Luận án Tiến sĩ Điện tử viễn thông: Nghiên cứu phát triển hệ thống phát hiện protein dựa trên hệ thống vi lưu thao tác tập trung protein tích hợp vi cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:131

Thêm vào BST

Báo xấu

11
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu phát triển hệ thống phát hiện protein dựa trên hệ thống vi lưu thao tác tập trung protein tích hợp vi cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng" tập trung nghiên cứu phát triển một hệ thống chip vi kênh tích hợp các chức năng tập trung làm giàu protein, chọn lọc protein đặc hiệu nhằm hướng tới xây dựng và phát triển một thiết bị xét nghiệm nhỏ gọn cho ứng dụng chăm sóc và theo dõi sức khỏe tại chỗ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Điện tử viễn thông: Nghiên cứu phát triển hệ thống phát hiện protein dựa trên hệ thống vi lưu thao tác tập trung protein tích hợp vi cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ Vũ Quốc Tuấn NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG PHÁT HIỆN PROTEIN DỰA TRÊN HỆ THỐNG VI LƯU THAO TÁC TẬP TRUNG PROTEIN TÍCH HỢP VI CẢM BIẾN MIỄN DỊCH KIỂU TỤ PHẲNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH ĐIỆN TỬ VIỄN THÔNG 1 Hà Nội – 2021
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ Vũ Quốc Tuấn NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG PHÁT HIỆN PROTEIN DỰA TRÊN HỆ THỐNG VI LƯU THAO TÁC TẬP TRUNG PROTEIN TÍCH HỢP VI CẢM BIẾN MIỄN DỊCH KIỂU TỤ PHẲNG Chuyên ngành: Kỹ thuật điện tử Mã số: 9520203.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH ĐIỆN TỬ VIỄN THÔNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS Bùi Thanh Tùng 2. GS.TS Chử Đức Trình Hà Nội – 2021 1
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả trình bày trong luận án là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Bùi Thanh Tùng và GS.TS Chử Đức Trình. Các số liệu kết quả trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào trước đây. Các kết quả lấy từ các tài liệu tham khảo đều được trích dẫn đầy đủ theo đúng quy trình. Nội, ngày tháng năm 2021 Vũ Quốc Tuấn i
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chử Đức Trình và PGS.TS Bùi Thanh Tùng, đã giúp tôi định hướng và triển khai đề tài nghiên cứu. Với sự giúp đỡ của các thầy, tôi đã thực hiện được các nội dung nghiên cứu, giải quyết các vấn đề được đặt ra trong quá trình nghiên cứu và có được những kết quả quan trọng trong luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Vi cơ điện tử và vi hệ thống, Khoa Điện tử viễn thông và Trường Đại học Công nghệ, ĐHQGHN đã hỗ trợ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn tiến sĩ Đỗ Quang Lộc, Trường đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, đã có những thảo luận giá trị đóng góp cho luận án và hỗ trợ trong quá trình chế tạo, thử nghiệm. Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn thạc sĩ Trần Như Trí, Trường Đại học Công nghệ, ĐHQGHN đã hỗ trợ trong đo đạc thử nghiệm và thu thập dữ liệu từ mạch đo kết nối với máy tính. Cùng với đó, tôi xin chân thành cảm ơn giáo sư Chun-Pin Jen và thạc sỹ Meng- Syuan Wu, Đại học quốc gia Chung Cheng, Đài Loan, đã có những hỗ trợ về nguyên vật liệu, trang thiết bị, cũng như tham ra hỗ trợ nghiên cứu, chế tạo thử nghiệm. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tiến sĩ Nguyễn Ngọc Việt đã hỗ trợ tôi trong quá trình đo đạc trong thời gian làm nghiên cứu sinh tại Đại học Quốc gia Chung Cheng, Đài Loan. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên tôi trong những lúc khó khăn để hoàn thành luận án này. Vũ Quốc Tuấn ii
