Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:262

Thêm vào BST

Báo xấu

81
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án xây dựng quy trình bào chế cao khô lá đu đủ rừng; xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và độ ổn định của cao khô lá đu đủ rừng; tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính của cao khô lá đu đủ rừng. Mời các bạn cùng tham khảo luận án để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU B ÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG (Trevesia palmata (Roxb. e x Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU B ÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG (Trevesia palmata (Roxb. e x Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae) Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc Mã số: 9720202 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Võ Xuân Minh 2. PGS.TS. Đỗ Quyên HÀ NỘI – 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi với sự hướng dẫn khoa học của tập thể cán bộ hướng dẫn. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và được công bố một phần trong các bài báo khoa học. Luận án chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có điều gì sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tác giả Lê Thị Thanh Thảo
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các Thầy cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp và những người thân trong gia đình. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng đặc biệt và biết ơn sâu sắc tới: GS.TS. Võ Xuân Minh và PGS.TS. Đỗ Quyên, những người Thầy đã tận tâm hướng d ẫn khoa học, đã luôn động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, lời cảm ơn chân thành tới các Thầy Cô trong: Ban Giám đốc, Viện Đào tạo Dược, Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Sản xuất thuốc, Bộ môn Dược lý - Học viện Quân Y, phòng Sau đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám hiệu cùng các Thầy, Cô Bộ môn Thực vật, Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, Ban Giám hiệu cùng các Thầy, Cô Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Hóa Sinh biển, Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Hà Nội đã tạo điều k iện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông, Ủy ban nhân dân Thành phố Hà Nội, các anh/chị đồng nghiệp, người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận án. Ngày tháng năm 2020 Lê Thị Thanh Thảo
MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ, ký hiệu viết tắt trong luận án Danh mục các hình Danh mục các bảng ĐẶT VẤ N ĐỀ 1 CHƯƠN G 1. TỔN G QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. TỔN G QUAN VỀ ĐU ĐỦ RỪNG 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố 3 1.1.2. Thành phần hóa học 4 1.1.3. Tác dụ ng sinh học và d ược lý 6 1.1.4. Công dụng 7 1. 2. CAO THUỐC 8 1.2.1. Định nghĩa, phân loạ i 8 1.2.2. Kỹ thuật điều ch ế cao thuốc 10 1.3. TỔN G QUAN VỀ TĂN G CƯỜN G MIỄN DỊCH 23 1.3.1. Khái niệm về tăng cường miễn dịch và chất tăng cường miễn dịch 23 1.3.2. Mô hình nghiên cứu đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của một số chế phẩm thảo mộc 24 CHƯƠN G 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠN G PHÁP N GHIÊN CỨU 30 2.1. ĐỐI TƯỢN G NGHIÊN CỨ U 30 2.1.1. Nguyên liệu 30 2.1.2. Động vật thí ngh iệm 30 2.1.3. Thuốc thử, hóa chất và dung mô i 31
2.1.4. Máy móc, trang thiết b ị nghiên cứu 32 2.1.5. Địa điểm ngh iên cứu 33 2.2. PHƯƠN G PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng qu i mô phòng thí ngh iệm 33 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định củ a cao khô lá Đu đủ rừng 46 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng trên đ ộng vật th ực ngh iệm 48 CHƯƠN G 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ CA O KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG QUI MÔ PHÒN G TH Í N GHIỆM 53 3.1.1. Kết quả xác định một số hợp chất chính sử dụng làm chất đánh dấu 53 3.1.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ rừng làm nguyên liệu ch iết xuất 56 3.1.3. Kết quả xây dựng qui tr ình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 72 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨ N CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 88 3.2.1. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của cao khô lá Đu đủ rừng 88 3.2.2. Kết quả đ ánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 95 3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁ C DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG TRÊN ĐỘNG VẬ T THỰC NGHIỆM 100 3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng 100
