Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour. ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:346

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của Luận án nhằm mô tả đặc điểm hình thái thực vật, giám định tên khoa học và xác định đặc điểm vi học hai loài bình vôi thu hái tại Bà Rịa – Vũng Tàu và Yên Bái. Nghiên cứu thành phần hóa học hai loài đã xác định được tên khoa học. Thử độc tính cấp và đánh giá một số tác dụng sinh học. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour. ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG VĂN THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC HAI LOÀI STEPHANIA LOUR. Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG VĂN THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC HAI LOÀI STEPHANIA LOUR. Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62.72.04.06 Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Phạm Thanh Kỳ 2. PGS. TS. Nguyễn Quốc Huy HÀ NỘI, NĂM 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của GS. TS. Phạm Thanh Kỳ và PGS. TS. Nguyễn Quốc Huy. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tác giả Hoàng Văn Thủy
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của Ban lãnh đạo Trường Đại học Dược Hà Nội, các Thầy Cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Phạm Thanh Kỳ, PGS. TS. Nguyễn Quốc Huy đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin chân thành cảm ơn: Các cán bộ - Phòng đào tạo sau đại học - Trường đại học Dược Hà Nội, GS. TS. Nguyễn Thanh Bình, PGS. TS. Nguyễn Viết Thân, PGS. TS. Trần Mạnh Tuyển, PGS. TS. Trần Văn Ơn, PGS. TS. Nguyễn Thu Hằng, TS. Hoàng Quỳnh Hoa, PGS. TS. Nguyễn Thùy Dương. Các thầy cô Bộ môn Thực Vật, Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Dược học cổ truyền và Bộ môn Dược lực - Trường ĐH Dược Hà Nội. Các cán bộ - Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. PGS. TS. Đỗ Thị Thảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đã đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi khi thực hiện luận án này. Nhân dịp này tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, các cán bộ các phòng ban, bộ môn trong Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành Luận án này. Cảm ơn cơ quan bảo hiểm xã hội tỉnh, Sở Y tế Yên Bái đã quan tâm tạo điều kiện cho tôi về vật chất và tinh thần để tôi hoàn thành luận án này Tôi xin trân trọng cảm ơn ông Ly ở Văn Chấn, Yên Bái, và bà Nguyễn Phương Huyền ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, đã giúp tôi thu thập mẫu Bình vôi nghiên cứu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới những người bạn, người thân trong gia đình và nhất là bố, mẹ, vợ và các con đã luôn kịp thời động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành mọi nhiệm vụ Xin trân trọng cảm ơn! Hoàng Văn Thủy
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI VÀ PHÂN BỐ CHI STEPHANIA LOUR. ................... 3 1.1.1. Vị trí phân loại ............................................................................................. 3 1.1.2. Phân bố của chi Stephania Lour. ................................................................. 3 1.2. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI STEPHANIA LOUR. VÀ HAI LOÀI NGHIÊN CỨU .......................................................................................................................... 6 1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Stephania Lour. ....................................................... 6 1.2.2. Đặc điểm thực vật của loài Stephania venosa (Bl.) Spreng ........................ 7 1.2.3. Đặc điểm thực vật của loài Stephania viridiflavens H. S. Lo et M. Yang... 7 1.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHI STEPHANIA LOUR. .................................... 8 1.3.1. Alcaloid ........................................................................................................ 8 Các alcaloid nhóm benzylisoquinolin .................................................................... 8 Các alcaloid nhóm bisbenzylisoquinolin ............................................................... 9 Các alcaloid nhóm aporphin ............................................................................... 11 Các alcaloid nhóm proaporphin .......................................................................... 15 Các alcaloid nhóm protoberberin ....................................................................... 16 Các alcaloid nhóm morphinan ............................................................................ 