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. II MỤC LỤC ...................................................................................................... III DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT....................................................................VII DANH MỤC BẢNG ................................................................................... VIII DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... IX MỞ ĐẦU ............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CHIP SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG PHÁT HIỆN PROTEIN ....................7 Vai trò của việc phát hiện protein trong chẩn đoán bệnh và các kỹ thuật xét nghiệm protein ..........................................................................................7 Vai trò của việc phát hiện protein trong chẩn đoán bệnh ..................7 Kỹ thuật xét nghiệm ELISA ..............................................................8 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC) .....................................................9 Kỹ thuật đếm dòng chảy (flow cytometric) ......................................9 Kỹ thuật Protein microarrays ............................................................9 Kỹ thuật sử dụng kênh vi lỏng ........................................................10 Tổng quan các nghiên cứu về phát triển chip sinh học và chip phát hiện protein .............................................................................................................11 Các nghiên cứu về chip sinh học ở trong nước ...............................12 iii
Các nghiên cứu về chip sinh học ở nước ngoài về phát hiện protein.. .........................................................................................................14 Chip vi kênh tập trung protein giúp giảm thời gian xét nghiệm và tăng khả năng phát hiện protein ............................................................................19 Dòng chảy điện di và dòng chảy điện thẩm ....................................20 Làm giàu, làm nghèo ion .................................................................20 Chip vi kênh tập trung protein dựa trên nguyên lý dòng chảy EOF và làm nghèo ion. ..................................................................................................23 Cảm biến sinh học kiểu trở kháng và tụ điện sử dụng các phương pháp đo điện trong xét nghiệm sinh học và xét nghiệm protein ...........................32 Kết luận chương .................................................................................34 CHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ CHẾ TẠO HỆ THỐNG PHÁT HIỆN PROTEIN DỰA TRÊN HỆ THỐNG VI LƯU THAO TÁC TẬP TRUNG TÍCH HỢP CẢM BIẾN MIỄN DỊCH KIỂU TỤ PHẲNG .................36 Hệ thống phát hiện protein với các chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện .............................................................................................................36 Tập trung protein ..............................................................................41 Nguyên lý hoạt động của bộ tập trung protein ................................41 Phương pháp tạo kênh nano bằng cách sử dụng điện áp thấp DC đánh thủng lớp tiếp xúc.........................................................................................42 Chọn lọc và phát hiện protein sử dụng cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng tích hợp trong kênh vi lỏng .........................................................................44 Cảm biến miễn dịch kiểu tụ điện phẳng ..........................................44 Mô hình cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng hai điện cực ...............46 Tụ bề mặt .........................................................................................48 Tính toán cho mô hình cảm biến tụ phẳng ......................................48 iv
Phương pháp đo phổ trở kháng (EIS) .............................................49 Nghiên cứu phát triển mạch đo phân tích trở kháng .......................51 Chế tạo chip vi kênh tập trung và phát hiện protein .....................58 Chế tạo kênh vi lỏng........................................................................58 Chế tạo điện cực trên kính, gắn nano vàng trên phiến kính ............60 Gắn kênh vi lỏng lên chip ...............................................................61 Quy trình gắn kháng thể ..................................................................64 Kết quả chế tạo chip ..........................................................................66 2.5 Kết luận chương .......................................................................................67 CHƯƠNG 3. PHÁT HIỆN PROTEIN DỰA TRÊN HỆ THỐNG VI LƯU THAO