũng là vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật 64 Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm phân loại Neosaia sp. VTH-Ai107 và đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật N. chiangmaiensis 64
xv Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm phân loại và đề xuất loài mới đối với hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 64 Hình 3.1. Khuẩn lạc trên môi trường GECA làm tan CaCO3, trạng thái Gram quan sát kính hiển vi quang học (x100) và đặc tính oxy hóa/lên men của chủng VTH-Ai96 69 Hình 3.2. Quan hệ phát sinh loài của các chủng phân lập liên quan đến chi Acetobacter 71 Hình 3.3. Quan hệ phát sinh loài của các chủng Acetobacter 72 Hình 3.4. Mối quan hệ phát sinh loài của các chủng phân lập liên quan đến chi Gluconacetobacter và Nguyenibacter 73 Hình 3.5. Mối quan hệ phát sinh loài của các chủng phân lập thuộc nhánh phát sinh loài Gluconacetobacter ở Hình 3.4 74 Hình 3.6. Quan hệ phát sinh loài của các chủng Gluconacetobacter 76 Hình 3.7. Mối quan hệ phát sinh loài của các chủng phân lập thuộc nhánh phát sinh loài Nguyenibacter ở Hình 3.4 79 Hình 3.8. Quan hệ phát sinh loài của các chủng Nguyenibacter 80 Hình 3.9. Mối quan hệ phát sinh loài của các chủng phân lập liên quan đến chi Asaia và Neoasaia 82 Hình 3.10. Quan hệ phát sinh loài của các chủng Asaia và Neoasaia 83 Hình 3.11. Mối quan hệ phát sinh loài của các chủng phân lập liên quan đến chi Tanticharoenia 84 Hình 3.12. Sinh khối màu vàng cam đặc trưng ở thạch LGI của hai chủng TN01LGIT và VTH-AC01 92 Hình 3.13. Vùng tan lân trên đĩa thạch bổ sung 0,1% Ca3(PO4)2 tạo bởi hai chủng TN01LGIT và VTH-AC01 ở ngày nuôi cấy thứ 3 93 Hình 3.14. Vùng tan kẽm trên đĩa thạch bổ sung 0,1% ZnO tạo bởi hai chủng TN01LGIT và VTH-AC01 ở ngày nuôi cấy thứ 3 94 Hình 3.15. Đồ thị chuyển hóa lân thành dạng tan của hai chủng Ng. vanlangensis TN01LGIT và VTH-AC01 trong 5 ngày nuôi cấy ở môi trường lỏng Pikovskaya chứa Ca3(PO4)2 (0,5%) 95
xvi Hình 3.16. Hai chủng Ng. vanlangensis TN01LGIT và VTH-AC01 kích hoạt sự biểu hiện gen gus ở cây Ar. thaliana PR1::Gus một tuần tuổi 99 Hình 3.17. Quan hệ phát sinh loài của chủng Neoasaia sp. VTH-Ai107. Cây phát sinh loài được xây dựng theo phương pháp NJ, MP và ML với 1.393 base gen mã hóa 16S rRNA 101 Hình 3.18. Hình thái khuẩn lạc chủng N. chiangmaiensis TBRC 1T và VTH-Ai107 sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường GECA ở 30C 103 Hình 3.19. Tế bào chủng N. chiangmaiensis TBRC 1T và VTH-Ai107 với chu mao quan sát bằng kính hiển vi quang học 104 Hình 3.20. So sánh đặc tính sinh polysaccharide dạng levan giữa chủng VTH-Ai107, N. chiangmaiensis TBRC 1T, A. aceti NBRC 14818T và Ng. vanlangensis TN01LGIT ở ngày nuôi cấy thứ 3 và thứ 5 104 Hình 3.21. So sánh đặc tính sinh sắc tố tan màu nâu của các chủng VTH-Ai107, N. chiangmaiensis TBRC 1T, Ga. diazotrophicus PAl5T và Ng. vanlangensis TN01LGIT 105 Hình 3.22. Sinh khối hai chủng N. chiangmaiensis VTH-Ai107 và TBRC 1T trên đĩa thạch LGI sau 7 ngày ủ ở 30C 106 Hình 3.23. Mối quan hệ phát sinh loài của hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 trong chi Acetobacter 108 Hình 3.24. Vị trí phát sinh loài hai chủng VTH-Ai14T và VTH-Ai15 trong chi Acetobacter ở cây phát sinh loài tổ hợp một phần gen dnaK, groEL và rpoB 111 Hình 3.25. Tế bào hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 khi nhuộm đơn với tím kết tinh quan sát bằng kính hiển vi quang học 114 Hình 3.26. Đặc điểm tiên mao của A. nitrogenifigens TBRC 15T và Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 114 Hình 3.27. Hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 sinh trưởng tạo độ đục sinh khối trong môi trường pH3,5 115 Hình 3.28. Hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 sinh trưởng tốt hơn chủng chuẩn A. nitrogenifigens và A. aceti trong môi trường chứa 0,35% acid acetic 116 Hình 3.29. Hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 oxy hóa mạnh acetate và lactate 120
