Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo cây đậu tương (Glycine max L.) biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin chuyên biệt ở hạt

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:162

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Nghiên cứu tạo cây đậu tương (Glycine max L.) biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin chuyên biệt ở hạt" trình bày việc tạo được dòng đậu tương biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin ở hạt thông qua phƣơng pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo cây đậu tương (Glycine max L.) biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin chuyên biệt ở hạt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- HOÀNG VĂN DƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG (Glycine max L.) BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ASTAXANTHIN CHUYÊN BIỆT Ở HẠT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP. HỒ CHÍ MINH - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- HOÀNG VĂN DƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG (Glycine max L.) BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ASTAXANTHIN CHUYÊN BIỆT Ở HẠT Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Nguyễn Hữu Hổ 2. TS. Phan Tƣờng Lộc TP. HỒ CHÍ MINH - 2022
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hữu Hổ và TS. Phan Tƣờng Lộc. Nội dung nghiên cứu và các kết quả trong đề tài này hoàn toàn trung thực. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu chƣa từng đƣợc sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc trích dẫn nguồn gốc rõ ràng. Một phần trong kết quả nghiên cứu của đề tài này đã đƣợc công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành trong nƣớc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về sự cam đoan này. Hoàng Văn Dƣơng
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận Án này, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự động viên, giúp đỡ từ Thầy Cô, Gia Đình và Bạn Bè. Xin bày tỏ và gửi lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến: - Thầy - TS. Nguyễn Hữu Hổ đã tận tình hƣớng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận án. - TS. Phan Tƣờng Lộc - Anh vừa là ngƣời Thầy luôn theo sát, tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận án. - Thầy Lê Tấn Đức đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. - Các quý Thầy Cô ở Học Viện Khoa Học Công Nghệ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. - Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này. - Các bạn đồng nghiệp phòng Công Nghệ Gen và các bạn sinh viên đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua. - Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Gia Đình đã luôn sát cánh, ủng hộ, giúp đỡ tôi trong những năm học vừa qua cũng nhƣ trên mỗi bƣớc đƣờng trƣởng thành trong cuộc sống. Hoàng Văn Dƣơng
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................ vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ...................................................................... viii TÓM TẮT ....................................................................................................................... 1 MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 5 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 8 1.1. Chuyển hóa tạo carotenoid ở thực vật ...................................................................... 8 1.1.1. Sinh tổng hợp và tích trữ carotenoid ..................................................................... 8 1.1.2. Thay đổi chuyển hóa sinh tổng hợp carotenoid .................................................. 10 1.1.3. Tổng quan về astaxanthin.................................................................................... 11 1.2. Biến đổi gen thực vật ............................................................................................. 19 1.2.1. Chuyển gen vào thực vật sử dụng Agrobacterium tumefaciens.......................... 19 1.2.2. Sử dụng promoter trong công nghệ chuyển gen thực vật ................................... 22 1.2.3. Sự di truyền của gen biến nạp trong cây chuyển gen.......................................... 26 1.3. Nghiên cứu phát sinh hình thái và biến đổi gen đậu tƣơng ................................... 27 1.3.1. Giới thiệu chung về cây đậu tƣơng ..................................................................... 27 1.3.2. Nghiên cứu phát sinh hình thái ở đậu tƣơng ....................................................... 29 1.3.3. Nghiên cứu biến đổi gen đậu tƣơng .................................................................... 35 1.4. Cách tiếp cận của đề tài .......................................................................................... 43 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 46 2.1. Vật liệu .................................................................................................................. 