TÁC TẬP TRUNG TÍCH HỢP CẢM BIẾN MIỄN DỊCH KIỂU TỤ PHẲNG ................................................................................................69 Tập trung và phát hiện protein trên chip điện cực tròn ................69 Cảm biến miễn dịch tụ phẳng điện cực tròn ...................................69 Thiết lập hệ đo .................................................................................70 Kết quả tập trung protein với chip kênh vi lỏng có tích hợp cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng cấu trúc điện cực tròn ở vùng tập trung ................71 Phát hiện protein trên chip vi kênh sau khi tập trung protein bằng phương pháp đo trở kháng sử dụng mạch thiết kế................................................74 Phát hiện các lớp sinh hóa gắn trên điện cực vàng sử dụng cấu trúc cảm biến răng lược ..........................................................................................79 Cảm biến tụ phẳng kiểu răng lược tích hợp trong chip vi kênh tập trung và phát hiện protein .....................................................................................80 Trở kháng bề mặt ở tần số cao ........................................................83 Mô hình đo tụ của cảm biến sinh học kiểu răng lược ở tần số cao .83 v
Kết quả khảo sát cảm biến cấu trúc răng lược với các nồng độ muối PBS khác nhau ......................................................................................................85 Phát hiện và theo dõi các lớp sinh hóa được hình thành trên điện cực trong quá trình gắn kháng thể dựa trên phương pháp đo điện dung ở tần số cao .........................................................................................................90 Kết quả tập trung và phát hiện protein trên chip có cấu trúc điện cực hình răng lược .......................................................................................................95 Kết luận chương .................................................................................98 KẾT LUẬN ...................................................................................................101 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ...................................................103 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................104 PHỤ LỤC ......................................................................................................113 vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng anh Nghĩa tiếng việt 1 ELISA Enzyme linked-immunosorbent Xét nghiệm ELISA assay 2 IHC Immunohistochemistry Xét nghiệm hóa mô miễn dịch 3 EOF Electro-osmotic flow Dòng chảy điện thẩm 4 CPE Constant phase element Phần tử pha không đổi 5 EIS Electrical impedance spectroscopy Phổ trở kháng 6 IDEAs Integreted digitated electrode Điện cực răng lược (nhiều arrays thanh điện cực xen kẽ) 7 LoC Lab on a Chip Phòng thí nghiệm trên chip 8 PDMS Polydimethylsiloxan Tên vật liệu 9 PBS Photpha salt solution Muối phốt phát 10 PoC Point of Care Chăm sóc sức khỏe tại chỗ 11 SNR Signal to Noise Ratio Tỉ lệ tín hiệu trên tạp vii
DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Kích thước của cảm biến điện cực tròn .................................................................. 70 viii
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Các phương pháp xét nghiệm protein dựa trên phương pháp xét nghiệm miễn dịch. ......................................................................................................................... 8 Hình 1.2. Khái niệm của một chip sinh học được chia theo các thành phần chức năng. .... 12 Hình 1.3. Cảm biến điện hóa dựa trên công nghệ in điện cực [73]. ................................... 13 Hình 1.4. Cảm biến sinh học gắn kháng thể trong kênh vi lỏng sử dụng phương pháp đo trở kháng [20]. ....................................................................................................... 16 Hình 1.5. Mô hình thiết kế và phát hiện các hạt sinh học dựa trên việc đếm số hạt đi qua một cảm biến trở kháng [51]. ................................................................................ 17 Hình 1.6. Nguyên lý làm giàu, làm nghèo ion dựa trên cấu trúc kênh nano [59]. ............. 