Luận án Tiến sĩ Dược học: Đánh giá độc tính của 3 Monocloro Propan-1,2-Diol (3 MCPD) trên gan, máu và thần kinh của chuột nhắt

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:170

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án đặt trọng tâm nghiên cứu đánh giá độc tính của 3-MCPD trên các cơ quan này nhằm cung cấp thêm các dữ liệu khoa học có ý nghĩa cho lĩnh vực an toàn thực phẩm. Đồng thời qua luận án này, tác giả cũng mong muốn đề xuất một số phương pháp nhằm có thể ứng dụng cho việc đánh giá độc tính của những hóa chất hay thuốc có nghi ngờ có thể gây ra độc tính trên các cơ quan đích.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Đánh giá độc tính của 3 Monocloro Propan-1,2-Diol (3 MCPD) trên gan, máu và thần kinh của chuột nhắt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGÔ KIẾN ĐỨC ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA 3-MONOCLORO PROPAN-1,2-DIOL (3-MCPD) TRÊN GAN, MÁU VÀ THẦN KINH CỦA CHUỘT NHẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP. Hồ Chí Minh, Năm 2016
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGÔ KIẾN ĐỨC ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA 3-MONOCLORO PROPAN-1,2-DIOL (3-MCPD) TRÊN GAN, MÁU VÀ THẦN KINH CỦA CHUỘT NHẮT Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất Mã số: 62720410 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trần Mạnh Hùng 2. GS.TS. Nguyễn Văn Thanh TP. Hồ Chí Minh, Năm 2016
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Ngô Kiến Đức
i MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình Danh mục các biểu đồ Danh mục các sơ đồ Trang MỞ ĐẦU ................................................................................................................................1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................4 1.1. Đại cương về 3-Monocloropropan-1,2-diol (3-MCPD) ..................................................4 1.2. Các nghiên cứu đánh giá độc tính của 3-MCPD trên thế giới .........................................9 1.3. Xét nghiệm huyết học ....................................................................................................19 1.4. Thử nghiệm về vi nhân (micronucleus) .........................................................................24 1.5. Giải phẫu mô học – Dị sản tế bào gan ...........................................................................28 1.6. Gen tiền ung thư c-fos (proto-oncogen) ........................................................................31 1.7. Phương pháp hóa mô miễn dịch ....................................................................................31 1.8. Thoái hóa tế bào thần kinh.............................................................................................35 1.9. Phương pháp nhuộm màu cresyl violet .........................................................................36 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................38 2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................................38 2.2. Thuốc thử – Trang thiết bị – Nơi thực hiện ...................................................................38 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................................40 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..............................................................................54 3.1. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên huyết học .............................................................54 3.2. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể ......................................................78 3.3. Đánh giá độc tính mạn tính của 3-MCPD trên gan........................................................89 3.4. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên não chuột nhắt .....................................................94
ii Trang Chương 4: BÀN LUẬN ....................................................................................................106 KẾT LUẬN........................................................................................................................123 KIẾN NGHỊ.......................................................................................................................125 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt 1,3-DCP 1,3-Dicloropropan-2-ol 2,3-DCP 2,3-Dicloropropan-1-ol 2-MCPD 2-Monocloropropan-1,3-diol 3-MCPD 3-Monocloropropan-1,2-diol ALT Alanin aminotransferase AST Aspartat aminotransferase EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Hb Hemoglobin HCT Hematocrit Thể tích khối hồng cầu LD50 Lethal Dose 50% Liều gây chết 50% LYM Lymphocytes Bạch cầu lympho MCV Mean Corpuscular Volume Thể tích trung bình hồng cầu MCH Mean Corpuscular Hemoglobin Huyết sắc tố trung bình trong hồng cầu MCHC Mean Corpuscular Hemoglobin Nồng độ huyết sắc tố trung Concentration bình trong hồng cầu MN Micronucleus Vi nhân MPV Mean Platete Volume Thể tích trung bình tiểu cầu NEU Neutrophils Bạch cầu trung tính MONO Monocytes Bạch cầu đơn nhân PLT Platelets Tiểu cầu RBC Red blood cells Hồng cầu WBC White blood cells Bạch cầu M Mean Giá trị trung bình SD Standard deviation Độ lệch chuẩn TDI Tolerable daily intake Mức thu nạp cho phép hàng ngày PMTDI Provisional maximum tolerable Định mức tạm thời cho phép cơ thể daily intake thu nạp mỗi ngày
iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Khảo sát hàm lượng 3-MCPD trong một số thực phẩm ở nước Anh.....................6 Bảng 1.2. Nồng độ tối đa 3-MCPD trong nước tương cho phép ở một số quốc gia ..............7 Bảng 1.3. Mức tiêu thụ 3-MCPD mỗi ngày của người dân ở một số quốc gia ......................8 Bảng 1.4. Một số kết quả về tổn thương về bệnh học, tăng sản và ung thư sau 2 năm nghiên cứu độc tính của 3-MCPD trên chuột cống ..............................................14 Bảng 1.5. Kết quả thử nghiệm in vitro khả năng gây đột biến gen của 3-MCPD ................17 Bảng 1.6. Kết quả thử nghiệm in vivo khả năng gây đột biến gen của 3-MCPD .................19 Bảng 1.7. Công thức bạch cầu bình thường..........................................................................20 Bảng 1.8. Sự thay đổi số lượng các loại bạch cầu và ý nghĩa lâm sàng ...............................20 Bảng 1.9. Các dạng bất thường về kích thước hồng cầu ......................................................23 Bảng 1.10. Các dạng bất thường về hình thái hồng cầu .......................................................23 Bảng 3.1. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số bạch cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng ..........................................................................................................55 Bảng 3.2. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số hồng cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng ..........................................................................................................57 Bảng 3.3. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số tiểu cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng ..........................................................................................................59 Bảng 3.4. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số bạch cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng ........................................................................................................60 Bảng 3.5. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số hồng cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng ........................................................................................................62 Bảng 3.6. Tác động của 3-MCPD trên chỉ số tiểu cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng ................................................................................................................64 Bảng 3.7. Tổng kết sự thay đổi hình thái hồng cầu bằng phương pháp phết máu ngoại vi..71 Bảng 3.8. Kết quả xét nghiệm bất thường hồng cầu bằng máy huyết đồ ADVIA 2120i .....72 Bảng 3.9. Kết quả lympho bất thường sau khi phơi nhiễm 3-MCPD mạn tính trong 12 tháng .....................................................................................................................73
v Trang Bảng 3.10. Tác động của 3-MCPD lên thời gian chảy máu sau khi phơi nhiễm 3 tháng, 6 tháng và 12 tháng ..............................................................................................75 Bảng 3.11. Tác động của 3-MCPD lên thời gian đông máu sau khi phơi nhiễm 3 tháng, 6 tháng và 12 tháng ...........................................................................................76 Bảng 3.12. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 24 giờ ....................................................................78 Bảng 3.13. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 48 giờ ....................................................................79 Bảng 3.14. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 72 giờ ....................................................................80 Bảng 3.15. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 2 tuần .....................................................................81 Bảng 3.16. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 3 tháng...................................................................84 Bảng 3.17. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 6 tháng...................................................................85 Bảng 3.18. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 12 tháng.................................................................87 Bảng 3.19. Hoạt tính AST và ALT trong huyết tương sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong thời gian 6 tháng của các lô thử nghiệm ..................................................90 Bảng 3.20. Tỷ số khối lượng gan/thể trọng chuột ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 6 tháng ...........................................................................90 Bảng 3.21. Kết quả vi phẫu gan ở các lô chuột thí nghiệm sau 12 tháng phơi nhiễm 3- MCPD................................................................................................................93 Bảng 3.22. Tổng kết sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi gây phơi nhiễm 3- MCPD................................................................................................................99
vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Công thức hóa học của các dẫn xuất cloropropanol ...............................................4 Hình 1.2. Cơ chế tạo thành vi nhân và sự biểu hiện vi nhân trong hồng cầu .......................25 Hình 1.3. Vi thể dị sản gan với nhân đa hình, nhân đôi và màng nhân bất thường ..............29 Hình 1.4. Dẫn truyền và biểu hiện c-fos ...............................................................................32 Hình 1.5. Phương pháp hóa mô miễn dịch trực tiếp .............................................................34 Hình 1.6. Phương pháp hóa mô miễn dịch gián tiếp ............................................................34 Hình 1.7. Phương pháp nhuộm cresyl violet quan sát thân tế bào thần kinh và thể Nissl ....36 Hình 2.1. Máy xét nghiệm huyết học ADVIA 2120i ............................................................39 Hình 2.2. Máy xét nghiệm huyết học EXCELL 2280 ..........................................................39 Hình 2.3. Máy xét nghiệm sinh hóa Tecno 168 ....................................................................39 Hình 2.4. Lấy máu từ tim chuột ............................................................................................43 Hình 2.5. Mẫu mô não được nhuộm hóa mô miễn dịch .......................................................52 Hình 3.1. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 24 giờ ............................67 Hình 3.2. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 48 giờ ............................67 Hình 3.3. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 72 giờ ............................68 Hình 3.4. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 2 tuần ............................69 Hình 3.5. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 3 tháng ..........................69 Hình 3.6. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 6 tháng ..........................70 Hình 3.7. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 12 tháng ........................71 Hình 3.8. Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 24 giờ phơi nhiễm 3- MCPD (x 1000) ....................................................................................................79 Hình 3.9. Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 48 giờ phơi nhiễm 3- MCPD (x 1000) ....................................................................................................80 Hình 3.10. Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 72 giờ phơi nhiễm 3- MCPD (x 1000) ..................................................................................................81 Hình 3.11. Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 2 tuần phơi nhiễm 3- MCPD (x 1000) ..................................................................................................82 Hình 3.12. Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 3 tháng phơi nhiễm 3- MCPD (x 1000) ..................................................................................................84
vii Trang Hình 3.13. Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 6 tháng phơi nhiễm 3- MCPD (x 1000) ..................................................................................................85 Hình 3.14. Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 12 tháng phơi nhiễm 3- MCPD (x 1000) ..................................................................................................88 Hình 3.15. Hình ảnh đại thể gan của các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 6 tháng .......................................................................................................91 Hình 3.16. Hình ảnh sinh thiết gan ở các lô thí nghiệm (x 400)...........................................92 Hình 3.17. Mô gan bình thường và các trường hợp viêm, nghịch sản .................................94 Hình 3.18. Sự biểu hiện c-fos ở độ pha loãng 1/100 (kháng thể sơ cấp kháng c-fos) và 1/20 (kháng thể thứ cấp-cơ chất tạo màu) ..........................................................95 Hình 3.19. Sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 10 mg/kg trong 24 giờ..............................................................................................96 Hình 3.20. Sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 50 mg/kg trong 24 giờ..............................................................................................97 Hình 3.21. Sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 100 mg/kg trong 24 giờ..............................................................................................98 Hình 3.22. Sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 100 mg/kg trong 48 giờ..............................................................................................99 Hình 3.23. Sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 100 mg/kg trong 72 giờ............................................................................................100 Hình 3.24. Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã ở các lô thử nghiệm sau 24 giờ phơi nhiễm 3-MCPD.........................................................................................101 Hình 3.25. Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã ở các lô thử nghiệm sau 48 và 72 giờ phơi nhiễm 3-MCPD .............................................................................101 Hình 3.26. Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã với độ phóng đại cao hơn (x 1000) sau 72 giờ phơi nhiễm 3-MCPD.............................................................103 Hình 3.27. Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã ở các lô thử nghiệm sau 2 tuần phơi nhiễm 3-MCPD.........................................................................................104 Hình 3.28. Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã với độ phóng đại cao hơn (x 1000) sau 2 tuần phơi nhiễm 3-MCPD .............................................................105
viii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số bạch cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng ..............................................................................................55 Biểu đồ 3.2. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số hồng cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng ..............................................................................................58 Biểu đồ 3.3. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số tiểu cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng ..............................................................................................59 Biểu đồ 3.4. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số bạch cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng ............................................................................................61 Biểu đồ 3.5. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số hồng cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng ............................................................................................63 Biểu đồ 3.6. Tác động của 3-MCPD trên tiểu cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng.................................................................................................................64 Biểu đồ 3.7. Thời gian chảy máu ở các lô thử nghiệm sau 3, 6 và 12 tháng phơi nhiễm 3-MCPD ...........................................................................................................75 Biểu đồ 3.8. Thời gian đông máu ở các lô thử nghiệm sau 3, 6 và 12 tháng phơi nhiễm 3-MCPD ...........................................................................................................76 Biểu đồ 3.9. Tỉ lệ % hồng cầu có vi nhân ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3- MCPD trong 24, 48, 72 giờ và 2 tuần ..............................................................83 Biểu đồ 3.10. Tỉ lệ % hồng cầu có vi nhân ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3- MCPD trong 3 tháng và 6 tháng.....................................................................86 Biểu đồ 3.11. Tỉ lệ % hồng cầu có vi nhân ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3- MCPD trong 12 tháng ....................................................................................87 Biểu đồ 3.12. Hoạt tính AST và ALT trong huyết tương sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong thời gian 6 tháng của các lô thử nghiệm ...............................................90 Biểu đồ 3.13. Tỷ số khối lượng gan/thể trọng chuột ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 6 tháng ........................................................................91
ix DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1.1. Sự hình thành độc tố 3-MCPD ..............................................................................6 Sơ đồ 2.1. Thiết kế quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên huyết học......................42 Sơ đồ 2.2. Thiết kế quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể ...............46 Sơ đồ 2.3. Thiết kế quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên gan ...............................48 Sơ đồ 2.4. Thiết kế quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên não chuột......................50 Sơ đồ 2.5. Quy trình nhuộm cresyl violet .............................................................................53 Sơ đồ 3.1. Tổng kết độc tính của 3-MCPD trên công thức máu...........................................65