3.3.2. Đánh giá độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng 108 CHƯƠN G 4. BÀN LUẬ N 119 4.1. VỀ XÂ Y DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 119 4.1.1. Về xác định nhóm h ợp chất chính sử dụng làm chất đánh dấu trong xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 119 4.1.2. Về lựa chọn 2 ph ương pháp đ ịnh lượng 120 4.1.3. Về tiêu chuẩn cơ sở lá Đu đủ rừng 121 4.1.4. Về qui trình bào chế cao lá Đu đ ủ rừng 122 4.1.5. Về thiết b ị ch iết xuất, cô đặc và kết quả bào chế cao 3:1 128 4.1.6. Bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phương pháp phun sấy 129 4.2. VỀ XÂ Y DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤ T LƯỢNG VÀ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CA O KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 135 4.2.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở 135 4.2.2. Về đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 136 4.3. VỀ TÁC DỤNG TĂ NG CƯỜNG MIỄN DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 136 4.3.1. Tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng 136 4.3.2. Độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng 143 KẾT LUẬN 145 KIẾN NGH Ị 147 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀ I LUẬ N ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢ O PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Viết tắt Phần viết đầy đủ 1. A Độ hấp thụ quang 2. A er Aerosil 3. AO Acid oleanolic 4. BC Bạch cầu 5. C Nồng độ 13 6. C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ carbon 13) 7. CI Carr's compressibility index (Chỉ số nén Carr) 8. CR/DP là tỷ lệ % (khối lượng/khối lượng) của chất rắn trên tổng khối lượng dịch phun sấy 9. cs. Cộng sự 10. Cyc Cyclophosphamid 11. DĐVN Dược điển Việt Nam 12. DM/DL Dung môi/dược liệu (ml/g) 13. ĐĐR Đu đủ rừng 14. EtOH Ethanol 15. HMBC Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) 16. HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) 17. HS chiết Hiệu suất chiết 18. HSPL Hệ số pha loãng 19. HSPS Hiệu suất phun sấy 20. HR-ESI-MS High resolution - electrospray ionization - mass spectroscopy (Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử) 21. IL Interleukin 22. INF Interferon 23. KLCT Khối lượng cơ thể
24. KTTP Kích thước tiểu phân 25. KLRbk Khối lượng riêng biểu kiến 26. LD 50 Lethal Dose 50 (Liều gây chết 50% số con vật thử) 27. LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) 28. LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lượng) 29. M Khối lượng 30. Mal Maltodextrin 31. MeOH Methanol 32. m/z Mass to charge ratio (tỉ lệ khối lượng/điện tích) 33. OA Ovalbumin + Al(OH)3 34. RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) 35. SPN Saponin toàn phần 36. SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) 37. SE Standard error (Sai số chuẩn) 38. STT Số thứ tự 39. TCCS Tiêu chuẩn cơ sở 40. TCMD Tăng cường miễn dịch 41. TD/CR Tá dược/Chất rắn 42. TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) 43. KLLTĐ Khối lượng lách tương đối 44. KLTƯTĐ Khối lượng tuyến ức tương đối 45. TB Trung bình 46. TNF Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử khối u) 47. UV – VIS Ultraviolet-vis ible (Tử ngoại - khả kiến)
