Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:222

Thêm vào BST

Báo xấu

57
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xây dựng được công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm; Xây dựng được công thức và quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm; Đề xuất được tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat; Đánh giá được tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo của tiểu phân nano artesunat

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HỒ HOÀNG NHÂN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO ARTESUNAT PHA TIÊM HƢỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HỒ HOÀNG NHÂN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO ARTESUNAT PHA TIÊM HƢỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 62720402 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến GS. TS. Chul Soon Yong HÀ NỘI, NĂM 2019
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả NCS. Hồ Hoàng Nhân
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện luận án, tôi đã nhận được nhiều sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu từ các thầy, cô, các nhà khoa học, các anh chị em, các bạn bè đồng nghiệp và gia đình. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến, GS. TS. Chul Soon Yong, hai người thầy đã nhiệt tình hướng dẫn, hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Trường Đại học Y Dược – Đại học Huế đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong thời gian vừa qua. Lời cảm ơn tiếp theo, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các thầy cô, các cán bộ nhân viên, các anh chị học viên, các bạn sinh viên của Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia, Bộ môn Bào chế, Bộ môn Công nghiệp dược, Bộ môn Vật lý – Hóa lý, Phòng Sau đại học – Trường Đại học Dược Hà Nội, cùng các thầy cô, các đồng nghiệp của Khoa Dược, Bộ môn Bào chế - Công nghiệp dược thuộc Trường Đại học Y Dược – Đại học Huế đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi có thể hoàn thành luận án này. Tôi cũng xin cám ơn các thầy cô, các bạn bè thuộc Khoa Dược - Trường Đại học Yeungnam - Hàn Quốc, đặc biệt TS. Trần Tuấn Hiệp, TS. Nguyễn Hạnh Thủy, GS. TS. Jong Oh Kim, cũng như các thầy cô, các bạn bè thuộc Viện Dược – Trường Đại học Tartu - Estonia, đặc biệt GS. TS. Jyrki Heinamaki, PGS. TS. Karin Kogermann, GS. TS. Ain Raal đã giúp đỡ và hướng dẫn tôi rất tận tình trong quá trình làm thực nghiệm tại hai cơ sở nói trên. Góp phần không nhỏ để đạt được các kết quả của luận án, tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của các cô chú, các anh chị thuộc công ty cổ phần Dược phẩm TW 1, công ty cổ phần Dược phẩm Sao Kim, công ty cổ phẩn Dược phẩm Pymepharco, công ty cổ phần Dược TW Medipharco, Phòng thí nghiệm Hiển vi điện tử và Vi phân tích thuộc Viện Tiên tiến Khoa học và Công nghệ - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Khoa Hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, thực phẩm và mỹ phẩm Thừa Thiên Huế, Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa học, Phòng Hiển vi điện tử - Viện Khoa học vật liệu, Phòng
Thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ về nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị, kỹ thuật giúp tôi có thể hoàn thành luận án này. Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến nhà xuất bản Taylor & Francis, Hidawi, Bộ Y tế, Trường Đại học Dược Hà Nội đã xét duyệt và đăng tải các kết quả nghiên cứu được sử dụng trong luận án này trên các tạp chí Drug Development and Industrial Pharmacy, Journal of Nanomaterials, Tạp chí Dược học, Tạp chí Nghiên cứu Dược và Thông tin thuốc. Lời cám ơn cuối cùng tôi muốn dành tặng cho những người thân trong gia đình và bạn bè, đặc biệt gia đình bố mẹ nội ngoại, vợ và hai con đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ và hy sinh rất nhiều để tôi có thể học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 NCS. Hồ Hoàng Nhân
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 2 1.1. Đại cƣơng về artesunat .......................................................................................... 2 1.1.1. Công thức ................................................................................................ 2 1.1.2. Tính chất vật lý ........................................................................................ 2 1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của artesunat ................................... 2 1.1.4. Các phương pháp định lượng artesunat ..................................................... 4 1.1.5. Tác dụng ức chế tế bào ung thư................................................................. 5 1.1.6. Cơ chế gây tác dụng ức chế tế bào ung thư ................................................ 8 1.2. Tiểu phân nano polyme .......................................................................................... 9 1.2.1. Đặc điểm ................................................................................................. 