xvii Hình 3.30. Đặc tính sinh sắc tố tan trong môi trường của Acetobater sp. VTH-Ai14, VTH-Ai15 và A. nitrogenifigens TBRC 15T 122 Hình 3.31. Đặc tính sinh -pyrone từ D-glucose của hai chủng khảo sát VTH-Ai14 và VTH-Ai15 123 Hình 3.32. Đặc tính sinh dihydroxyacetone từ quá trình chuyển hóa glycerol của các chủng VTH-Ai14, VTH-Ai15, TN01LGIT, NBRC 14818T và TBRC 15T 124 Hình 3.33. Kết quả chạy sắc ký xác định đặc tính sinh acid ketogluconic của hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 125 Hình 3.34. Sự oxy hóa ethanol sinh acid trong môi trường nuôi cấy VTH-Ai14, VTH- 15, TBRC 15T và NBRC 14818T ở ngày nuôi cấy thứ 2 128 Hình 3.35. Sự oxy hóa vượt mức ethanol trong môi trường nuôi cấy VTH-Ai14, VTH- 15, TBRC 15T và NBRC 14818T ở ngày nuôi cấy thứ 9 128 Hình 3.36. Kết quả chạy sắc ký xác thành phần ubiquinone chính của hai chủng Acetobacter sp. VTH-Ai14 và VTH-Ai15 131 Hình 3.37. So sánh dữ liệu khối phổ MALDI-TOF giữa các chủng VTH-Ai14 (=BCC 67843), VTH-Ai15 (=BCC 67844) và A. nitrogenifigens TBRC 15T 132 Hình 3.38. Sự hình thành sinh khối của chủng TN01LGIT, TBRC 14818T, VTH-Ai14, VTH-Ai15 và TBRC 15T ở lần cấy chuyền thứ 4 trong môi trường LGI bán rắn và trên môi trường thạch LGI 134 Hình 3.39. Sự hình thành vùng tan Ca3(PO4)2 do chủng TN01LGIT, TBRC 15T, VTH- Ai14 và VTH-Ai15 trên môi trường thạch Pikovskaya 135 Hình 3.40. Sự hình thành vùng tan ZnO do chủng TBRC 15T, NBRC 14818T, VTH- Ai14 và VTH-Ai15 trên môi trường thạch LGI chứa 1% D-glucose và 1% sucrose 136
1 MỞ ĐẦU Việt Nam là một trong những nước có mức độ đa dạng sinh học cao đồng thời mức độ đa dạng sinh học cũng đối mặt với nhiều thách thức. Xác định tầm quan trọng việc bảo tồn đa dạng sinh học, Quốc hội đã ban hành Luật Đa dạng sinh học vào năm 2008. Theo Luật Đa dạng sinh học, các nghiên cứu về đa dạng sinh học bao gồm việc điều tra, thu thập, đánh giá, cung cấp thông tin về nguồn gen và lưu giữ, bảo quản mẫu di truyền góp phần bảo tồn đa dạng sinh học và được khuyến khích nghiên cứu. Vi khuẩn acetic là một nhóm vi sinh vật có vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, hóa học và nông nghiệp. Vi khuẩn acetic có khả năng ứng dụng trong nông nghiệp gồm một số loài thuộc các chi Acetobacter, Gluconacetobacter, Swaminathania, Asaia và Komagataeibacter thuộc nhóm kích thích sinh trưởng thực vật. Các nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn acetic kích thích thích sinh trưởng thực vật trên thế giới đã cung cấp nhiều dữ liệu và nguồn gen cho ngành công nghiệp sản xuất phân bón vi sinh phục vụ phát triển nông nghiệp xanh bền vững kết hợp với bảo vệ môi trường. Vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật thường được tìm thấy ở cây lúa, mía và một số cây trồng khác như bắp, cà phê, dứa,... là những loại cây trồng chủ lực hoặc phổ biến ở Việt Nam. Ngoài ra, vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật chủ yếu được phát hiện mới và tìm thấy ở các nước cũng có khí hậu nhiệt đới như Brazil, Ấn Độ và Indonesia. Dù chưa có nghiên cứu thu thập nguồn gen, phân loại và định danh đối với vi khuẩn acetic có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp, ở Việt Nam đã có một số công trình chứng minh được hiệu quả làm phân bón vi sinh của Gluconacetobacter sp., một đại diện trong nhóm vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật, trên cây mía và lúa ở một số tỉnh phía Nam. Trong những nghiên cứu trước đây về vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật thì thường tập trung đối tượng nấm Gibberella, vi khuẩn cố định đạm bao gồm Rhizobium, Azotobacter và Azospirillium. Tuy nhiên, những khảo sát bước đầu về đa dạng vi khuẩn acetic tại Việt Nam đã phát hiện hai đơn vị phân loại vi khuẩn acetic mới và thu thập một số chủng có khả năng thuộc nhóm kích thích sinh trưởng thực vật từ đất,