18 Các alcaloid nhóm hasubanan ............................................................................ 19 Các alcaloid nhóm eribidin (dibenzazonin) ........................................................ 21 Các alcaloid nhóm stephaoxocan ........................................................................ 21 1.3.2. Flavonoid ................................................................................................... 21 1.3.3. Các nhóm chất khác ................................................................................... 21 1.4. THÀNH PHẦN HÓA HỌC HAI LOÀI STEPHANIA VENOSA VÀ STEPHANIA VIRIDIFLAVENS ............................................................................... 21 1.4.1. Thành phần hóa học loài Stephania venosa (Bl.) Spreng. ......................... 21 1.4.2. Thành phần hóa học loài Stephania viridiflavens H.S. Lo & M. Yang ..... 22 1.5. TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ CÔNG DỤNG LOÀI STEPHANIA VENOSA VÀ STEPHANIA VIRIDIFLAVENS ............................................................................... 23 1.5.1. Tác dụng sinh học và công dụng loài Stephania venosa (Bl.) Spreng ...... 23 1.5.2. Tác dụng sinh học và công dụng loài Stephania viridiflavens .................. 28 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................................. 29 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU..................... 29 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ............................................................................. 29
2.1.2. Động vật và các dòng tế bào ung thư thí nghiệm ...................................... 29 2.1.3. Hóa chất, dung môi .................................................................................... 30 2.1.4. Máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ................................................. 30 2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................ 31 2.2.1. Nghiên cứu về thực vật .............................................................................. 31 2.2.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học ............................................................ 32 2.2.3. Thử độc tính cấp và đánh giá tác dụng sinh học........................................ 33 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................... 44 1.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT ................................................ 44 3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật 2 loài nghiên cứu .......................................... 44 3.1.2. Kết quả giám định tên khoa học ................................................................ 50 3.1.3. Đặc điểm vi học 2 loài nghiên cứu ............................................................ 54 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................ 62 3.2.1. Kết quả định tính 2 loài nghiên cứu (M1 và M2) ...................................... 62 3.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ hai loài nghiên cứu ...................... 65 3.2.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập ...................................... 70 3.2.4. Kết quả định lượng alcaloid toàn phần và L- tetrahydropalmatin trong củ 2 loài nghiên cứu..................................................................................................... 99 3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 100 3.3.1. Độc tính cấp của 2 loài nghiên cứu ......................................................... 100 3.3.2. Tác dụng giảm đau của 2 loài nghiên cứu ............................................... 102 3.3.3. Tác dụng chống viêm của 2 loài nghiên cứu ........................................... 104 3.3.4. Hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư của cao chiết tổng và các chất phân lập được từ 2 loài nghiên cứu ........................................................... 106 3.3.5. Hoạt tính chống oxi hóa của 2 loài nghiên cứu ....................................... 108 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 111 4.1. VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT ......................................................................... 111 4.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ..................................................................... 118 4.3. VỀ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC ...................................... 128 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 136