9 1.2.2. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme ............................... 10 1.2.3. Vài nét về việc cải thiện đặc tính bề mặt của tiểu phân nano PLGA bằng chitosan hoặc PEG ................................................................................................. 11 1.2.4. Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ............. 14 1.2.5. Phương pháp đưa tiểu phân nano vào dạng thuốc tiêm ............................. 18 1.2.6. Một số nghiên cứu về tiểu phân nano PLGA chức năng hóa bề mặt bằng cách kết hợp với chitosan hay PEG hóa .................................................................. 19 1.3. Ứng dụng công nghệ nano trong điều trị bệnh ung thƣ ...................................25 1.3.1. Đặc điểm sinh học của khối u liên quan đến việc thiết kế hệ mang thuốc nano ...................................................................................................................... 25 1.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano .................... 26 1.3.3. Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thư ...................... 27
1.3.4. Một số nghiên cứu về tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano chứa dẫn chất của artemisinin................................................................................. 28 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 33 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................... 33 2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 33 2.1.2. Tế bào và động vật thí nghiệm ................................................................ 34 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ................................................................................ 34 2.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................................. 35 2.3. Nội dung nghiên cứu............................................................................................. 36 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 36 2.4.1. Bào chế tiểu phân nano artesunat ............................................................ 36 2.4.2. Đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat ............................. 41 2.4.3. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ................. 46 2.4.4. Đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat................................................................................................................ 47 2.4.5. Theo dõi độ ổn định ............................................................................... 52 2.4.6. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo ...................... 53 2.4.7. Xử lý số liệu .......................................................................................... 56 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................57 3.1. Kết quả bào chế tiểu phân nano artesunat......................................................... 57 3.1.1. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi và hấp phụ vật lý .................................................................................... 57 3.1.2. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS bằng phương pháp phun điện trường ................................................................................................................... 64 3.1.3. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-PEG ............................................... 69 3.2. Kết quả đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat ..................... 80 3.2.1. Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-CS .................................................. 80 3.2.2. Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-PEG ................................................ 84 3.3. Kết quả bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat........88 3.3.1. Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat ............................... 88 3.3.2. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 20 mg ....... 93
3.4. Kết quả đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat..............................................................................................................95 3.4.1. Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 95 3.4.2. Hình thái của tiểu phân nano ART/PLGA-PEG sau đông khô .................. 96 3.4.3. Phổ nhiễu xạ tia X .................................................................................. 96 3.4.4. Phân tích phổ hồng ngoại ....................................................................... 97 3.4.5. Phân tích nhiệt vi sai .............................................................................. 98 3.4.6. Khả năng giải phóng hoạt chất in vitro .................................................... 98 3.5. Kết quả đề xuất tiêu chuẩn cơ sở và độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ................................................................................... 