21 Hình 1.7. Thiết kế của chip tập trung protein dùng màng lọc ion: (a) mô hình thiết kế của chip vi kênh bao gồm hai kênh micro được liên kết với nhau bằng một màng lọc ion; (b) sơ đồ nguyên lý chứng minh hoạt động của chip vi kênh khi vùng nghèo ion sau đó dòng chảy protein được lái đến và bị tích lũy gần vùng nghèo ion [39]. ....................................................................................................................... 24 Hình 1.8. Thiết kế chip trung protein dựa trên cấu trúc kênh vi lỏng sử dụng bộ lọc nano tạo ra vùng nghèo ion dùng để bẫy protein [77].................................................... 25 Hình 1.9. Cấu tạo của một chip vi kênh chế tạo bằng PDMS để tập trung protein [36]. ... 26 Hình 1.10. Protein nồng độ 10 nM được tập trung lại theo thời gian được theo dõi bằng phương pháp đo cường độ huỳnh quang với hai điện áp đặt vào hai kênh lần lượt là 100 V và 200 V [36]. ......................................................................................... 27 Hình 1.11. Protein được tập trung với các nồng độ thấp ban đầu khác nhau được khảo sát hiệu suất tập trung trong thời gian khoảng 30 phút [36]. ...................................... 28 Hình 1.12. Cấu trúc chip vi lỏng với hai bước dùng để tập trung protein với 3 kênh lỏng cỡ micro tạo nên cấu trúc đối xứng và cách nhau bởi khe 40 µm [38]. ................ 29 Hình 1.13. Mô tả cấu trúc chip tập trung protein bằng phương pháp đánh thủng điện áp: (a)Thiết kế; (b) chế tạo; (c) hình thực tế của chip tập trung protein bằng cách sử dụng hạt nano vàng chèn vào giữa lớp PDMS và kính nền [12]. .......................... 31 Hình 2.1: Nghiên cứu giải pháp thực hiện chip xét nghiệm protein với ba chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện. ................................................................................. 37 Hình 2.2: Mô hình thiết kế của chip tập trung và phát hiện protein: (a) các kênh vi lỏng tập trung protein vào vùng bắt giữ nơi các kháng thể được cấy lên điện cực vàng, protein đã bị bắt đặc hiệu được phát hiện bằng phương pháp đo trở kháng; (b) cấu trúc thiết kế của chip, kháng thể cấy lên điện cực vàng trong kênh vi lỏng có chiều cao 2 µm. ..................................................................................................... 39 Hình 2.3: Nguyên lý hoạt động của bộ tập trung protein dựa trên dòng chảy điện thẩm và cấu trúc đứt gãy nano làm nghèo ion. ............................................................... 41 Hình 2.4: Cấu trúc đứt gãy nano được tạo ra trong chip hai kênh vi lỏng bằng cách cung cấp nguồn DC điện áp cao để đánh thủng chỗ tiếp giáp của PDMS và tấm kính ix
ở khe giữa hai kênh: (a) sử dụng điện áp cao để tạo đứt gãy nano; (b) sử dụng nano vàng gắn lên tấm kính chỗ khe giữa hai kênh để tạo cấu trúc đứt gãy. ........ 43 Hình 2.5: Cấu trúc của một cảm biến biến miễn dịch kiểu tụ phẳng .................................. 45 Hình 2.6. Mô hình của cảm biến miễn dịch tụ phẳng hai điện cực: (a) mô hình điện của cảm biến cấu trúc tụ phẳng hai điện cực; (b) mạch điện tương đương của cảm biến. ....................................................................................................................... 47 Hình 2.7. Sơ đồ khối của mạch đo phổ trở kháng dải tần từ 10 kHz đến 200 kHz. ........... 52 Hình 2.8. Khảo sát mạch đo phổ khuếch đại Lock-in với tín hiệu có cộng thêm nguồn nhiễu trắng: tín hiệu 100 mVpk-pk trước và sau khi cộng với 2 Vpk-pk nhiễu trắng. 55 Hình 2.9. Kết quả khảo sát mạch đo: (a) sai số của bộ khuếch đại Lock-in ở dải tần từ 10 kHz đến 90 kHz với các tỉ lệ tín hiệu trên tạp khác nhau; (b) sai số của bộ khuếch đại ứng với các tỉ lệ tín hiệu trên tạp. .................................................................... 56 Hình 2.10. Kết quả sử dụng module đo phổ trở kháng để đo giá trị tụ 104 pF và trở 47 kΩ được mắc nối tiếp của mạch RC ở dải tần từ 10 kHz đến 200 kHz: (a) kết quả đo tổng trở; (b) góc pha thay đổi; (c) giá trị điện trở R đo được trong mạch mắc nối tiếp; (d) giá trị tụ điện đo được trong mạch mắc nối tiếp. ....................... 