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ đầy đủ, giải nghĩa 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ proton (Proton nuclear magnetic resonance) 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị carbon 13 (Carbon-13 nuclear magnetic resonance) 60 Co Tia gamma từ các đồng vị phóng xạ 60Coban 5-HT Serotonin [α]D Góc quay cực A549 Tế bào ung thư phổi (Human lung carcinoma cells) AchE Acetycholin esterase ADP Adenosin diphosphat AGS Tế bào ung thư dạ dày ở người (Human stomach gastric adenocarcinoma) ALT Alanine transaminase AST Aspartate transaminase BC Tế bào ung thư vú (Human breast cancer cell) BchE Butyrylcholinesterase BuOH Butanol CI Khoảng tin cậy (Confidence interval) COSY Correlated Spectroscopy DĐVN Dược điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl ED50 Liều có tác dụng 50% (Effective dose 50%) ESI-MS Khối phổ - ion hóa điện tử (Electrospray Ionization Mass Spectroscopy) EtOH Ethanol Glc Glucopyranosid Gy Gray - Đơn vị liều hấp thụ bức xạ (jun/kilogam) H358 Tế bào ung thư cuống phổi phế nang (Human lung alveolus carcinoma)
Hela Tế bào ung thư tiền liệt tuyến ở người (Human cervical carcinoma) HepG2 Tế bào ung thư gan ở người (Human hepatocellular carcinoma) HL-60 Tế bào ung thư bạch cầu người (human promyelocytic leukemia cell line) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HNIP Phòng tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội (The herbarium of Hanoi University of Pharmacy) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HSQC Heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy HTCO Hoạt tính chống oxi hoá IC50 Nồng độ ức chế 50% hoạt tính (Half maximal inhibitory concentration) K562 Dòng tế bào bạch cầu người (Human leukemic cell line) LC50 Nồng độ gây chết 50% (Lethal concentration 50%) LD50 Liều gây gây chết 50% (Lethal Dose 50%) MCF7 Tế bào ung thư vú ở người (Human breast carcinoma) MDA-MB-231 Dòng tế bào ung thư vú độc lập với nội tiết tố (Hormone- independent breast cancer cell line) MDA Ung thư vú độc lập với nội tiết tố (Hormone-independent breast cancer) MeOH Methanol MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration) MOLT -3 Tế bào bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính (Acute lymphoblastic leukemia cells) MRC-5 Tế bào phổi phôi thai bình thường (Normal embryonic lung cells) MS Khối phổ (Mass spectrometry) MTT 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-điphenyltetrazol brom NaCMC Natri Carboxymethyl Cellulose NCI Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute) NMDA N-methyl Daspartat
NOESY Phổ hiệu ứng hạt nhân Overhauser (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) OD Mật độ quang học (Optical density) ODC Mật độ quang học của giếng chứng không có mẫu thử ODT Mật độ quang học của mẫu thử OVCAR-8 Dòng tế bào ung thư buồng trứng (Human ovarian cancer cell line) PBMCs Các tế bào bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi của con người (Human peripheral blood mononuclear cells) Ph/đoạn Phân đoạn PRP Huyết tương người giàu tiểu cầu (Human platelet-rich plasma) RNA Acid ribonucleic S. Stephania SKC Sắc ký cột SKOV3 Dòng tế bào ung thư buồng trứng ở người (Human ovarian cancer cell line) SKLM Sắc ký lớp mỏng SRB Sulforhodamin B Stt Số thứ tự TBA Acid thiobarbituric TCA Acid tricloacetic TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) tnc Nhiệt độ nóng chảy TT Thuốc thử TLTK Tài liệu tham khảo UV Phổ tử ngoại VHLKHCNVN Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam VKNTTW Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương WHO World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân bố một số loài thuộc chi Stephania Lour. tại Việt Nam ....................4 Bảng 1.2. Danh mục các chất thuộc nhóm benzylisoquinolin ....................................8 Bảng 1.3. Danh mục các chất thuộc nhóm bisbenzylisoquinolin ...............................9 Bảng 1.4. Danh mục các chất thuộc nhóm aporphin ................................................11 Bảng 1.5. Danh mục các chất thuộc nhóm proaporphin ...........................................16 Bảng 1.6. Danh mục các chất thuộc nhóm protoberberin .........................................16 Bảng 1.7. Danh mục các chất thuộc nhóm morphinan .............................................18 Bảng 1.8. Danh mục các chất thuộc nhóm hasubanan ..............................................19 Bảng 1.9. Danh mục ba chất thuộc nhóm stephaoxocan ..........................................21 Bảng 1.10. Tác dụng sinh học của một số alcaloid có trong loài S. venosa .............25 Bảng 2.1. Thông tin mẫu cao chuẩn bị để thử độc tính và đánh giá tác dụng ..........34 Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong hai mẫu nghiên cứu bằng phương pháp hóa học ................................................................................................62 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của SB1 (CDCl3, 500, 125 MHz, δ ppm) ...................71 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR, HMBC của SB2 (CD3OD, 500, 125 MHz, δ ppm) ...73 Bảng 3.4. Dữ liệu phổ NMR của hỗn hợp 2 chất trong SB3 và chất tham khảo ......74 Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của SB4 và chất tham khảo Stepharin ........................75 Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của chất SE1 và chất tham khảo [23] .........................77 Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của SE3 và chất tham khảo Stephanin .......................80 Bảng 3.8. Dữ liệu phổ NMR của SE5 và chất tham khảo.........................................81 Bảng 3.9. Dữ liệu phổ NMR của SE6 (SDLE1.1) và chất tham khảo ......................83 Bảng 3.10. Dữ liệu phổ NMR của chất SE7 và chất tham khảo [59] .......................85 Bảng 3.11. Dữ liệu phổ 1H-NMR của chất SE8 và chất tham khảo [145] ................86 Bảng 3.12. Dữ liệu phổ 13C-NMR của chất SE8 và chất tham khảo [140]...............87 Bảng 3.13. Dữ liệu phổ NMR của chất SE9 và chất tham khảo ...............................89 Bảng 3.14. Dữ liệu phổ của SVB7 so với chất tham khảo........................................91 Bảng 3.15. Dữ liệu phổ NMR của SVB6.1 và chất tham khảo ................................92 Bảng 3.16. Dữ liệu phổ của SVB12 và chất tham khảo ............................................93 Bảng 3.17. Dữ liệu phổ NMR của SVB13.1 và tham khảo ......................................95 Bảng 3.18. Dữ liệu phổ NMR của SVB8 so với chất tham khảo .............................98 Bảng 3.19. Kết quả định lượng alcaloid toàn phần trong củ 2 loài nghiên cứu ........99 Bảng 3.20. Số lượng chuột nhắt trắng chết khi dùng mẫu thử BV1 ở các mức liều thử .................................................................................................................................100
Bảng 3.21. Số lượng chuột nhắt trắng chết khi dùng mẫu thử BV2 ở các mức liều thử. .................................................................................................................................101 Bảng 3.22. Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau quặn ....................................102 Bảng 3.23. Tác dụng giảm đau trên mô hình mâm nóng ........................................104 Bảng 3.24. Ảnh hưởng của cao BV1 và BV2 lên mức độ phù chân chuột theo thời gian ..........................................................................................................................104 Bảng 3.25. Ảnh hưởng của cao BV1 và BV2 lên khối lượng u hạt trên chuột cống trắng .........................................................................................................................105 Bảng 3.26. Tác động gây độc tế bào ung thư của các mẫu nghiên cứu ..................107 Bảng 3.27. Hoạt tính chống oxi hóa (%) của các mẫu nghiên cứu .........................108 Bảng 4.1. Đặc điểm làm cơ sở giám định tên khoa học [170] ................................112 Bảng 4.2. So sánh tiêu bản loài nghiên cứu mẫu M1 với tiêu bản ơ các phòng tiêu bản (PTB) nước ngoài ....................................................................................................114 Bảng 4.3. So sánh đặc điểm thực vật giữa 2 loài S. venosa (Bl.) Spreng và S.dielsiana Y.C.Wu [23] ............................................................................................................115 Bảng 4.4. Hàm lượng L-tetrahydropalmatin trong củ của một số loài Bình vôi ở Việt Nam .........................................................................................................................126
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Sơ đồ quy trình đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi ...............................35 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình đánh giá tác dụng giảm đau trung ương ..........................36 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình đánh giá tác dụng chống viêm cấp ..................................37 Hình 2.4. Sơ đồ quy trình đánh giá tác dụng chống viêm mạn .................................39 Hình 3.1. Đặc điểm củ và lá của loài M1 ..................................................................44 Hình 3.2. Đặc điểm hoa đực của loài M1 .................................................................45 Hình 3.3. Đặc