46 2.1.1. Giống đậu tƣơng.................................................................................................. 46 2.1.2. Chủng vi khuẩn, plasmid..................................................................................... 46 2.1.3. Kim châm để tạo vết thƣơng cho mẫu chuyển gen ............................................. 47 2.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy mô...................................................................................... 47 2.1.5. Hóa chất trong các thí nghiệm khác .................................................................... 48 2.1.6. Thiết bị sử dụng .................................................................................................. 49 2.2. Nội dung và Phƣơng pháp ...................................................................................... 50 Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và một nửa hạt. .......................................................................................................... 50 2.2.1. Tuyển chọn giống đậu tƣơng .............................................................................. 50 2.2.2. Khử trùng hạt ...................................................................................................... 50
iv 2.2.3. Ảnh hƣởng của BA lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm và một nửa hạt ............ 51 2.2.4. Ảnh hƣởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro ............................................ 52 Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng ....................................................................... 53 2.2.5. Ảnh hƣởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt ....... 53 2.2.6. Ảnh hƣởng của PPT lên sự sinh trƣởng của chồi in vitro ................................... 53 2.2.7. Ảnh hƣởng của việc tạo vết thƣơng bằng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm...................................................................................................... 53 2.2.8. Ảnh hƣởng của việc tạo vết thƣơng bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng .............................................................. 54 2.2.9. Ảnh hƣởng của việc tạo vết thƣơng bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng.............................................. 55 Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tƣơng chuyển gen. .... 55 2.2.10. Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST ..... 55 2.2.11. Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng ...................................................... 57 2.2.12. Kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR ................................................................. 58 2.2.13. Kiểm tra cây chuyển gen bằng Southern blot ................................................... 60 2.2.14. Phân tích hàm lƣợng astaxanthin trong hạt ....................................................... 62 2.2.15. Đánh giá các giai đoạn sinh trƣởng cây chuyển gen trong điều kiện ex vitro....................................................................................................................... 62 2.2.16. Xử lý thống kê ................................................................................................... 63 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 64 Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và một nửa hạt. .......................................................................................................... 64 3.1. Tuyển chọn các giống đậu tƣơng ........................................................................... 64 3.2. Hiệu quả của các phƣơng pháp khử trùng hạt đậu tƣơng ...................................... 66 3.3. Ảnh hƣởng của BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt....................... 67 3.4. Ảnh hƣởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro ............................................... 73 Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng ....................................................................... 75 3.5. Ảnh hƣởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt .......... 75 3.6. Ảnh hƣởng của PPT lên sự sinh trƣởng của chồi in vitro ...................................... 78 3.7. Ảnh hƣởng việc tạo vết thƣơng bằng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm .................................................................................................................. 79 3.8. Ảnh hƣởng của việc tạo vết thƣơng bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên
v hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng (giống MTĐ 176) ................................. 80 3.9. Ảnh hƣởng của việc tạo vết thƣơng bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng.............................................. 83 Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tƣơng chuyển gen. .... 85 3.10. Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST ........ 85 3.11. Chuyển gen tạo cây đậu tƣơng có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt ...................................................................................................................... 87 3.11.1. Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng kim châm tạo vết thƣơng mẫu ........................................................................................................... 87 3.11.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng dao mổ kết hợp sóng siêu âm, thấm chân không tạo vết thƣơng mẫu .................................................... 93 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................................... 111 DANH MỤC CÔNG TRÌNH...................................................................................... 113 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 114 PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 1
vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BA Benzyl Adenine CBFD Carotenoid β-ring 4-dehydrogenase GGPP Geranylgeranyl Pyrophosphate H Hour HBFD Carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase HPLC High-performance liquid chromatography IAA Indole-3-acetic acid IBA Indole-3-butyric acid KT Kinetin NAA α-naphthylacetic acid NXS Neoxanthin synthase PCR Polymerase Chain Reaction PDS Phytoene desaturase PPT Phosphinothricin PSY Phytoene synthase QC1 Qui cách 1 QC2 Qui cách 2 S Second SAAT Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation TDZ Thidiazuron VDE Violaxanthin deepoxidase ZDS Zeta-carotene desaturase ZEP Zeaxanthin epoxidase β-LCY β Lycopene cyclase ε-LCY ε Lycopene cyclase
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Nguồn gốc và một số đặc điểm của các giống đậu tƣơng đƣợc sử dụng. .................................................................................................................46 Bảng 2.2. Thành phần các loại môi trƣờng nuôi cấy mô và chuyển gen ..................47 Bảng 3.1. Kiểm tra thành phần β-carotene ở các giống đậu tƣơng. ..........................65 Bảng 3.2. Tỉ lệ nảy mầm ở các giống đậu tƣơng ......................................................65 Bảng 3.3. Tỉ lệ hạt đậu tƣơng không nhiễm và nảy mầm khi khử trùng bằng dung dịch Javel hoặc khí clo. ....................................................................................67 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt giống MTĐ 176 ...................................................................................68 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt giống HL 07-15 ...................................................................................70 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt giống OMĐN 29 ..................................................................................71 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi đậu tƣơng in vitro .........75 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng PPT lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm. ..............................76 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của PPT lên khả năng sống của chồi in vitro. .......................78 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của việc sử dụng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm .....................................................................................80 ảng 3 11 Tỉ lệ mẫu dƣơng tính GUS khi xử l sóng siêu âm ở các thời gian khác nhau...................................................................................................................82 ảng 3 12 Tỉ lệ đốt lá mầm dƣơng tính GUS khi xử l áp lực âm ở các thời gian khác nhau. .........................................................................................................84 Bảng 3.13. Kết quả thu nhận hạt của các dòng chuyển gen D2 và D8 ở thế hệ T1 103 Bảng 3.14. Kết quả định lƣợng astaxanthin trong hạt của các dòng chuyển gen ...106 Bảng 3.15. So sánh một số đặc điểm của cây chuyển gen và đối chứng. ...............109
viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Sơ đồ con đƣờng sinh tổng hợp carotenoid [19] .........................................9 Hình 1.2. Bột astaxanthin [36] ..................................................................................11 Hình 1.3. So sánh khả năng chống gốc oxy tự do có hại cho cơ thể của một số chất chống oxy hóa [43] ...................................................................................12 Hình 1.4. Vị trí của phân tử astaxanthin trong màng tế bào [40]..............................13 Hình 1.5. Qui mô thị trƣờng astaxanthin đến năm 2022 [4] .....................................13 Hình 1.6. Con đƣờng chuyển hoá tạo astaxanthin ở Adonis aestivalis [6] ...............15 Hình 1.7. Con đƣờng tổng hợp astaxanthin ở một số loài khác nhau [6][57]...........16 Hình. 1.8. Sơ đồ chuyển hóa tạo astaxanthin trên đậu tƣơng khi đƣợc biến nạp các gen mã hóa phytoene synthase và ketolase [63]. .......................................18 Hình 1.9. Vi khuẩn A. tumefaciens bám trên bề mặt tế bào thực vật [71] ................20 Hình 1.10. Vi khuẩn A. tumefaciens gây khối u trên thực vật [72]..........................20 Hình 1.11. Sự ức chế của phosphinothricin lên hoạt động của enzyme ...................21 Hình 1.12. Phản ứng của X-Gluc với -glucuronidase [77] .....................................22 Hình 1.13. Mô hình cơ bản về cấu trúc và điều hòa phiên mã của gen mã hóa protein [79] .......................................................................................................23 Hình 1.14. Cây đậu tƣơng .........................................................................................27 Hình 1.15. Sản lƣợng của 6 nƣớc sản xuất đậu tƣơng lớn nhất [94] ........................28 Hình 1.16. Cấu trúc plasmid pITB-AST ...................................................................45 Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc chuẩn bị mẫu đốt lá mầm ................................................51 Hình 2.2. Sơ đồ các bƣớc chuẩn bị mẫu một nửa hạt ...............................................52 Hình 2.3. Minh họa kích thƣớc theo chiều dài, rộng, dày của hạt đậu tƣơng ...........63 Hình 3.1. Hạt đậu tƣơng nảy mầm sau 5 ngày ..........................................................65 Hình 3.2. Hạt đậu tƣơng (HL 07-15) nảy mầm 5 ngày sau khi khử trùng . ..............67 Hình 3.3. Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống MTĐ 176 ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy. .........................................................................69 Hình 3.4. Sự đáp ứng của đốt lá mầm và một nửa hạt của giống MTĐ 176 ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy. ....................................................69 Hình 3.5. Sự hình thành chồi của mẫu một nửa hạt giống MTĐ 176 ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy. .............................................................70
ix Hình 3.6. Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống HL 07-15 ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy. .........................................................................71 Hình 3.7. Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống OMĐN 29 ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy. ..................................................................72 Hình 3.8. Sự tạo rễ của chồi in vitro của các giống MTĐ 176, HL 07-15 và OMĐN 29 ở các nồng độ IBA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy. .......................74 Hình 3.9. Sự tái sinh của đốt lá mầm giống MTĐ 176 trên môi trƣờng có PPT. .....77 Hình 3.10. Sự sinh trƣởng đoạn thân giống MTĐ 176 trên môi trƣờng có PPT. .....79 Hình 3.11. Ảnh hƣởng của số lần châm đến khả năng tái sinh của đốt lá mầm giống MTĐ 176 ................................................................................................80 nh 3 12. Mẫu dƣơng tính GUS khi xử l sóng siêu âm ở các thời gian khác nhau. .................................................................................................................82 nh 3 13 Mẫu dƣơng tính GUS khi xử l áp lực âm ở các thời gian khác nhau....83 Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid ly trích từ E. coli. .......................85 Hình 3.15. Các khuẩn lạc vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens biến nạp sau khi ủ qua đêm trên môi trƣờng có kháng sinh. .......................................................86 Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen hbfd1 từ plasmid của vi khuẩn E. coli và A. tumefaciens. ......................................................................................86 Hình 3.17. Vật liệu chuyển gen và các giai đoạn phát triển cây chuyển gen. ..........88 Hình 3.18. Kiểm tra sự hiện diện của gen bar ở các cây kháng PPT bằng PCR. ....89 Hình 3.19. Kiểm tra sự hiện diện của gen hbfd1 ở các cây kháng PPT bằng PCR. .90 Hình 3.20. Kết quả phân tích DNA cây đậu tƣơng chuyển gen bằng Southern blot ....................................................................................................................91 Hình 3.22. Kiểm tra sự hiện diện của gen bar ở các cây kháng PPT bằng PCR. ....95 Hình 3.23. Kiểm tra sự hiện diện của gen cbfd2 ở các cây kháng PPT bằng PCR. .96 Hình 3.24. Kiểm tra sự hiện diện của gen hbfd1 ở các cây kháng PPT bằng PCR. .97 Hình 3.25. Kiểm tra sự hiện diện của gen Zm-psy ở các cây kháng PPT bằng PCR...................................................................................................................97 Hình 3.26. Kết quả phân tích DNA cây đậu tƣơng chuyển gen bằng Southern blot ....................................................................................................................99 Hình 3.27. Lá cây đối chứng và chuyển gen sau 7 ngày quét dung dịch Basta ....100 Hình 3.28. Dòng chuyển gen D2 (a) và D8 (b) phát triển ngoài vƣờn ƣơm ...........101 Hình 3.29. Hạt màu đỏ của dòng D2 và D8 ............................................................101 Hình 3.30. Các giai đoạn phát triển của cây chuyển gen trồng từ hạt ....................102