99 3.5.1. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat................................................................................................................ 99 3.5.2. Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ..... 100 3.5.3. Độ ổn định của hỗn dịch chứa tiểu phân nano artesunat sau khi phân tán lại ........................................................................................................................... 105 3.6. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat ...........................................................106 3.6.1. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro của tiểu phân nano artesunat.............................................................................................................. 106 3.6.2. Đánh giá tác dụng ức chế khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat ..... 110 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN .........................................................................................113 4.1. Bào chế tiểu phân nano artesunat .....................................................................113 4.1.1. Đối với trường hợp sử dụng PLGA và chitosan ..................................... 113 4.1.2. Đối với trường hợp sử dụng PLGA và PEG ........................................... 119 4.2. Đánh giá các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat ...........................124 4.2.1. Đối với trường hợp sử dụng PLGA và chitosan ..................................... 124 4.2.2. Đối với trường hợp sử dụng PLGA và PEG ........................................... 126 4.3. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ....................128 4.4. Đánh giá các đặc tính lý hóa, vi sinh của bột đông khô ..................................133 4.5. Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm .............................................................136 4.6. Tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và in vivo ..........................................138
4.6.1. Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro ................................................. 138 4.6.2. Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo.................................................. 141 4.7. Đóng góp mới của luận án .................................................................................146 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................147 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril AFM Kính hiển vi lực nguyên tử (Atomic Force Microscopy) ART Artesunat ATN Artemisinin ATNs Artemisinin và dẫn chất C6 Coumarin 6 CD Cyclodextrin CS Chitosan DCM Dicloromethan DHA Dihydroartemisinin DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Acid deoxyribonucleic DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential Scanning Calorimetry) EPR Hiệu ứng tăng tính thấm và lưu giữ (Enhanced Permeability and Retention effect) FDA Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration) FT-IR Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier transform Infrared Spectroscopy) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) i.p. Đường tiêm màng bụng (Intraperitoneal injection) i.v. Đường tiêm tĩnh mạch (Intravenous injection) KTTP Kích thước tiểu phân trung bình theo cường độ (Z-Average, Intensity Distribution) LC-MS Sắc ký lỏng, khối phổ (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry) LLC Ung thư phổi Lewis ở chuột (Lewis Lung Cancer)
MPS Hệ thực bào đơn nhân (Mononuclear Phagocytic System) NP/s Tiểu phân nano (Nanoparticle/s) PBS Phosphat Buffer Salin PDI Hệ số đa phân tán (Polydispersity Index) PEG Poly ethylen glycol PLGA Acid poly(lactic-co-glycolic) PL Phụ lục PM Hỗn hợp vật lý (Physical mixture) RES Hệ lưới nội mô (Reticulo-Endothelial System) ROS Các gốc oxy hoạt động (Reactive Oxygen Species) SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy) SRB Sulforhodamine B TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy) TP nano Tiểu phân nano XRD Phổ nhiễu xạ tia X (X-Ray Diffraction)
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1. Các nghiên cứu về tác dụng ức chế sự phát triển khối u in vivo trên chuột của artemisinin và dẫn chất ............................................................................................. 6 Bảng 1.2. Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thư ........................ 27 Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng ..................................................... 33 Bảng 3.1. Ký hiệu và các mức của biến độc lập............................................................ 59 Bảng 3.2. Ký hiệu, các mức của biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa ..................... 