1 MỞ ĐẦU Thực phẩm luôn là một phần thiết yếu của cuộc sống. Vì thế vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm luôn là mối quan tâm hàng đầu của người tiêu dùng, các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm và các nhà chức trách xã hội. Một số chất có thể gây độc cho cơ thể được cho vào thực phẩm nhằm mục đích bảo quản, tạo màu mùi thu hút, cũng có những chất khác được sinh ra ngay trong quá trình sản xuất. Việc làm rõ mức độ gây độc và kiểm soát những chất mới sinh này luôn là vấn đề nan giải. Năm 1999, lần đầu tiên ở Anh, nước tương nhập khẩu từ Trung Quốc được phát hiện có 3-MCPD với hàm lượng dao động từ 6 - 124mg/Kg [100]. Tuy nhiên, đây không phải là thời điểm đầu tiên 3-MCPD được biết đến mà ngay từ những năm đầu thập kỷ 80 của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã biết rằng, những thực phẩm nào được chế biến bằng phương pháp thủy phân chất đạm thực vật bằng HCl đậm đặc đều có chứa 3–MCPD [99]. Năm 1991, sự có mặt của chất này trong thực phẩm đã bắt đầu được mô tả. Tuy nhiên, vào thời điểm đó, người ta ít để ý đến cho dù hàm lượng 3– MCPD được tìm thấy trong thực phẩm là rất cao, phổ biến ở mức 100mg/kg [100]. 3-MCPD là chữ viết tắt của một chất có danh pháp hóa học là 3-monocloropropan- 1,2-diol, một hóa chất thuộc nhóm cloropropanol. Trong quá trình chế biến nhiều loại thực phẩm (như nước tương, dầu hào, các sản phẩm quay rán, nướng, bánh mì, bánh bích quy …) luôn luôn tồn tại một dư lượng 3-MCPD trong sản phẩm cuối cùng. Ngay cả những thức ăn được chế biến trong gia đình cũng tìm thấy có chứa 3-MCPD nhất là những món thịt được ướp muối và chiên, nướng …[100] Trước đây, nước tương hoặc sản phẩm nước chấm từ đậu nành được chế biến bằng phương pháp lên men truyền thống. Khi công nghệ phát triển, người ta thấy rằng nước tương hoặc sản phẩm đậu tương được sản xuất bằng phương pháp thủy phân bằng acid HCl đem lại hiệu năng rất cao về mặt chất lượng và hiệu suất thành phẩm. Vì thế, phương pháp này ngày càng được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến nước tương, dầu hào và các sản phẩm từ đậu tương có thông qua quá trình thủy
2 phân. Tuy nhiên, quy trình này lại sinh ra hợp chất 3-MCPD với nồng độ quá mức và được cho là có hại cho sức khỏe [105]. Ở Việt Nam, tháng 11/2001, lần đầu tiên các kiểm nghiệm về chất 3-MCPD được tiến hành và cũng xác minh là nồng độ 3-MCPD có mặt trong một số sản phẩm nước tương bán ở thị trường Việt Nam là cao quá ngưỡng cho phép so với tiêu chuẩn châu Âu. Cho dù đã được nhà nước kiểm soát chặt chẽ hơn, thì cho đến nay cũng đã xảy ra vài vụ nước tương có chứa hàm lượng 3-MCPD bị phát hiện trên thị trường. Điều này cho thấy, 3-MCPD vẫn luôn là mối quan tâm của xã hội, người tiêu dùng vẫn còn tâm lý hoang mang, e ngại còn cơ quan quản lý và các doanh nghiệp thì vẫn băn khoăn chưa tìm ra lời giải cho vấn đề 3-MCPD. Từ 2002, nhiều quốc gia trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu, khảo sát và thiết lập ngưỡng tiếp xúc được cho là tương đối an toàn đối với hoá chất này, đặc biệt ở những sản phẩm nước tương hay các thực phẩm được chế biến bằng sự thủy phân đạm thực vật trong môi trường HCl [97]. Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu xác định độc tính của 3-MCPD được thực hiện, ví dụ như các nghiên cứu đánh giá độc tính trên thận, hệ sinh dục, thần kinh, và khả năng gây ung thư,…Các nghiên cứu cho thấy rằng 3-MCPD gây thương tổn hệ sinh sản của chuột cống đực, thương tổn dạng tăng sinh và tạo khối u ở thận trên mô hình thực nghiệm động vật, đồng thời có sự gia tăng thương tổn khi liều lượng tiếp xúc gia tăng [97]. Một số nghiên cứu độc tính trên thần kinh trung ương cho thấy 3-MCPD gây nhiều tổn thương trên chất xám, trải dài từ vỏ não cho đến cột sống, làm tăng thể tích nước trong bào tương, gây phù các tế bào hình sao [17], [18], [20]. Dựa trên một số kết quả nghiên cứu được về độc tính của 3-MCPD, giới khoa học phải chấp nhận suy luận ngoại suy là 3-MCPD vẫn có thể có nguy cơ gây hại cho con người. Tuy nhiên để có cái nhìn toàn diện hơn về độc tính của chất này, ngoài các độc tính đã biết của 3-MCPD trên thận và cơ quan sinh dục với nhiều bằng chứng thuyết phục, thì các nghiên cứu về độc tính trên những cơ quan mục tiêu khác như máu, gan, não cũng cần được nghiên cứu nhiều hơn và tìm hiểu sâu hơn.
3 Vì vậy trong luận án này, chúng tôi đặt trọng tâm nghiên cứu đánh giá độc tính của 3-MCPD trên các cơ quan này nhằm cung cấp thêm các dữ liệu khoa học có ý nghĩa cho lĩnh vực an toàn thực phẩm. Đồng thời qua luận án này, chúng tôi cũng mong muốn đề xuất một số phương pháp nhằm có thể ứng dụng cho việc đánh giá độc tính của những hóa chất hay thuốc có nghi ngờ có thể gây ra độc tính trên các cơ quan đích. Cụ thể, mục tiêu của chúng tôi như sau: 1. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên huyết học sau khi gây phơi nhiễm mạn tính trong 6 tháng và 12 tháng. 2. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể ở các pha cấp tính, bán cấp tính và mạn tính bằng phương pháp vi nhân trên hồng cầu. 3. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên gan thông qua các enzym chức năng gan và khảo sát mô học tế bào gan. 4. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên não chuột nhắt qua sự biểu hiện c-fos và thoái hóa tế bào thần kinh.