x Hình 3.31. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen biến nạp ở các dòng T1. ..............102 Hình 3.32. Thử nghiệm quét Basta trên lá cây chuyển gen và đối chứng. .............103 Hình 3.33. Các hạt chuyển gen biểu hiện màu đỏ không đồng đều ........................104 Hình 3.34. Hạt của các dòng chuyển gen T2 ..........................................................105 Hình 3.35. Phổ ESI-MS của chuẩn astaxanthin ......................................................107 108 Hình 3.36. Phổ ESI-MS của mẫu ly trích từ hạt dòng D2-1 ...................................108 Hình 3.37. Phổ ESI-MS của mẫu ly trích từ hạt dòng D8-1 ...................................108 Hình 3.38. So sánh kiểu hình cây chuyển gen và cây đối chứng. ...........................110
1 TÓM TẮT Hiện nay, ứng dụng công nghệ gen để cải tạo giống cây trồng, tạo giống đã và đang đạt đƣợc nhiều thành tựu với ngày càng nhiều giống cây mới đƣợc tạo ra, đƣa vào sản xuất. Một trong những ƣu điểm nổi bật của công nghệ này là trong thời gian ngắn so với lai tạo giống truyền thống, giúp tạo đƣợc giống mới với nhiều đặc tính vƣợt trội, có thể gồm những đặc tính từ các sinh vật khác loài. Trong nghiên cứu này, chúng tôi hƣớng tới tạo giống đậu tƣơng mang các gen ngoại lai từ cây hoa Adonis aestivalis nhằm tạo đƣợc astaxanthin, một hợp chất có giá trị kinh tế và ứng dụng cao, chuyên biệt ở hạt. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc sử dụng để chuyển vào đậu tƣơng cấu trúc gen gồm: gen cbfd, hbfd đóng vai trò chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin; gen zm-psy từ ngô giúp tăng cƣờng con đƣờng tổng hợp β-carotene, gen chọn lọc bar, với chất chọn lọc là phosphinothricin (PPT). Nhiều yếu tố đƣợc khảo sát nhằm tối ƣu con đƣờng nuôi cấy mô, chọn lọc thể chuyển gen, và nâng cao hiệu quả chuyển gen. Các khảo sát cụ thể gồm: khảo sát các phƣơng pháp khử trùng hạt bằng khí clo và nƣớc Javel; tìm nồng độ BA thích hợp để cảm ứng tạo chồi cho mẫu đốt lá mầm, một nửa hạt; nồng độ IBA thích hợp để cảm ứng tạo rễ cho chồi in vitro; nồng độ PPT tối ƣu cho giai đoạn chọn lọc chồi và duy trì áp lực chọn lọc ở giai đoạn tạo rễ, phát triển cây; phƣơng pháp tạo vết thƣơng mẫu thích hợp sử dụng dao mổ, kim châm nhiều mũi, sóng siêu âm, thấm hút chân không. Sau đó, kết quả tối ƣu từ các thí nghiệm này đƣợc áp dụng cho giai đoạn chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng. Thể chuyển gen trong nghiên cứu đƣợc xác định bƣớc đầu bằng phƣơng pháp PCR, tiếp theo khẳng định sự gắn chèn bền vững của gen bằng phƣơng pháp Southern blot. Các dòng chuyển gen phát triển trong vƣờn ƣơm sẽ đƣợc thử nghiệm tính kháng thuốc diệt cỏ Basta, nhằm kiểm tra biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen. Sự di truyền của gen biến nạp qua các thế hệ đƣợc kiểm tra bằng PCR và thử nghiệm với Basta. Hàm lƣợng astaxanthin trong hạt đậu tƣơng đƣợc ghi nhận bằng phƣơng pháp HPLC-MS. Ngoài ra, cây chuyển gen ở thế hệ T0, T1 và cây đối chứng không chuyển gen cũng đƣợc so sánh các chỉ tiêu kiểu hình và năng suất hạt. Những kết quả chính đạt đƣợc nhƣ sau. Thu thập đƣợc 7 giống đậu tƣơng, các giống này đƣợc kiểm tra và xác nhận có sự hiện diện của β-carotene trong hạt bằng HPLC, đây là cơ
2 chất ban đầu, điều kiện cần thiết để tổng hợp astaxanthin. Các giống đậu tƣơng MTĐ 176, HL 07-15 và OMĐN 29 đƣợc ghi nhận có khả năng nảy mầm cao, sức sống tốt, lá mầm không bị nứt, vỡ nên đƣợc chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Khảo sát khử trùng hạt đậu tƣơng bằng khí clo trong 16 h cho thấy hiệu quả khử trùng tốt nhất. Mẫu đốt lá mầm và một nửa hạt đƣợc cảm ứng tạo chồi tốt nhất với môi trƣờng bổ sung 2 mg/l BA, chồi tạo rễ tốt nhất khi bổ sung IBA 1 mg/l với giống MTĐ 176; HL 07-15 và 1,5 mg/l với giống OMĐN 29, chất chọn lọc PPT ở nồng độ 6 mg/l phù hợp để chọn lọc thể chuyển gen với giống MTĐ 176 và 5 mg/l cho giống HL 07-15; OMĐN 29. Các kết quả khảo sát tạo vết thƣơng mẫu cho thấy sử dụng phƣơng pháp tạo vết thƣơng mẫu thích hợp giúp tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen, cụ thể với khả năng biến nạp cấu trúc gen tạo astaxanthin vào giống đậu tƣơng MTĐ 176: dùng kim châm đâm nhẹ 3 lần để thay thế dao mổ tạo vết thƣơng cho vùng đốt lá mầm đã tăng hiệu quả chuyển gen từ 0,33% lên 1%; kết hợp sử dụng sóng siêu âm 30s; thấm chân không 60s ở áp lực -20 in Hg trong quá trình tạo vết thƣơng mẫu đốt lá mầm cũng giúp tăng hiệu quả chuyển gen từ 0,67 % lên 2%. Nghiên cứu đã tạo đƣợc nhiều dòng đậu tƣơng chuyển gen, trong đó hai dòng có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt và di truyền gen