60 Bảng 3.3. Các công thức thực nghiệm và đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS .......................................................................................................................................60 Bảng 3.4. Công thức tối ưu của TP nano ART/PLGA-CS............................................63 Bảng 3.5. Kết quả một số đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS bào chế theo công thức tối ưu (n=3) ...................................................................................................63 Bảng 3.6. Các mức và thông số thiết yếu của quá trình phun điện trường kép tạo TP nano nhân - vỏ ART/PLGA-CS .................................................................................... 64 Bảng 3.7. Ký hiệu và các mức của các biến độc lập ..................................................... 72 Bảng 3.8. Ký hiệu của các biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa ............................. 72 Bảng 3.9. Các công thức thực nghiệm bào chế TP nano ART/PLGA-PEG .................73 Bảng 3.10. Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm MODDE 8.0 .......................................77 Bảng 3.11. Một số đặc tính TP nano bào chế theo công thức tối ưu (n=3) ................... 78 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của phương pháp tinh chế hỗn dịch nano ART ....................... 79 Bảng 3.13. So sánh một số đặc điểm của quá trình bào chế các TP nano PLGA bao CS hay PEG ......................................................................................................................... 88 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tá dược tạo bánh đến chất lượng sản phẩm đông khô .......89 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thể tích đến hình thức sản phẩm đông khô ........................ 92 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của thời gian đông khô đến chất lượng sản phẩm ................... 93 Bảng 3.17. Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART ................95 Bảng 3.18. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART .....................................................................................................................................100 Bảng 3.19. Chỉ tiêu hình thức, thời gian phân tán lại của bột đông khô sau thời gian bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) ..........................101
Bảng 3.20. Hàm lượng nước, kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân sau khi phân tán lại của bột đông khô chứa TP nano ART bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và ở điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) (n=3)..................................................................102 Bảng 3.21. Phần trăm hàm lượng ART, giới hạn tạp chất và độ vô khuẩn trong bột đông khô bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC ......................................................................103 Bảng 3.22. Độ ổn định của hỗn dịch chứa TP nano ART sau khi phân tán lại trong 4 giờ ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) ...................................106 Bảng 3.23. Giá trị IC50 của các công thức bao PEG đối với tế bào LLC...................110 Bảng 3.24. Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm khi dùng đường tiêm tĩnh mạch đuôi (n=6) ....................................................................................................................110 Bảng 3.25. Sự phát triển của khối u khi tiêm tĩnh mạch đuôi .....................................111
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ART ............................................................................2 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS ............................. 37 Hình 2.2. Minh họa quá trình phun điện trường kép trong bào chế TP nano dạng nhân – sợi ............................................................................................................................... 38 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tinh chế bằng cột lọc tiếp tuyến ...........................................40 Hình 2.4. Sơ đồ quy trình bào chế TP nano ART/PLGA-PEG sử dụng PLGA-PEG ...40 Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế khối u in vivo của bột pha tiêm chứa TP nano ART trên mô hình chuột gây u bằng dòng tế bào LLC khi dùng đường tiêm tĩnh mạch đuôi .......................................................................................................56 Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ CS và PLGA tới KTTP và thế zeta của TP nano ART (n=3) .............................................................................................................................. 57 Hình 3.2. Ảnh hưởng của pH dung dịch CS đến đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS (n=3) ...................................................................................................58 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ hấp phụ CS đến đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS (n=3) ...................................................................................................59 Hình 3.4. Hình ảnh mặt đáp của KTTP ở các điều kiện khác nhau: khi nhiệt độ = 25oC (A), khi pH của dung dịch CS = 4,0 (B), và khi tỉ lệ CS/PLGA (kl/kl) = 0,6; và của thế zeta của TP nano ART/PLGA-CS khi pH của dung dịch CS = 4,0. ............................. 