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1. Cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lind l.) Vis .,) 4 1.2. Cấu trúc saponin phân lập t ừ Đu đủ rừng 5 1.3. Sơ đồ thiết bị b ể ch iết siêu âm và que siêu âm 15 1.4. Cấu tạo hệ thống phun sấy 22 2.1. Sơ đồ nghiên cứu trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng Cy clophosphamid 49 3.1. Cấu trúc hóa học của các hợp ch ất phân lập t ừ lá Đu đủ rừng 53 3.2. Phổ UV-Vis của mẫu t rắng và mẫu chuẩn 56 3.3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang theo thời gian phản ứng tạo màu 57 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào lượng acid oleanolic chuẩn 58 3.5. Sắc ký đồ củ a mẫu th ử, mẫu chuẩn và mẫu trắng 61 3.6. Đồ th ị mô tả sự phụ thuộ c của diện tích pic vào nồng độ acid oleanolic 62 3.7. Hình ảnh vi phẫ u lá Đu đủ rừng 65 3.8. Hình ảnh soi bộ t lá Đu đủ rừng 66 3.9. Hình ảnh sắc ký đồ TLC dược liệu lá Đu đủ rừng 68 3.10. Ả nh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu v à số lần chiết đến chiết xuất saponin toàn phần 75 3.11. Ả nh hưởng của thời g ian đến chiết xuất saponin toàn ph ần 77 3.12. Sơ đồ tóm tắt các gia i đoạn điều chế cao lá Đu đủ rừng 3:1 87 3.13. Sơ đồ tóm tắt g iai đoạn bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 88 3.14. Kết quả chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) củ a bột cao khô lá Đu đ ủ rừng 89 3.15. H ình ảnh TLC củ a cao khô lá Đu đủ rừng 92
Hình Tên hình Trang 3.16. Hình ảnh TLC t rong theo dõi độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 99 3.17. H ình ảnh vi thể lách chuột ở các lô (HE × 100) 104 3.18. H ình ảnh vi thể tuyến ức chuột ở các lô (HE × 100) 104 3.19. Tương quan g iữa liều dùng theo t ỷ lệ chuột chết 109 3.20. Ả nh đại thể gan, lách và thận chuột ở các lô khác nhau (HE x 25) 116 3.21. H ình ảnh mô bệnh học gan chuột sau 90 ngày uống thuốc (HE x 400) 117 3.22. H ình ảnh mô bệnh học lách chuột sau 90 ngày uống thuốc (HE x 400) 117 3.23. H ình ảnh mô bệnh học thận chuột sau 90 ng ày uống thuốc (HE x 400) 118
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1. Sự phụ thuộc củ a độ hấp thụ quang theo thờ i gian phản ứng tạo màu 57 3.2. Kết quả xác định độ lặp lại và độ đúng của phương pháp UV- Vis 59 3.3. Kết quả xác định t ính tương thích hệ thống HPLC 60 3.4. Diện t ích pic và thờ i gian lưu của các dung d ịch chuẩn ở các nồng độ 61 3.5. Kết quả đánh g iá độ lặp lại và độ đúng t rong ngày và khác ngày 62 3.6. Độ nh iễu nền của sắc ký đồ mẫu chuẩn acid oleano lic 63 3.7. Kết quả xác định tỷ lệ mất khối lượng do làm k hô của bộ t lá Đu đủ rừng 67 3.8. Kết quả xác định hàm lượng tro toàn phần của bột lá Đu đủ rừng 67 3.9. Hàm lượng saponin toàn phần t rong lá Đu đủ rừng 69 3.10. Hàm lượng acid oleanol ic trong lá Đu đủ rừng 70 3.11. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lư ợng t rong tiêu chuẩn cơ sở lá Đu đủ rừng 71 3.12. Ả nh hưởng của phương pháp chiết đ ến chiết xuất sapon in toàn phần 72 3.13. Ả nh hưởng của kích th ước tiểu phân dược liệu đến chiết xuất saponin toàn phần 73 3.14. Ả nh hưởng của dung mô i đến chiết xuất saponin toàn phần 74 3.15. Ả nh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu v à số lần chiết đến chiết xuất saponin toàn phần 74 3.16. Ả nh hưởng của nhiệt độ đến ch iết xuất saponin toàn phần 76 3.17. Ả nh hưởng của thời g ian đến chiết xuất saponin toàn ph ần 76 3.18. Thông số qui trình chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ rừng bằng phương pháp ch iết s iêu âm 77 3.19. Kết quả chiết xuất lá Đu đủ rừng qui mô 2 kg/ mẻ bằng phương pháp chiết siêu âm 78 3.20. Kết quả ch iết xuất, cô đ ặc và loại tạp cao lá Đu đủ rừng 3:1 78 3.21. Công th ức và điều kiện phun sấy khảo sát ảnh hưởng củ a tá dược 79
Bảng Tên bảng Trang 3.22. Ả nh hưởng của lo ại tá dược đến h iệu suất phun s ấy 80 3.23. Công thức và điều kiện phun sấy khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/ch ất rắn 81 3.24. Ả nh hưởng của tỷ lệ tá dược/ch ất rắn đến phun sấy cao Đu đủ rừng 82 3.25. Công thức và điều kiện khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp d ịch 83 3.26. Ả nh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch đến phun sấy cao Đu đ ủ rừng 84 3.27. Công thức và điều kiện khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/dịch phun 85 3.28. Ả nh hưởng của tỷ lệ chất rắn/d ịch phun đến phun sấy cao Đu đủ rừng 85 3.29. Công t hức và thông số qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phun sấy 86 3.30. Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của cao khô lá Đu đủ rừng 90 3.31. Kết quả xác đ ịnh hàm lượng t ro toàn phần của cao khô lá Đu đủ rừng 90 3.32: Kết quả th ử độ n hiễm khuẩn của cao khô lá đu đủ rừng 91 3.33. Hàm lượng saponin toàn phần trong cao khô lá Đu đủ rừng 93 3.34. Hàm lượng acid oleanol ic trong cao k hô lá Đu đủ rừng 94 3.35. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng trong tiêu chuẩn cơ sở cao lá Đu đủ rừng 95 3.36. Sự thay đổi độ ẩm, độ nhiễm khuẩn, hàm lượng saponin toàn ph ần và hàm lượng acid o leanolic của 3 lô theo thời gian b ảo quản 96 3.37. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên khố i lượng lách tương đối 101 3.38. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên khối lượng tuyến ức tương đối 101