chuyển cho các thế hệ tiếp theo. Hàm lƣợng astaxanthin trong hạt thế hệ T1 của hai dòng đậu tƣơng chuyển gen lần lƣợt là 0,31 µg/g (D2) và 0,77 µg/g (D8). Trong các giai đoạn sinh trƣởng, phát triển cũng nhƣ năng suất hạt cho thấy cây chuyển gen và đối chứng không có nhiều khác biệt. Nhƣ vậy, đề tài đã tạo đƣợc các dòng đậu tƣơng có khả năng sản xuất astaxanthin ở hạt, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo để ứng dụng tạo các sản phẩm có giá trị ứng dụng thực tế. ABSTRACT Currently, application of gene technology to improve plant varieties has been achieving many achievements with more and more new plant varieties being created and put into production. One of outstanding advantages of this technology is that in a short time compared to conventional crossbreeding, it helps to create new varieties with many superb characteristics, which may include those from other organisms. In this study, we aimed to produce soybean lines carrying foreign genes
3 from the red flowered-Adonis aestivalis to produce seed-specific astaxanthin, a compound with high economic and application value. Method of Agrobacterium-mediated genetic transformation was used to transfer into soybean the genetic structure including: cbfd, hbfd gene, play the role of converting β-carotene into astaxanthin; zm-psy gene from corn, enhances the synthesis of β- carotene; bar-selective gene, with the selective agent phosphinothricin (PPT). Many factors were investigated to optimize tissue culture pathways, selection of transgenics, and transformation efficiency. Specific surveys include: methods of sterilizing seeds with chlorine gas and Javel detergent; appropriate concentrations of BA to induce shoot regeneration for cotyledonary node, half seed explant; suitable concentrations of IBA to induce rooting of in vitro shoots; optimal concentrations of PPT for transgenic shoot selection and maintenance of selective pressure at rooting and plant development stages; appropriate method of wounding explants using scalpel, multi-needle, ultrasound, vacuum infiltration. The optimal results from these experiments were then applied to generate transgenic soybean lines producing astaxanthin. Transformants in this study were initially determined by PCR, followed by the confirmation of stable insertion of the transgenes by Southern blot method. Transgenic lines grown in greenhouse will be tested for resistance to Basta herbicide, to check the expression of bar gene in transgenic plants. Inheritance of transgenes across generations was checked by PCR and herbicide leaf painting assay. Astaxanthin content in soybean seeds was analyzed by HPLC-MS method. In addition, the transgenic plants in the T0, T1 generation and the non-transgenic control plants were also compared for phenotypic parameters and seed yield. The main results obtained are as follows. Collected 7 soybean varieties, these varieties were tested and confirmed for the presence of β-carotene in seeds by HPLC, which is the initial substrate, necessary condition for astaxanthin synthesis. Soybean varieties MTD 176, HL 07-15 and OMDN 29 were recorded with high germination ability, good vigor, and cotyledons were not cracked or broken, so they were selected for further studies. Sterilizing of soybean seeds with chlorine gas for 16 h showed the best sterilization effect. Cotyledonary node and half seed explants were best induced to produce shoots in the medium supplemented with 2 mg/l BA;
4 The best rooting efficiency was achieved in 1 mg/l IBA with the MTD 176; HL 07- 15 varieties and 1.5 mg/l for OMDN 29 variety; PPT selective agent at a concentration of 6 mg/l is suitable for selecting transformants with variety MTD 176 and 5 mg/l for HL 07-15; OMDN 29. The results of the appropriate wounding survey showed that using proper explant wounding method significantly increased efficiency of gene transfer, specifically, in transferring astaxanthin biosynthesis genes into MTD 176 soybean variety: puncturing 3 times with multi- needle to replace scalpel for wounding MTD 176 cotyledonary node has increased the transformation efficiency from 0.33% to 1%; combined use of 30s ultrasound; 60s vacuum infiltration at -20 in Hg during wounding of cotyledonary nodes also increased efficiency of gene transfer from 0.67% to 2%. This study generated many transgenic soybean, in which, two lines have ability to produce seed-specific astaxanthin and pass astaxanthin biosynthesis genes to next generations. Astaxanthin content in the T1 generation seeds of two transgenic soybean lines was 0.31 µg/g (D2) and 0.77 µg/g (D8), respectively. In stages of growth, development as well as seed yield, there was not much differences between transgenic and control plants. Thus, this research has gernerated value-added soybean lines capable of producing astaxanthin in seeds, serving as a basis for further studies to create products with practical applications.