62 Hình 3.5. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức FM1-FM4 ...................................................................................................................... 65 Hình 3.6. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức FM5-FM8 ...................................................................................................................... 66 Hình 3.7. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức FM9-FM12 .................................................................................................................... 67 Hình 3.8. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức: FM13-FM16 ..................................................................................................................68 Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG đến đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................69 Hình 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất/polyme đến đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................70
Hình 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80 đến đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................71 Hình 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha dầu/nước đến đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................71 Hình 3.13. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến KTTP của TP nano ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................74 Hình 3.14. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến PDI của TP nano ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................75 Hình 3.15. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến tỷ lệ nạp thuốc của TP nano ART/PLGA-PEG ............................................................................................ 77 Hình 3.16. Hình ảnh TEM của TP nano ART/PLGA-CS .............................................80 Hình 3.17. Phổ hồng ngoại của ART, CS, PLGA, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano ART/PLGA-CS .............................................................................................................80 Hình 3.18. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ TP nano ART/PLGA và ART/PLGA-CS (n=3) ...................................................................................................81 Hình 3.19. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ bột ART và TP nano ART/PLGA-CS (công thức FM15, ký hiệu NPs) (n= 3) ..............................................83 Hình 3.20. Hình ảnh chụp SEM của TP nano ART/PLGA-PEG ..................................84 Hình 3.21. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano ART/PLGA-PEG (NPs) ................................................................................................ 84 Hình 3.22. Phổ hồng ngoại của ART, PLGA, PLGA-PEG, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano ART/PLGA-PEG (NPs)........................................................................................ 85 Hình 3.23. Phổ 1H-NMR của TP nano ART/PLGA-PEG trong CDCl3, D2O ..............86 Hình 3.24. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ TP nano ART/PLGA-PEG và TP nano ART/PLGA (n=3) ........................................................................................... 87 Hình 3.25. Ảnh hưởng của các tá dược tạo bánh đến sản phẩm sau đông khô (A) và sau khi phân tán lại (B) ..................................................................................................89 Hình 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ saccarose và manitol đến KTTP và PDI trước và sau khi đông khô (n=3) ..................................................................................................90 Hình 3.27. Ảnh hưởng kết hợp tá dược tạo bánh khác nhau đến chất lượng sản phẩm đông khô (n=3) ..............................................................................................................91 Hình 3.28. Hình ảnh bánh bị phồng rộp (A) và bánh còn ướt đáy (B và C) .................92