57 Hình 2.11. Quy trình chế tạo kênh vi lỏng.......................................................................... 59 Hình 2.12. Quy trình chế tạo chip bao gồm tạo điện cực, gắn hạt nano vàng và gắn vi kênh lên chip. ........................................................................................................ 62 Hình 2.13. Thiết kế hệ gắn vi kênh lên chip có vùng nano vàng và điện cực; (a) hình mô tả hai phần chip và vi kênh cùng với mô tả thiết bị gắn bao gồm phần dịch chuyển và phần gắn lên vi kênh; (b) hình ảnh thực tế của hệ thống gắn kênh lên chip..... 63 Hình 2.14. Quy trình gắn kháng thể bắt giữ protein lên điện cực vàng .............................. 65 Hình 2.15. (a) Chip sau khi được chế tạo; (b) Mô-đun đo kết nối với chip sau khi được chế tạo. ................................................................................................................... 66 Hình 3.1. Thiết kế cảm biến miễn dịch loại trở kháng hình dạng tròn: (a) kích thước và hình dạng cảm biến tròn trong kênh vi lỏng; (b) kháng thể gắn lên trên điện cực vàng để bắt giữ protein BSA. ................................................................................ 70 Hình 3.2. Quá trình tập trung protein của chip điện cực tròn thực hiện trong thời gian 30 phút. ....................................................................................................................... 72 Hình 3.3. Cường độ huỳnh quang tại vùng tập trung và phát hiện tăng lên trong quá trình tập 2 µl mẫu chứa 10 µM protein BSA. ................................................................ 73 Hình 3.4. Chip vi kênh sau khi được gắn kháng thể và đo theo thời gian .......................... 74 Hình 3.5. Trở kháng thay đổi trước khi và sau khi tiến hành tập trung protein tại vùng có cảm biến. ............................................................................................................... 75 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn phần thực và phần ảo thay đổi theo tần số đo trên cảm biến trước và sau khi tập trung. A) Đồ thị trở kháng phần phần thực. B) Đồ thị trở kháng phần phức.................................................................................................... 76 x
Hình 3.7. Kết quả thực nghiệm trên chip protein sau khi mạch đo được thiết kế lại: (a) Tổng trở thay đổi trước và sau tập trung; (b) Tụ nối tiếp thay đổi trước và sau tập trung. ................................................................................................................ 77 Hình 3.8. Thiết kế của điện cực cấu trúc răng lược tích hợp trong kênh vi lỏng. .............. 81 Hình 3.9. Mô hình cảm biến sinh học kiểu tụ răng lược: (a) các thành phần điện của mô hình đo; (b) sơ đồ tương đương của mô hình đo. .................................................. 85 Hình 3.10. Kết quả tổng trở kháng của 4 nồng độ muối PBS khác nhau lần lượt với 1mM, 5 mM, 10 mM và 20 mM khảo sát ở dải tần từ 1 kHz đến 1 MHz. ...................... 86 Hình 3.11. Đồ thị phần thực và phần ảo của cảm biến đo trên nồng độ muối 1 mM, 5 mM, 10 mM và 20 mM: (a) Phần thực; (b) phần ảo. ............................................ 88 Hình 3.12. Kết quả đo các nồng độ muối khác nhau ở tần số 1 MHz: (a) độ dẫn thay đổi tương ứng với nồng độ muối PBS; (b) tụ nối tiếp tương đương thay đổi tương ứng với nồng độ muối PBS ................................................................................... 89 Hình 3.13. Các lớp sinh hóa có mặt trên bề mặt điện cực tương đương với các lớp điện môi xếp chồng lên nhau tạo thành một mạch tụ nối tiếp. ...................................... 91 Hình 3.14. Quá trình theo dõi các lớp sinh hóa PEG, EDC, ANTI, Biotin được cấy lên bề mặt của cảm biến: (a) Phổ trở kháng thay đổi sau mỗi bước; (b) Tụ nối tiếp thay đổi sau mỗi bước. .......................................................................................... 93 Hình 3.15. Đồ thị phần thực và phần ảo của trở kháng thay đổi tương ứng với ba lớp Au, PEG và EDC: (a) phần thực; (b) phần ảo. ............................................................. 94 Hình 3.16: Sự thay đổi trở kháng và tụ nối tiếp tương ứng với các lớp sinh hóa được gắn lên lần lượt với Au(chip ban đầu), lớp PEG, EDC, Antibody (kháng thể), Biotin và protein: (a) Tổng trở thay đổi ở 1MHz; (b) Tụ nối tiếp thay đổi ở 1MHz. ...... 97 Hình 3.17. Trở kháng và cường độ huỳnh quang thay đổi trong quá trình tập trung protein ở điện cực răng lược. ............................................................................................. 98 xi
MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Chip sinh học ứng dụng trong xét nghiệm bệnh phẩm đã phát triển rất mạnh mẽ trong những năm gần đây với mục đích thay thế cho các thiết bị xét nghiệm đắt tiền và giảm sự cồng kềnh của thiết bị xét nghiệm. Các chip sinh học dựa trên cấu trúc nano và micro cũng được phát triển với một số mục đích như giảm thời gian xét nghiệm, giảm giá thành xét nghiệm, tăng khả năng phát hiện bệnh, đáp ứng nhu cầu xét nghiệm tại chỗ hoặc theo dõi tình trạng của bệnh nhân tại nhà cũng như chăm sóc sức khỏe định kỳ và theo dõi đáp ứng trong quá trình điều trị. Dựa trên phương pháp xét nghiệm miễn dịch kết hợp với các phương pháp vật lý, các chip sinh học đã được phát triển rất đa dạng với nhiều loại khác nhau. Rất nhiều kit phát triển trong xét nghiệm bệnh học bằng cách kết hợp phương pháp xét nghiệm miễn dịch với các phương pháp quang học như nhuộm màu chỉ thị hay nhuộm huỳnh quang đã được nghiên cứu và thương mại hóa. Đánh giá định tính và định lượng có thể được thực hiện bằng việc đo cường độ huỳnh quang hoặc vạch màu. Các kit phát triển cũng có kích thước nhỏ gọn với giá thành rẻ và có thể được sử dụng một lần. Bên cạnh đó các chip sinh học đã được phát triển dựa trên nền tảng kênh vi lỏng dùng để tập trung, phân tách và phát hiện các đối tượng sinh học. Các loại chip này dựa trên nền tảng phòng thí nghiệm trên một chip (Lab on a Chip (LoC)) được phát triển cho các bài toán xét nghiệm ung thư, xét nghiệm DNA hoặc xét nghiệm protein đã được nhiều rất nghiên cứu triển khai và nhiều nghiên cứu trong số đó đã được đăng ký bằng sáng chế cũng như thành sản phẩm thương mại. Trong các loại xét nghiệm này, xét nghiệm protein đóng một vai trò quan trọng trong phát hiện và chẩn đoán nhiều loại bệnh khác nhau cũng như được áp dụng vào xét nghiệm ung thư. Các mẫu xét nghiệm bệnh phẩm có thể là mẫu máu, mẫu nước tiểu hay mẫu mô tế bào của cơ thể người. Một số loại protein trong cơ thể người xuất hiện trong nước tiểu, máu hoặc ở mô tế bào và tăng đột biến là chỉ dấu sinh học của một căn bệnh nào đó. Việc phát hiện một lượng nhỏ của một loại protein nào đó trong 1
mẫu phẩm có một vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm và chẩn đoán bệnh cũng như theo dõi trong quá trình điều trị bệnh. Xét nghiệm protein hiện đã được thực hiện phổ biến trong các cơ sở y tế bằng các thiết bị phân tích hiện đại, cồng kềnh và đắt tiền. Để thay thế các thiết bị cồng kềnh và đắt tiền, các chip sinh học đã được nghiên cứu và phát triển với nhiều ưu điểm như thiết bị nhỏ gọn nhưng vẫn đáp ứng được yêu cầu về khả năng phát hiện, với lượng lấy mẫu nhỏ, dễ vận hành và giảm thời gian xét nghiệm. Do vậy, luận án này đặt ra vấn đề tiến hành nghiên cứu phát triển chip kênh vi lỏng phát hiện protein nhằm hướng tới xây dựng và phát triển thành một thiết bị xét nghiệm nhỏ gọn bao gồm các các ưu điểm như: khả năng phát hiện với lượng lấy mẫu nhỏ, chính xác, nhanh chóng, tự động và nhỏ gọn, và giảm giá thành của thiết bị. Mục đích của luận án Luận án tập trung nghiên cứu phát triển một hệ thống chip vi kênh tích hợp các chức năng tập trung làm giàu protein, chọn lọc protein đặc hiệu nhằm hướng tới xây dựng và phát triển một thiết bị xét nghiệm nhỏ gọn cho ứng dụng chăm sóc và theo dõi sức khỏe tại chỗ. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu bao gồm: - Hệ thống kênh vi lưu tập trung protein bằng cấu trúc đứt gãy nano ở điện áp thấp để làm giàu làm nghèo ion cùng với nguyên lý dòng chảy điện thẩm nhằm tập trung protein. - Cảm biến miễn dịch kiểu tụ điện phẳng hai điện cực tích hợp trong kênh vi lỏng nhằm bắt giữ chọn lọc và phát hiện protein. - Phương pháp đo và phân tích trở kháng, điện dung và mạch điện tử đặc dụng đo và phân tích trở kháng cảm biến miễn dịch kiểu tụ điện phẳng hai điện cực. 2