5 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Astaxanthin (C40H52O4) là một loại carotenoid màu đỏ, trong tự nhiên đƣợc tìm thấy ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh astaxanthin có tác dụng vƣợt trội trong lĩnh vực chăm sóc, bảo vệ sức khỏe nhƣ chống oxy hóa, bảo vệ DNA, tăng cƣờng miễn dịch, hỗ trợ điều trị tiểu đƣờng, tim mạch, thần kinh...[1][2]. Hiện nay, sản phẩm bổ sung astaxanthin đã lƣu hành phổ biến trên thị trƣờng gồm viên nang, bột, kem bảo vệ da, gel... Ngoài ra, ngành chăn nuôi, thủy sản cũng tiêu thụ khối lƣợng lớn astaxanthin để tạo màu đỏ tự nhiên cho sản phẩm thịt, cá, tôm bằng cách bổ sung vào nguồn thức ăn. Do đƣợc sử dụng phổ biến, hiệu quả trên nhiều lĩnh vực nên nhu cầu astaxanthin trên thị trƣờng rất lớn và ngày càng tăng. Điều này làm cho giá astaxanthin rất cao, với astaxanthin tự nhiên là 2500-7000 USD/kg, astaxanthin tổng hợp khoảng 1000 USD/kg, tổng nhu cầu trên thế giới đạt khoảng 280 tấn, trị giá 447 triệu USD năm 2014, ƣớc tính đến năm 2020 đạt mức 1,1 tỉ USD [3][4][5]. Hai nguồn cung chính của astaxanthin gồm sản phẩm tổng hợp hoặc ly trích từ sinh vật, với nguồn tổng hợp chỉ giới hạn sử dụng để tạo màu tự nhiên cho thực phẩm, còn astaxanthin tự nhiên đƣợc dùng trong chăm sóc, bảo vệ sức khỏe. Loại có nguồn gốc tự nhiên chủ yếu đến từ ly trích tảo Haematococcus pluvialis, nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous, hoặc vỏ tôm, cua... Trên thực vật, astaxanthin chỉ có ở một số cây có hoa thuộc chi Adonis nhƣ Adonis aestivalis [6]. Cánh hoa màu đỏ của các loài thuộc chi Adonis có sản lƣợng thấp nên khó khai thác để cung cấp astaxanthin. Nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin vào các cây thực phẩm mà các sản phẩm của nó đã đƣợc sử dụng phổ biến trong thực tế là một hƣớng nghiên cứu nhiều tiềm năng. Điều này hứa hẹn cung cấp các sản phẩm có giá trị kinh tế và sử dụng cao. Nhiều nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin, có nguồn gốc từ vi khuẩn, tảo..., vào các loại cây trồng khác nhau nhƣ ngô, gạo, táo đã đƣợc thực hiện [7][8]. Đậu tƣơng vốn là cây trồng quan trọng với nhiều ƣu điểm nổi bật ở giá trị dinh dƣỡng của hạt đậu, khả năng thích nghi ở nhiều vùng trồng, giúp cải tạo đất, đồng thời các sản phẩm từ đậu tƣơng rất đa dạng và phổ biến trong đời sống hàng
6 ngày nhƣ đậu hũ, chao, sữa, bột, dầu ăn... nên tiềm năng ứng dụng với giống đậu tƣơng mới rất lớn. Tuy nhiên, nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin trên đậu tƣơng còn hạn chế. Ở Việt Nam, chƣa ghi nhận đƣợc nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng. Do đó, nghiên cứu này đã đƣợc thực hiện nhằm chuyển các gen từ cây hoa Adonis aestivalis vào đậu tƣơng giúp cây có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt, từ đó tạo các sản phẩm có thể đƣợc ứng dụng. 2. Mục tiêu của đề tài Tạo đƣợc dòng đậu tƣơng biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin ở hạt thông qua phƣơng pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam chuyển gen tạo astaxanthin vào thực vật nói chung và cây đậu tƣơng nói riêng. Giống đậu tƣơng dùng để chuyển gen là các giống lai đã đƣợc thuần hóa và trồng phổ biến. Ngoài ra, trên thực vật, khả năng tạo astaxanthin chỉ có ở một số loài thuộc chi Adonis. Các gen đóng vai trò chính trong quá trình chuyển hóa tạo astaxanthin đã đƣợc xác định gồm gen cbfd (mã hóa enzyme carotenoid β-ring 4-dehydrogenase) và gen hbfd (mã hóa enzyme carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase). Các gen này lần đầu tiên đƣợc sử dụng để chuyển vào một loài thực vật khác, có khả năng hoạt động hiệu quả giúp cây chuyển gen sản xuất astaxanthin, điều này làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. Nghiên cứu cũng cho thấy ảnh hƣởng đáng kể của các phƣơng pháp tạo vết thƣơng mẫu khác nhau đến hiệu quả chuyển gen vào giống đậu tƣơng MTĐ 176 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Trong đó, các phƣơng pháp tối ƣu dùng kim châm, dao mổ kết hợp sóng siêu âm, thấm hút chân không đã đƣợc xác định, có thể đƣợc áp dụng để nâng cao hiệu quả chuyển gen vào các giống đậu tƣơng khác. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Cây đậu tƣơng biến đổi gen có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt có thể đƣợc sử dụng để sản xuất các sản phẩm từ hạt đậu có chứa astaxanthin