Hình 3.29. Sản phẩm sau đông khô (A) và sau khi phân tán lại (B) với thời gian sấy sơ cấp 48 giờ ...................................................................................................................... 93 Hình 3.30. Hình ảnh bột đông khô pha tiêm trước (A) và sau khi phân tán lại (B) ......95 Hình 3.31. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-PEG sau đông khô .................... 96 Hình 3.32. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp vật lý (PM_S) và bột đông khô chứa TP nano ART/PLGA-PEG (NPs_S) ............................ 96 Hình 3.33. Phổ hồng ngoại của nguyên liệu (ART, PLGA, PLGA-PEG, saccarose (SAC)), bột đông khô (NPs_S) và hỗn hợp vật lý tương ứng (PM_S) ......................... 97 Hình 3.34. Giản đồ nhiệt vi sai của nguyên liệu (ART, PLGA, PLGA-PEG, saccarose (SAC)), bột đông khô (NPs_S) và hỗn hợp vật lý tương ứng (PM_S) ......................... 98 Hình 3.35. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART sau khi phân tán lại trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 và pH 7,4 (n=3) .............................................................................................................................. 99 Hình 3.36. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp vật lý (PM_S) và bột đông khô chứa TP nano ART/PLGA-PEG ở các thời điểm và điều kiện bảo quản khác nhau .....................................................................................................103 Hình 3.37. Hình ảnh SEM của TP nano ART trong bột đông khô sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3 oC ............................................................................................104 Hình 3.38. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ bột đông khô pha tiêm sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC (n=3) ...................................................................105 Hình 3.39. Khả năng thấm vào tế bào của TP nano C6-PLGA và C6/PLGA-CS trên tế bào MCF-7 (A, B) và tế bào A549 (C, D) ...................................................................107 Hình 3.40. Tỷ lệ tế bào sống sót ở các dòng tế bào, (A) MCF-7, (B) A549 ...............108 Hình 3.41. Hình dáng nhân tế bào dưới kính hiển vi lase quét đồng tiêu cự sau khi xử lý tế bào trong 24 giờ với ART nguyên liệu, TP nano ART/PLGA và ART/PLGA-CS trên tế bào MCF-7 (A) và tế bào A549 (B) .................................................................109 Hình 3.42. Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm khi dùng đường tiêm tĩnh mạch đuôi (n=6) ....................................................................................................................111 Hình 3.43. Sự phát triển của khối u ở chuột sử dụng đường tiêm tĩnh mạch đuôi .....112
ĐẶT VẤN ĐỀ Artemisinin (ATN) và các dẫn chất như artesunat (ART) là sản phẩm của quá trình chiết xuất và bán tổng hợp từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L.. Ngoài tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư [26]. Tuy nhiên, ART là dược chất không bền, độ ổn định phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH cũng như dung môi trong quá trình bào chế và bảo quản. Do đó, nhằm tăng độ ổn định cũng như sinh khả dụng, công nghệ nano có thể được áp dụng. Các dạng bào chế chứa TP nano có khả năng giải phóng thuốc tại đích tác dụng với liều lượng và khoảng thời gian như dự kiến, đặc biệt với các tế bào khối u, kết quả làm tăng hiệu quả điều trị và giảm thiểu độc tính cho cơ thể người bệnh [58]. Bên cạnh liposome, TP nano sử dụng chất mang polyme cũng là một trong những dạng bào chế nano thu hút được khá nhiều nghiên cứu. Một trong những polyme tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học được sử dụng khá phổ biến là acid poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào [116]. Ngoài ra, các polyme thân nước như chitosan (CS) hay PEG có thể được sử dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các tiểu phân nano (viết tắt là TP nano) PLGA như tăng cường sự bám dính sinh học hoặc giúp làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [44]. Trên cơ sở đó, luận án đã được thực hiện với tiêu đề ―Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư” với các mục tiêu bao gồm: 1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm; 2. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm; 3. Đề xuất được tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat; 4. Đánh giá được tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo của tiểu phân nano artesunat. 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về artesunat 1.1.1. Công thức - Công thức cấu tạo CH3 H H3C O O H O H O CH3 OCOCH2 CH2 COOH Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ART - Tên khoa học: (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR) - Decahydro - 3,6,9 - trimethyl - 3,12 - epoxy - 12H - pyrano (4,3 – j) - 1,2 - benzodioxepin - 10 - ol, hydrogen sucinat. - Tên khác: Dihydroartemisinin-12-alpha-succinat; Succinyl dihydro- artemisinin; Quinghaosu reduced succinat este. - Công thức phân tử: C19H28O8 - Khối lượng phân tử: 384,4 g/mol [1]. 1.1.2. Tính chất vật lý Bột kết tinh trắng mịn. Tan được trong nước (khoảng 56,2 mg/l ở 25oC), tan tốt trong dicloromethan (DCM), ethanol và aceton. ART là một acid yếu có pKa bằng 4,6, có hệ số phân bố dầu/nước thay đổi theo các giá trị pH khác nhau, ngoài ra, ART có khả năng tan một phần trong nước ở pH=7,4 do logD7,4 nhỏ nên có thể thích hợp với dạng thuốc tiêm khi chuyển qua dạng muối (như dạng muối kiềm natri). Ở dạng thuốc tiêm, acid artesunic được dùng kết hợp với natri hydrocarbonat để tạo dạng muối natri artesunat ngay trước khi tiêm [1], [20]. 1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của artesunat 1.1.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm Là dẫn chất este của ATN, ART kém ổn định ở nhiệt độ cao và sự có mặt của ẩm. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, ART kém ổn định khi tăng nhiệt độ; ví dụ trong 2