Bảng Tên bảng Trang 3.39. Ả nh hưởng của thuốc th ử lên số lượng bạch cầu 102 3.40. Ả nh hưởng của thuốc lên một số loại bạch cầu ở máu ngoại vi 103 3.41 . Kết quả nhận xét giải phẫu bệnh của lách v à tuyến ức 105 3.42 . Ảnh hưởng củ a thuốc thử lên nồng độ IgG máu ngoạ i vi 106 3.43. Ả nh hưởng của thuốc th ử đến phản ứng bì với kháng nguyên OA 106 3.44. Ả nh hưởng của thuốc th ử đến nồng độ IL– 2 107 3.45. Ả nh hưởng của thuốc th ử đến nồng độ TNF-α 108 3.46. M ối tương quan liều lượng và tỷ lệ phần trăm chuột chết sau uống cao khô lá Đ u đủ rừng 109 3.47. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng đối với khối lượng cơ thể chuột 110 3.48. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng đến số lượng hồng cầu và lượng huyết sắc tố trong máu chuột 111 3.49. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên hematocrit và thể tích trung bình hồng cầu trong máu chuột 112 3.50. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên số lượng bạch cầu và tiểu cầu trong máu chuột 113 3.51. Ả nh hưởng củ a cao khô lá Đu đủ rừng đ ối với hoạt độ A ST và ALT 114 3.52. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên các chỉ số albumin và cholesterol toàn phần trong máu 115 3.53. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên nồng độ creatinin máu chuột 115
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh suy giảm miễn dịch là một nhóm các tình trạng khác nhau gây nên do một hay nhiều khiếm khuyết của hệ miễn dịch và biểu hiện trên lâm sàng bởi gia tăng tình trạng dễ mắc nhiều bệnh nhiễm trùng. Ngày nay, các bệnh suy giảm miễn dịch có xu hướng ngày càng gia tăng với hậu quả cấp tính, tái diễn hay mạn tính thường là nặng nề [1]. Hiện nay, cơ quan quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ (US FDA) đã cấp phép cho nhiều thuốc có tác dụng điều trị cho bệnh nhân suy giảm miễn dịch được dùng trên lâm sàng. Các t huốc tăng cường miễn dịch (TCMD) có nguồn g ốc phong phú, các chất có nguồn gốc từ các chế phẩm sinh học (Immunoglobulin, Interferon,…) là sản phẩm công nghệ cao, giá thành còn khá cao. Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược thường có nhiều tác dụng không mong muốn [2]. Có rất nhiều nghiên cứu về tác d ụng TCMD của các loài thực vật đã được thực hiện. Đặc biệt, trong số các nhóm hợp chất thiên nhiên, nhóm chất saponin là nhóm có tác dụng tăng cường miễn dịch nổi bật nhất [3], [4]. Đu đủ rừng (ĐĐR, Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis. họ Nhân sâm Araliaceae) là một cây nhỡ, mọc nhiều và dễ mọc ở bìa rừng hay rừng tái sinh. Với nguyên liệu nghiên cứu là lá, nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có ở các khu vực Hà Giang, Ba Vì, Cúc Phương, Phú Thọ…, nên việc thu hái không làm ảnh hưởng đến môi trường sinh thái hay đa dạng sinh học [5]. Cho đến nay, cây ĐĐR ở Việt Nam mới chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian lấy lõi thân thay cho vị thuốc thông thảo [5]. Trên thế giới cũng chỉ có rất ít nghiên cứu về hóa học và tá c dụng dược lý của loài này [6], [7] và chưa có các chế phẩm nào có tác dụng TCMD từ ĐĐR được nghiên cứu.
2 Xuất phát từ thực tế trên, cần phải nghiên cứu về tác dụng TCMD của ĐĐR để định hướng phát triển thành sản phẩm cho đối tượng bệnh nhân suy giảm miễn dịch đang ngày càng tăng tại Việt Nam và sử dụng được nguồn nguyên liệu dồi dào trong nước, luận án “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae)” được tiến hành với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng được qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng ở qui mô phòng thí nghiệm. 2. Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng và bước đầu đánh giá được độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng. 3. Đánh giá được tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm.