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ 3-MONOCLOROPROPAN-1,2-DIOL (3-MCPD) 1.1.1. Tính chất lý hóa và cấu trúc hóa học của 3-MCPD 3-MCPD thuộc nhóm hóa chất gây độc có tên gọi chung là các cloropropanol, có công thức phân tử là C3H7ClO2, khối lượng phân tử là 110,5; khối lượng riêng d = 1,32 kg/l. Nhóm cloropropanol gồm có 4 dẫn xuất thường gặp: 1,3-dicloro-2- propanol (1,3-DCP); 2-monocloropropan-1,3-diol (2-MCPD); 2,3-dicloro-2- propanol (2,3-DCP); và 3-monocloropropan-1,2-diol (3-MCPD). Trong đó, 3- MCPD còn có tên gọi khác là alpha-monoclorohydrin, đây là một phân tử không đối xứng, tồn tại dưới dạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân dạng R và S (hàm lượng của hai đồng phân đối quang này là 50:50) [100]. Ở trạng thái tinh khiết, 3-MCPD là một chất lỏng hầu như không bay hơi, có điểm sôi từ 114 - 120oC ở điều kiện áp suất giảm (14 mmHg). 3-MCPD tan tốt trong nhiều loại dung môi hữu cơ như ethanol, ether và tan được trong nước [105]. Tính ổn định của 3-MCPD phụ thuộc vào pH và nhiệt độ môi trường, pH càng lớn (tính kiềm) và nhiệt độ càng cao (gia nhiệt) thì tỉ lệ 3-MCPD bị phân hủy càng nhiều. Ngược lại, ở nhiệt độ thấp và môi trường acid thì chất này càng bền vững [100]. Cấu trúc hóa học của các dẫn xuất cloropropanol được trình bày trong hình 1.1. Cl OH OH Cl | | | | CH CH CH CH * * H2 C CH2 H 2C CH2 H 2C CH2 H2 C CH2 | | | | | | | | OH OH OH Cl Cl Cl OH Cl 2-monocloropropan- 3-monocloropropan- 1,3-dicloro-2-propanol 2,3-dicloro-1-propanol 1,3-diol 1,2-diol (1,3-DCP) (2,3-DCP) (2-MCPD) (3-MCPD) Hình 1.1. Công thức hóa học của các dẫn xuất cloropropanol.
5 1.1.2. Hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ. Các nghiên cứu trên chuột cống và chuột nhắt cho thấy 3-MCPD được hấp thu nhanh chóng qua đường tiêu hóa, phân bố trong nhiều mô của cơ thể và sau đó tích lũy trong các cơ quan đích, đặc biệt là tinh hoàn [24]. Một nghiên cứu gần đây của Xiao và cộng sự (2003) trên chuột cống cũng cho thấy sau khi uống một liều duy nhất, 3-MCPD được hấp thu tốt vào máu và phân bố chủ yếu ở tinh hoàn và thận. Có khoảng 10% 3-MCPD đào thải nguyên vẹn trong nước tiểu, như vậy có thể 3- MCPD được chuyển hóa chủ yếu ở gan [108]. Một nghiên cứu khác của Jones (1978) tiến hành trên chuột cống được tiêm phúc mạc 3-MCPD và nhận thấy có khoảng 30% 3-MCPD đào thải ở dạng chuyển hóa thành CO2 qua hô hấp và khoảng 8,5% đào thải nguyên vẹn trong nước tiểu, nhưng tác giả không nhận thấy có sự tích lũy có chọn lọc của 3-MCPD trên các mô [48]. 3-MCPD được giải độc bởi sự liên kết với glutathion tạo ra sản phẩm S-(2,3- dihydroxypropyl) cystein và N-acetyl-S-(2,3-dihydroxypropyl) cystein (Jones, 1975) [52]. Ngoài ra, 3-MCPD cũng bị oxy hóa thành acid beta-clorolactic và acid oxalic [51],[65]. 