Phạm vi nghiên cứu Trong khuôn khổ luận án này, nghiên cứu sinh tập trung nghiên cứu hệ thống vi lưu phát hiện protein bao gồm các chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện protein cùng với việc nghiên cứu phát triển mô-đun đo và phân tích trở kháng áp dụng cho vi cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng trong việc phát hiện protein. Nghiên cứu sử dụng hạt nano vàng có đường kính 13nm chèn vào lớp tiếp xúc giữa vật liệu PDMS và kính trên chip có gắn cảm biến miễn dịch đã được tiến hành nhằm tạo giảm điện áp đánh thủng xuống 50 V để tạo ra đứt gãy cấu trúc nano áp dụng cho việc làm giàu và làm nghèo ion trong kênh. Kênh vi lưu được tiến hành nghiên cứu tích hợp vi cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng với cấu trúc điện cực tròn và răng lược tại vùng tập trung nhằm chọn lọc và phát hiện protein. Phương pháp đo phân tích trở kháng, tụ điện được nghiên cứu áp dụng cho vi cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng hai điện cực với kích thước dưới 100 µm tích hợp trong vi kênh. Từ đó, mô-đun đo trở kháng áp dụng cho vi cảm biến sinh học được nghiên cứu thiết kế và chế tạo đã đáp ứng cho bài toán đo và phát hiện protein trên vi cảm biến. Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng Các phương pháp nghiên cứu bao gồm phương pháp xây dựng mô hình, tính toán lý thuyết kết hợp với các phương pháp thực nghiệm, chế tạo cấu trúc và đo đạc trên những thiết bị hiện đại. Dựa trên những tính toán lý thuyết, các chế độ đo đã được xây dựng nhằm đo đạc trên các cấu trúc chip vi kênh đã được chế tạo. Các kết quả đo trên các máy đo hiện đại cũng như mạch đo tự phát triển đã chứng minh khả năng làm việc của chip vi kênh đã được nghiên cứu phát triển. Ý nghĩa khoa học Các nội dụng nghiên cứu được tiến hành trong luận án này có những ý nghĩa khoa học được nêu dưới đây: 3
- Nghiên cứu thiết kế chế tạo hệ thống vi lưu có chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện protein giúp tăng khả năng phát hiện protein với một lượng thể tích lấy mẫu nhỏ, và đẩy nhanh quá trình xét nghiệm. - Sử dụng hạt nano vàng có kích thước 13 nano mét cho phép điện áp đánh thủng và điện áp hoạt động dưới 50 V trên chip vi kênh thao tác tập trung có tích hợp vi cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng hai điện cực. Việc giảm điện áp đánh thủng và điện áp hoạt động của bộ tập trung giúp hạn chế việc sôi kênh phá hủy kênh và vi điện cực tích hợp trong vi kênh. - Phương pháp đo điện dung ở tần số cao và điện áp thấp đối với vi cảm biến sinh học miễn dịch kiểu tụ phẳng cấu trúc răng lược để áp dụng cho bài toán phát hiện các lớp sinh hóa gắn trên bề mặt cảm biến. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Hệ thống vi lưu thao tác tập trung protein có tích hợp cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng đã được nghiên cứu và phát triển trong luận án này có nhiều ưu điểm. Hệ thống vi lưu với ba chức năng bao gồm chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện protein tạo ra một thiết bị nhỏ gọn ứng dụng trong việc xét nghiệm tại chỗ. Cụ thể, với việc tập trung protein trong kênh vi lỏng, thời gian xét nghiệm được giảm xuống, khả năng phát hiện cũng được tăng lên đáng kể ở cùng một một lượng mẫu nhất định. Do vậy, chức năng tập trung của chip vi kênh có tính ưu việt về lượng lấy mẫu xét nghiệm. Chức năng chọn lọc và phát hiện tích hợp trong kênh tạo ra khả năng tự động hóa trong xét nghiệm giúp đơn giản hóa trong quá trình vận hành. Việc tích hợp cảm biến trong vi kênh cũng tạo ra một chip hoàn chỉnh với kích thước nhỏ gọn thay thế cho các thiết bị, hệ thống quang học cồng kềnh và đắt tiền. Mạch đo và phân tích trở kháng đã được phát triển để tích hợp với chip vi kênh tạo ra một thiết bị nhỏ gọn để hướng tới phát triển các thiết bị chăm sóc tại chỗ (Point of Care) với giá thành rẻ thay thế các thiết bị cồng kềnh và đắt tiền mà vẫn đáp ứng được bài toán xét nghiệm. 4