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐU ĐỦ RỪNG Đu đủ rừng (ĐĐR) có tên khoa học là Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis, thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). ĐĐR còn được gọi là Thông thảo gai, Thầu dầu núi, Nhật phiến, Thôi hoang [8], [9]. 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố 1.1.1.1. Đặc điểm thực vật Cây nhỡ cao 7 - 8 m hoặc hơn, thân ít phân nhánh, cành có gai, ruột xốp. Lá đơn, phiến lá phân thuỳ chân vịt, xẻ sâu như lá thầu dầu, có 5 - 9 thuỳ nhọn có răng, gân nổi ở hai mặt, mép lá có răng cưa t hô; cuống lá dài và có gai. Lá non phủ lông mềm, màu nâu nhạt, lá già nhẵn [8], [9]. Lá nhiều kiểu hình, có thể tròn hoặc không tròn ở vòng ngoài; bề ngang từ 30 - 90 cm; gốc lá hình tim rộng; thùy 5 - 10, lá đơn, không bị xẻ ở cây non, xẻ chân vịt ở cây già. Lá chia thùy, thành các thùy lá có hình mác tới hình elip hoặc bị xẻ với nhiều hình dạng. Các lõm phân thùy nằm ở khoảng giữa tính từ gốc lá đến đỉnh lá, có thể xẻ đến tận gân giữa, tạo thành cuống giả. Đỉnh lá nhọn, mép lá có răng cưa; lông của cành phân nhánh hình khiên hoặc không đồng đều, có bề ngang khoảng 0,1 - 0,3 mm, mọc rậm rạp ở gân giữa và gân chính. Cuống lá kích thước từ 20 x 0,3 cm đến 90 x 1 cm; có thể không có gai hoặc có gai chỉ ở gần gốc lá và ở đỉnh. Lưỡi bẹ lá kèm có kích thước tới 2 cm. Hoa to khoảng 1 cm, màu trắng. Hoa mọc thành tán, ở đỉnh hoặc ở nách, độ dài tổng thể khoảng 60 cm; cụm hoa thứ cấp thường có một tán ở đỉnh và 2 tán hoa ở vị trí đối diện qua điểm phân nhánh chính giữa. Lá bắc hình tam giác, nhọn, dài tới khoảng 3 cm, không bị rụng, có lông tơ dày, thỉnh thoảng xuất hiện các gai có lông cứng dài 1 - 2 mm; lông phủ hình sao không đều, bề rộng tới 1 mm, mọc rậm rạp. Mỗi tán từ 25 - 65 hoa; bề rộng 6 - 10 cm, cuống dài từ 2 -
4 4 cm, lá bắc kích thước từ 0,2 - 1 cm, hình tam giác hẹp, có răng cưa, màu nâu hoặc hơi trắng. Đế hoa hình chuông hoặc hình con quay, kích thước từ 6 x 6 - 9 x 9 mm. Đĩa hoa dạng phòng (flat) hoặc hình vòm; gốc trụ hình đầu kích thước 2 x 1 - 4 x 1 mm. Đài hoa có răng cưa, cánh hoa hình răng, mũi cánh hoa nhọn dài khoảng 1 mm. Hoa 8 - 10 cánh, kích thước thước 5 x 1,6 - 8 x 2,5 mm. Hoa hợp một phần, nhị từ 8 - 10, kích thước bao phấn 2 x 1,5 - 3 x 2,5 mm; chỉ nhị kích thước từ 4 - 6 cm. Hạt phấn có kích thước 25,7 - 32,4 µm. Quả dài 13 -18 mm, có khía; hạt dẹt. Có hoa tháng 5 - 6, có quả tháng 7 - 9 [10]. a. Toàn cây b. Lá c. Hoa Hình 1.1. Cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis.,) *Nguồn: Ảnh c hụp Đu đủ rừng tại Vị Xuyên tỉnh Hà Giang tháng 5 năm 2015 1.1.1.2. Phân bố ĐĐR mọc nhiều và dễ mọc ở những vùng đất ẩm dọc theo các sông, suối, ở thung lũng các rừng phục hồi [11]. Ở nước ta, loài này phân bố ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Ba Vì, Quảng Trị [8], Sơn La, Lào Cai, Tuyên Quang, Hà Giang, Hà Nội, Thái Nguyên, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng [12]. Trên thế giới, chúng có ở Trung Quốc, Bangladesh, Nepal, Ấ n Độ, Thái Lan, Lào, Campuchia [10]. 1.1.2. Thành phần hóa học Cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của ĐĐR kể cả trong nước và nước ngoài vẫn còn rất hạn chế. Một số nghiên cứu chỉ ra,