1.1.3. Sự hình thành độc tố 3-MCPD 3-MCPD được hình thành do kết quả của quá trình phản ứng giữa chất béo (triglycerid) với một nguồn có chứa Cl- trong thực phẩm (ví dụ: muối ăn, hay acid hydrocloric) hoặc phản ứng với một thành phần nào đó trong thực phẩm dưới sự xúc tác của nhiệt độ (chiên, nướng, …). Tuy nhiên, tùy loại thực phẩm cũng như thời gian, nhiệt độ chế biến mà lượng 3-MCPD được tạo ra là nhiều hay ít. Tóm lại, về lý thuyết thì tất cả những chất nào hội tụ đủ 3 điều kiện: “có chứa thành phần Cl- + chất béo + nhiệt” đều có thể sản sinh ra 3-MCPD. Ngoài ra, quá trình thủy phân protein thực vật bằng acid hydrocloric (HCl) trong sản xuất nước tương còn là nguồn phổ biến tạo ra độc tố 3-MCPD [99]. Trong nguyên liệu sản xuất nước tương có hai thành phần chính là protein và chất béo từ bánh dầu đậu phộng (hoặc bã đậu nành). Khi nấu ở nhiệt độ trên 100oC, phản ứng thủy phân xảy ra làm phân giải các mạch protein thành các acid amin, đồng thời chất béo cũng được thủy phân thành
6 glycerol và acid béo. Sau đó, glycerol tham gia phản ứng thế với gốc Cl- của HCl tạo thành 3-MCPD và 1,3-DCP. CH2-O-COR H2O CH2-OH OH CH-O-COR CH-OH + 3R CH2-OCOR H+ CH2-OH O (Triglycerid) (Glycerol) (Acid béo) Cl- CH2-OH CH2-Cl CH-OH CH-OH CH2-Cl CH2-Cl (3-MCPD) (1,3-DCP) Sơ đồ 1.1. Sự hình thành độc tố 3-MCPD 1.1.4. Các sản phẩm chứa 3-MCPD Trong một nghiên cứu của Velisek (2000) trên các sản phẩm được chế biến trong môi trường acid kèm sự hiện diện của gốc Cl- (NaCl) ở nhiệt độ cao hoặc có hạn dùng dài trong điều kiện bình thường, cho thấy phần lớn đều có sự hình thành 3- MCPD (Bảng 1.1). Mặc dù hàm lượng 3-MCPD hiện diện ở mức thấp, tuy nhiên điều này giúp cảnh báo cho các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam, cần phải lưu tâm hơn đến công nghệ chế biến thực phẩm và theo dõi hàm lượng 3- MCPD trên những sản phẩm khác, không chỉ riêng nước tương [100]. Bảng 1.1. Khảo sát hàm lượng 3-MCPD trong một số thực phẩm ở nước Anh [100] Thực phẩm Hàm lượng cao nhất (mg/kg) Số mẫu có 3-MCPD/số mẫu phân tích Bánh quy 0,032 4/12 Bánh quy mặn 0,13 16/17 Bánh mì 0,049 14/30 Bánh nướng 0,088 14/17 Thịt hộp 0,042 6/15
7 Thực phẩm Hàm lượng cao nhất (mg/kg) Số mẫu có 3-MCPD/số mẫu phân tích Xúc xích 0,069 9/20 Phô-mai 0,031 4/30 Cá khô 0,081 4/6 1.1.5. Giới hạn cho phép về nồng độ 3-MCPD  Tiêu chuẩn về nồng độ 3-MCPD cho phép ở một số nước Trước đây các chuyên gia về thực phẩm của liên minh Châu Âu gợi ý rằng 3- MCPD phải ở mức không thể phát hiện được bằng phương pháp phân tích hiện đại nhất (có nghĩa là “3-MCPD không được tồn tại trong thực phẩm”). Tuy nhiên, sau khi những nghiên cứu mới nhất được công bố, các chuyên gia này đã khuyến cáo mức sử dụng tối đa hằng ngày là 0,002 mg/kg thể trọng [97]. Nhìn vào bảng 1.2, chúng ta có thể thấy quy định ở Anh quốc, liên minh Châu Âu và kể cả Malaysia là chặt chẽ nhất, chỉ cho phép 3-MCPD tối đa 0,01 