Nội dung của luận án ngoài phần mở đầu và kết luận được tổ chức thành 3 chương với các nội dung: Chương 1: Tổng quan về phát triển chip sinh học ứng dụng trong phát hiện protein Trong chương này, các phương pháp xét nghiệm protein hiện đang được nghiên cứu và triển khai trên thực tế được trình bày các ưu nhược điểm. Bên cạnh đó, các kỹ thuật tập trung protein bằng phương pháp làm giàu và làm nghèo ion trên nền chip vi kênh nhằm giảm thời gian xét nghiệm và tăng khả năng phát hiện cũng được giới thiệu. Dựa trên phân tích những ưu nhược điểm của các kỹ thuật đã được nghiên cứu phát triển, phần cuối của chương trình bày về đề xuất nội dung nghiên cứu của luận án. Chương 2: Nghiên cứu phát triển và chế tạo hệ thống phát hiện protein dựa trên hệ thống vi lưu thao tác tập trung tích hợp cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng Chương 2 trình bày nội dung nghiên cứu phát triển chip vi lỏng với ba chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện protein bao gồm thiết kế và thực nghiệm chế tạo chip dựa trên công nghệ vi chế tạo. Bên cạnh đó, nội dung về thiết kế, chế tạo và khảo sát mạch đo và phân tích trở kháng áp dụng cho chip tập trung và phát hiện protein cũng được trình bày chi tiết. Chương 3: Phát hiện protein dựa trên hệ thống vi lưu thao tác tập trung tích hợp cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng Nội dung của chương 3 trình bày các kết quả đạt được của việc phát triển chip tập trung, chọn lọc và phát hiện protein với cấu trúc chip được tích hợp cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng cấu trúc điện cực tròn và cấu trúc điện cực răng lược. Lượng mẫu 2µl của 10 µM protein FITC-BSA đã được tiến hành tập trung trong kênh vi lưu với điện áp tiến hành dưới 50 V. Phương pháp đo trở kháng đã được áp dụng để phát 5
hiện protein sau khi được tiến hành tập trung. Trình bày nội dung nghiên cứu giải pháp sử dụng phép đo điện dung của cảm biến ở tần số cao (1 MHz) trên cấu trúc cảm biến điện cực hình răng lược nhằm phát hiện và theo dõi các lớp sinh hóa có mặt trên điện cực của cảm biến trong quá trình gắn kháng thể cũng như protein bị bắt giữ sau khi tiến hành tập trung. Phần kết luận tổng hợp các nội dung nghiên cứu và kết quả đạt được của luận án cũng như đưa ra phương hướng triển khai các nghiên cứu tiếp theo. 6
Chương 1. TỔNG QUAN VỀ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CHIP SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG PHÁT HIỆN PROTEIN Vai trò của việc phát hiện protein trong chẩn đoán bệnh và các kỹ thuật xét nghiệm protein Vai trò của việc phát hiện protein trong chẩn đoán bệnh Protein được cấu thành từ các loại axit amin đóng một vai trò quan trọng trong cơ thể người. Các protein đóng vai trò trao đổi chất và có vai trò trong hệ miễn dịch. Các loại protein là thành phần cấu thành trong các tế bào. Vì vậy, xét nghiệm protein là một xét nghiệm quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh trong đó có bệnh ung thư [2, 3, 25, 28, 64, 76, 80]. Các xét nghiệm phân loại và đánh giá về các protein trong máu và trong các mô đã được thực hiện [3]. Xét nghiệm các loại protein trong máu có thể được sử dụng để đánh giá ung thư tuyến tụy [33]. Khoảng hơn 100 loại protein đặc biệt có trong huyết thanh và huyết tương được phát hiện và đánh giá áp dụng trong việc xét nghiệm [3]. Các nhóm protein có trong tế bào cũng đóng một vai trò quan trong trong chẩn đoán ung thư vú [80] [64]. Sự có mặt và tăng lên đáng kể của một nhóm protein như casein kinase Ie, p53, annexin XI, CDC25C, eIF-4E và MAP kinase 7 được tìm thấy ở mô tế bào ác tính của ung thư vú [28]. PARP protein là một chỉ dấu xuất hiện trong mô tế bào ung thư buồng trứng [76]. Để xét nghiệm protein, các phương pháp dựa trên xét nghiệm miễn dịch đã được sử dụng cũng như đang được nghiên cứu phát triển đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của việc áp dụng xét nghiệm protein trong chẩn đoán và điều trị bệnh. Việc xét nghiệm protein về cơ bản dựa trên xét nghiệm miễn dịch với nhiều kỹ thuật khác nhau như kỹ thuật hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry) viết tắt tiếng anh là IHC [76, 80], kỹ thuật xét nghiệm phân tích sinh hóa (enzyme linked- immunosorbent assay) viết tắt tiếng anh là ELISA [64, 76], kỹ thuật đếm dòng chảy tế bào (flow cytometry) [24]. Các kỹ thuật liệt kê ở trên hiện đang được sử dụng rộng rãi trong xét nghiệm sinh học cũng như xét nghiệm bệnh ở các trung tâm y tế. Hình 7