5 saponin là thành phần chính của loài này với aglycon là acid oleanolic (AO) và hederagenin. Năm 2000, từ cao ethanol (EtOH) lá loài T. palmata Vis. thu hái ở Italia, De Tommasi N. và cộng sự (cs.) đã phân lập được 6 saponin bisdesmosidic mới và 2 saponin triterpenoid đã biết, tất cả các hợp chất phân lập được đều có phần aglycon là AO hoặc dẫn chất của acid này. Theo nghiên cứu này, saponin phân lập từ cây ĐĐR có cấu trúc tương tự như Quil A (phân lập từ loài Quillaja saponaria), đều là saponin triterpenoid có 2 mạch đường (R và R1 ) và chủ yếu là các đường glucose, rhamnose, arabinose; các nhóm thế còn lại như R2 là nhóm methyl (-CH3 ) và dẫn chất oxy hóa của nó (- CH 2OH); R3 đa số là dẫn chất hydroxyl (-OH) [6]. Hình 1.2. Cấu trúc saponin phân lập từ Đu đủ rừng *Nguồn: Theo De Tom masi N. và cs. (2000) [6] Theo kết quả nghiên cứu của Dinda B. và cs. (2010), 6 saponin đã được phân lập và xác định cấu trúc từ Trevesia palmata Vis. trong đó có 3 saponin có aglycon là A O và 2 saponin có aglycon là hederagenin [13]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Panyaphu K. đã sử dụng các phản ứng hóa học để định tính các nhóm chất đặc trưng, kết quả cho thấy trong lá cây T. palmata Vis. thu hái ở miền Bắc Thái Lan có mặt của các nhóm hợp chất phenolic, flavonoid, triterpen và lacton glycosid [14]. Năm 2018, từ lá ĐĐR, Kim B. và cs. đã phân lập được 2 hợp chất triterpen glycosid là hederagenin-3-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-(1 → 3)-α-ʟ- rhamnopyranosyl-(1→2) -α-ʟ-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-ʟ-arabinopyranosid và
6 acid 3-O-α-ʟ-rhamnopyranosyl asiatic cùng với 3 hợp chất đã biết là macranthosid A, α-hederin và ilekudinosid D [15]. Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học của ĐĐR. 1.1.3. Tác dụng s inh học và dược lý Hiện nay, cũng chưa có nhiều nghiên cứu về hoạt tính của các hợp chất và các cao chiết từ ĐĐR. Năm 2000, De Tommasi N. và cs. đã chứng minh dịch chiết từ lá T. palmata và một số saponin phân lập được cùng với các sản phẩm prosapogenin thủy phân đều thể hiện tác dụng chống tăng sinh tế bào trên các dòng tế bào J774 (dòng tế bào ung thư đại thực bào chuột), HEK-293 (dòng tế bào phôi thận người 293), WEHI164 (dòng tế bào u sarcoma xơ) so với chất đối chứng là 6-mercaptopurin [6]. Năm 2012, nghiên cứu của Panyaphu K. và cs. cho thấy, loài T. palmata có hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH (EC50 là 9,3 g tương ứng 14,76 g/mg dịch chiết); hàm lượng phenolic tổng định lượng theo phương pháp cân tính theo acid gallic là 10,86 mg/g dịch chiết [14]. Theo nghiên cứu của Rahman K.M.H. và cs. (2014), cắn methanol (MeOH) từ lá của loài T. palmata có tác dụng giảm đau và hạ đường huyết trên chuột nhắt gây tăng đường huyết thực nghiệm thông qua xét nghiệm dung nạp glucose đường uống. Cắn dịch chiết loài T. palmata làm giảm liều phụ thuộc vào lượng đường trong máu ở chuột thực nghiệm uống glucose. Ở liều 100, 200 và 400 mg/kg cân n ặng chuột thực nghiệm, mức đường huyết giảm tương ứng 17,9, 28,1 và 47,4%, được so sánh với thuốc glibenclamid liều 10 mg/kg cân nặng làm giảm lượng đường trong máu 47,4%. Trong thử nghiệm giảm đau trên mô hình gây đau bằng tiêm acid acetic màng bụng chuột thực nghiệm, ở các liều 50, 100, 200 và 400 mg//kg cân nặng làm giảm số lượng các cơn co thắt bụng lần lượt là 33,3, 40,7, 48,1 và 55,6% so với