7 nhƣ thức ăn chăn nuôi, thủy sản hoặc bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm cho ngƣời nhƣ bột ngũ cốc... 4. Đối tƣợng, phạm vi và nội dung nghiên cứu của đề tài Nghiên cứu sử dụng một số giống đậu tƣơng đƣợc trồng phổ biến ở Việt Nam. Các giống này đƣợc dùng để chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens giúp tạo đƣợc cây đậu tƣơng có khả năng sản xuất astaxanthin. Cây đậu tƣơng chuyển gen đƣợc phân tích sự hiện hiện gen biến nạp bằng PCR và Souhern blot, đồng thời đánh giá so sánh kiểu hình và khả năng sinh sản với cây đối chứng. Hạt đậu chuyển gen đƣợc phân tích xác định hàm lƣợng astaxanthin ở thế hệ T1. Nội dung nghiên cứu chính của đề tài: Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và một nửa hạt. Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng. Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tƣơng chuyển gen. 5. Những đóng góp mới của luận án Các gen cbfd2 (mã hóa enzyme enzyme carotenoid β-ring 4-dehydrogenase) và gen hbfd1 (mã hóa enzyme carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase) có nguồn gốc từ cây hoa Adonis aestivalis kết hợp với gen Zm-psy (mã hóa enzyme phytoen sythetase) có nguồn gốc từ ngô khi đƣợc chuyển vào đậu tƣơng đã giúp tạo đƣợc cây phát triển bình thƣờng, có khả năng sản suất astaxanthin. Xây dựng đƣợc qui trình giúp nâng cao hiệu quả chuyển gen trên giống đậu tƣơng MTĐ 176, qui trình này có thể đƣợc áp dụng để nâng cao hiệu quả chuyển gen trên các giống khác. Cụ thể cải tiến trong phƣơng pháp tạo vết thƣơng mẫu gồm: sử dụng kim châm đâm nhẹ 3 lần hoặc dùng dao mổ cắt nhẹ lên vùng đốt lá mầm 5 lần kết hợp xử lý sóng siêu âm 30 giây hoặc thấm hút chân không 60 giây.
8 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Chuyển hóa tạo carotenoid ở thực vật Carotenoid là một loại sắc tố hữu cơ tự nhiên có nhiều trong thực vật, đóng vai trò quan trọng giúp bảo vệ, tăng cƣờng sức khỏe nhƣ chống oxy hóa, ung thƣ, tăng cƣờng sức khỏe tim mạch, là tiền chất của vitamin...[9][10]. Tuy nhiên, con ngƣời không thể tự tổng hợp carotenoid mà hấp thu qua thực phẩm. Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện nhằm thay đổi chu trình chuyển hóa carotenoid ở thực vật để tăng cƣờng các sản phẩm mong muốn, trong đó nổi bật là β-carotene [11][12][13]. Bên cạnh đó, astaxanthin, một carotenoid, nằm ở cuối chuỗi chuyển hóa của một số loài thực vật thuộc chi Adonis cũng đang thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu do có giá trị thị trƣờng rất cao, với công dụng vƣợt trội trong bảo vệ, tăng cƣờng sức khỏe [14][15][16][17][18]. Sau đây là chu trình chuyển hóa tổng hợp carotenoid ở thực vật và một số cải biến chính đã đƣợc thực hiện. 1.1.1. Sinh tổng hợp và tích trữ carotenoid Carotenoid đƣợc tổng hợp từ những tiền chất tạo bởi con đƣờng chuyển hóa MEP (methylerythritol 4-phosphate pathway) diễn ra trong lạp thể. Glyceraldehyde- 3-phosphate và pyruvate là những cơ chất ban đầu để tổng hợp geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), tiền chất chung để tổng hợp các carotenoid và những hợp chất terpenoid khác (hình 1.1). Bƣớc đầu tiên trong con đƣờng tổng hợp carotenoid là sự kết hợp hai phân tử GGPP tạo thành 15-cis-phytoene đƣợc xúc tác bởi enzyme phytoene synthase (PSY). Phytoene đƣợc chuyển thành lycopene bởi hai phản ứng khử bão hòa xúc tác bởi phytoene desaturase (PDS) và zeta-carotene desaturase (ZDS). Lycopene là điểm phân nhánh của con đƣờng tổng hợp do là cơ chất của hai enzyme cyclase cạnh tranh nhau, β lycopene cyclase (β-LCY) và ε lycopene cyclase (ε-LCY). α-carotene đƣợc tạo ra khi β-LCY và ε-LCY hoạt động kết hợp với nhau ở hai đầu của phân tử lycopene, trong khi β-carotene đƣợc tạo thành khi chỉ β-LCY hoạt động. α-carotene và β-carotene đƣợc hydroxyl hóa bởi ε-ring carotene hydroxylase và β-ring carotene hydroxylase để tạo lutein và zeaxanthin.