mg/kg và 0,02 mg/kg nước tương, trong khi đó một số nước khác con số này gấp 10 lần. Bảng 1.2. Nồng độ tối đa 3-MCPD/nước tương cho phép ở một số quốc gia [97] Nồng độ tối đa 3-MCPD cho phép trong Quốc gia 1 kg nước tương Canada, Phần Lan, Áo, Các tiểu vương quốc Ả-rập 1 mg/kg 1 mg/kg cho 3-MCPD và Mỹ 0,05 mg/kg cho 1,3-DCP 0,2 mg/kg cho 3-MCPD và Úc và New Zealand 0,005 mg/kg cho 1,3-DCP Liên minh Châu Âu, Hà Lan, Hy Lạp, Bồ Đào Nha, 0,02 mg/kg Malaysia, Thụy Điển Anh quốc 0,01 mg/kg  Cơ sở để đưa ra các số liệu trên • Dựa vào liều tối đa cho phép cơ thể dung nạp trên một ngày: cho đến nay FAO/WHO khuyến cáo liều tối đa cho phép cơ thể có thể dung nạp 3-MCPD là 2 microgam/kg thể trọng (0,002 mg/kg), hay một người cân nặng 50kg có thể thu nạp tối đa 0,1 mg 3-MCPD/ngày. Con số 0,002 mg/kg này là dựa trên kết quả nghiên
8 cứu ở chuột, cho thấy liều thấp nhất có thể gây độc cho chuột là 1,1 mg/kg [97]. Sau đó con số này được chia cho một hệ số chuyển đổi giữa các loài sinh vật khác nhau (chuột và người), và các nhà khoa học đã đưa ra hệ số 500. Mức 0,002 mg/kg thể trọng được gọi là mức thu nạp có thể chấp nhận được mỗi ngày (tolerable daily intake, TDI), chặt chẽ hơn phải gọi là định mức tạm thời cho phép cơ thể thu nạp mỗi ngày (provisional maximum tolerable daily intake, PMTDI), bởi vì chưa có số liệu nghiên cứu cụ thể trên người, chỉ là ước tính từ chuột. • Dựa trên tổng lượng nước tương tiêu thụ trung bình mỗi ngày: mỗi quốc gia cần phải tiến hành nghiên cứu khảo sát xem người dân của mình hiện đang thu nạp mức 3-MCPD và tiêu thụ sản phẩm nước tương trung bình bao nhiêu trên một ngày (dựa trên các sản phẩm nước tương hiện lưu hành); ngoài ra họ phải tính toán đến số lượng một người dùng tối đa trong một ngày là bao nhiêu (bảng 1.3) [97]. Bảng 1.3. Mức độ tiêu thụ 3-MCPD mỗi ngày của người dân ở một số quốc gia [97] Mức tiêu thụ trung bình Mức tiêu thụ cao nhất Quốc gia (mg/người/ngày) (mg/người/ngày) 0,4 (khoảng 10% dân số) Úc 0,2 9,3 (khoảng 5% dân số) Nhật 0,54 1,1 (khoảng 5% dân số) Mỹ 0,1 0,29 (khoảng 10% dân số) Bảng 1.3 cho thấy người Nhật thu nạp 3-MCPD mỗi ngày cao hơn so với Úc và Mỹ, trong đó có khoảng 5% dân số Nhật tiêu thụ ở mức 1,1 mg 3-MCPD/ngày. Như vậy, nếu tính trên mức cho phép thu nạp 3-MCPD mỗi ngày (0,002 mg/kg), và với một người trung bình (60kg) thì liều 3-MCPD tối đa cho phép mỗi ngày là 0,12 mg (60 x 0,002). Vậy người dân Nhật trung bình đã tiêu thụ vượt ngưỡng quy định khoảng 4,5 lần. Con số này sẽ vượt mức rất nhiều lần nếu tính riêng cho từng cá thể, thí dụ như trẻ em, hoặc những người ăn chay trường, sử dụng nhiều nước tương. Ở Việt nam, quy định về vệ sinh an toàn thực phẩm đã giới hạn hàm lượng tối đa cho phép sự hiện diện của 3-MCPD trong 1 kg nước tương là 1 mg/kg. Quy định này được cho là an toàn sức khoẻ cho người tiêu dùng [9].