dung dịch natri clorid 0,9% (kl/tt) khi bảo quản ở 9oC, 23oC, 36,5oC thì thời gian ổn định của ART lần lượt là 130 giờ, 10,6 giờ và 1,6 giờ [24]. Độ ổn định của ART đạt được tối đa khi bảo quản thuốc ở 2-8oC [12]. Đồng thời, độ ổn định của ART bị ảnh hưởng mạnh khi có độ ẩm cao. Hàm lượng ART giảm nhanh trên 2%/năm khi bảo bảo quản nguyên liệu ART ở nhiệt độ 30-35oC và độ ẩm tương đối (gọi tắt là độ ẩm) 80-90% [6]. Quá trình phân hủy của thuốc được chứng tỏ có liên quan nhiều đến độ ẩm hơn, ví dụ khi bảo quản ở nhiệt độ 50oC và độ ẩm 60%, thuốc ít bị phân hủy hơn so với khi bảo quản ở nhiệt độ 40oC và độ ẩm 75% [12]. Khi nghiên cứu sự ổn định của ART trong môi trường huyết tương, nhiệt độ cao cũng làm ART kém ổn định. Ví dụ, khi bảo quản ở nhiệt độ 4oC, ART có thể ổn định đến 6 ngày so với 5 giờ ở nhiệt độ phòng (24oC), ở -25oC cho thấy không có sự phân hủy sau 8 tháng [24]. Thời gian bảo quản càng lâu càng dẫn đến sự phân hủy ART, ví dụ ở nhiệt độ 4oC, sau 2, 3, 6 tháng bảo quản thì hàm lượng dược chất lần lượt giảm đến 6-18%, 25-37% và 59-80%; ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ giữa ART và dihydroartemisinin (DHA) càng giảm khi thời gian bảo quản càng kéo dài [102]. Do đó, bột khô là dạng thích hợp nhất để bảo quản như đối với công thức bào chế thuốc tiêm chứa ART để hạn chế sự không ổn định hoặc công thức chỉ được phối trộn với nước ngay trước khi sử dụng. Ngoài ra công thức cần được bào chế trong điều kiện kiểm soát độ ẩm và độ ổn định cần được kiểm tra trong quá trình sản xuất dưới điều kiện kiểm soát độ ẩm và bao gói trong các bao bì tránh ẩm [12]. 1.1.3.2. Ảnh hưởng của pH và xúc tác acid-base nói chung Một số thuốc chịu sự phân hủy trong dung dịch khi cho thêm acid hay base. Phụ thuộc vào pKa, hầu hết các thuốc thường tồn tại ở dạng muối của acid hay base yếu. Do đó, trong dung dịch nước, các phân tử thuốc sẽ phân ly một phần hay hoàn toàn. Mặc dù các hệ đệm thường được dùng trong các dung dịch dược phẩm để điều chỉnh pH của dung dịch nhưng một vài hệ sẽ xúc tác quá trình phân hủy. Các thuốc có nhóm este succinat trong cấu trúc phân tử như ART có thể bị thủy phân khi có mặt nước. Đặc biệt quá trình thủy phân sẽ được thúc đẩy bởi sự hiện diện nhiều hơn của nồng độ ion hydro hoặc hydroxyl hoặc bởi xúc tác acid-base nói chung của hệ đệm. 3
Nói chung, ART kém ổn định ở pH acid. ART thủy phân đáng kể khi pha loãng với dung dịch glucose 5% kl/tt với pH thấp khoảng bằng 5 [24]. Đồng thời, mặc dù tan được trong dung dịch kiềm tuy nhiên lại dễ thủy phân tạo DHA, ví dụ hàm lượng ART giảm còn 92-93% khi đông khô dung dịch ART có pH 9,1-9,5 [2]. Do vậy, các nghiên cứu chỉ ra rằng, giá trị pH để duy trì ổn định của ART nên nằm trong khoảng từ 7,5-8,5 như ở pH 8,2 khi đông khô dung dịch ART, hàm lượng ART vẫn duy trì bằng 98,4% gần như ban đầu [2], thuốc ổn định nhất tại đệm phosphat pH 8 trong điều kiện nhiệt độ 2-8oC và 25oC với hàm lượng còn lại sau 1 tuần lần lượt là 94,5 ± 0,2% và 94,6 ± 0,8% [12]. 1.1.3.3. Ảnh hưởng của các dung môi khác nhau Các nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của các dung môi khan nước đến sự ổn định của ART như ethanol, dimethylsulfoxid (DMSO), PEG 400,… Việc sử dụng ethanol có thể giảm tốc độ phân hủy của ART như quá trình phân hủy chỉ xảy ra sau 3 tháng ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên tạo nhiều sản phẩm khác nhau [71]. Đối với PEG 400, quá trình phân hủy xảy ra chỉ sau 1 tháng tuy nhiên DHA là chất phân hủy duy nhất, đồng thời là chất chống sốt rét khá hiệu quả. Do đó, PEG 400 là tá dược có thể đáng quan tâm do chỉ tạo mỗi DHA [71]. Nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của các hệ dung môi khác nhau đến sự phân hủy của ART trong quá trình bào chế thuốc tiêm đông khô ART. Các dung môi được sử dụng trong khảo sát bao gồm dung môi số 1, nước cất, ethanol, DMSO, hoặc hỗn hợp các dung môi. Kết quả hỗn hợp dung môi số 1 và nước cất được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu vì có khả năng hòa tan các thành phần trong công thức và đảm bảo tránh sự phân hủy dược chất [2]. 1.1.4. Các phương pháp định lượng artesunat - Phương pháp quang phổ UV-Vis: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng thủy phân trong môi trường kiềm ở nhiệt độ 50  1 oC trong 60 phút tạo ra sản phẩm phân hủy có khả năng hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 289  1 nm [1]. - Phương pháp quang phổ huỳnh quang: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng tạo chất huỳnh quang màu nâu xanh với hỗn hợp acid acetic và acid sulfuric (tỉ lệ 2:1) ở nhiệt độ cao 100oC trong 5 phút. Bước sóng kích thích là 303 nm và bước sóng phát xạ tương ứng của ART trong methanol là 609 nm [138]. 4