điểm hoa cái và quả của loài M1 .......................................................46 Hình 3.4. Đặc điểm củ và lá loài M2 ........................................................................47 Hình 3.5. Đặc điểm hoa đực loài M2 ........................................................................48 Hình 3.6. Đặc điểm hoa cái và quả của loài M2 .......................................................50 Hình 3.7. Đặc điểm hình thái loài Stephania venosa (Bl.) Spreng (mẫu M1) thu hái tại Bà Rịa Vũng Tàu ..................................................................................................52 Hình 3.8. Đặc điểm hình thái loài Stephania viridiflavens H.S. Lo & M. Yang (mẫu M2) thu hái tại Văn Chấn, Yên Bái...........................................................................53 Hình 3.9. Vi phẫu thân loài S. venosa .......................................................................54 Hình 3.10. Vi phẫu cuống lá loài S. venosa ..............................................................55 Hình 3.11. Đặc điểm vi phẫu lá của loài S. venosa ...................................................55 Hình 3.12. Một số đặc điểm trong bột củ loài S. venosa ..........................................56 Hình 3.13. Một số đặc điểm trong bột lá loài S. venosa ...........................................57 Hình 3.14. Vi phẫu thân loài S. viridiflavens ............................................................58 Hình 3.15. Vi phẫu cuống lá loài S. viridiflavens .....................................................59 Hình 3.16. Vi phẫu lá loài S. viridiflavens ................................................................60 Hình 3.17. Một số đặc điểm trong bột củ loài S. viridiflavens .................................61 Hình 3.18. Một số đặc điểm trong bột lá loài S. viridiflavens ..................................61 Hình 3.19. Hình ảnh sắc ký đồ TLC của dịch chiết mẫu M1 và M2 ........................64 Hình 3.20. Sơ đồ chiết xuất củ S. venosa ..................................................................66 Hình 3.21. Sơ đồ phân lập các chất từ 66g cắn BuOH .............................................67 Hình 3.22. Sơ đồ phân lập các chất từ 40,5g cắn EtOAc ..........................................67 Hình 3.23. Sơ đồ chiết xuất và phân lập các chất từ củ S. viridiflavens ...................69 Hình 3.24. Sơ đồ phân lập các chất từ 52g cắn BuOH .............................................69 Hình 3.25. Sơ đồ phân lập các chất từ 83,2g cắn CH2Cl2 .........................................70 Hình 3.26. Cấu trúc hóa học các chất SB1 (palmatin) ..............................................71 Hình 3.27. Cấu trúc hóa học và tương tác NOESY của chất SB2 (jatrorrhizin) ......72
Hình 3.28. Cấu trúc hóa học của 2 hợp chất trong SB3 ............................................74 Hình 3.29. Cấu trúc hóa học của SB4 (stepharin) .....................................................75 Hình 3.30. Cấu trúc của SE1 (dehydrocrebanin) ......................................................77 Hình 3.31. Cấu trúc của SE2 (hỗn hợp của các acid béo) .........................................78 Hình 3.32. Cấu trúc của SE3 (stephanin) ..................................................................79 Hình 3.33. Cấu trúc của SE5 (crebanin) ...................................................................81 Hình 3.34. Cấu trúc của SE6 (SDLE1.1) (O-Methylbulbocapnin) ...........................83 Hình 3.35. Cấu trúc hóa học của SE7 (L – tetrahydropalmatin) ...............................84 Hình 3.36. Cấu trúc hóa học của SE8 (β-sitosterol)..................................................86 Hình 3.37. Cấu trúc của SE9 (β-sitosterol-3-O- β –D-glucopyranosid) ...................89 Hình 3.38. Một số tương tác HMBC chính (H→C) và cấu trúc hóa học của SVB7 (roemerin) ..................................................................................................................90 Hình 3.39. Cấu trúc hóa học và một số tương tác HMBC chính (H→C) của SVB6.1 (thaicanin)..................................................................................................................92 Hình 3.40. Cấu trúc hóa học của SVB12 (stepharin) ................................................93 Hình 3.41. Cấu trúc của SVB13.1 (liriodenin) .........................................................95 Hình 3.42. Cấu trúc của SVB2 (capaurin) ................................................................97 Hình 3.43. Cấu trúc của SVB8 (roseosid) .................................................................98 Hình 4.1. Cấu trúc 20 hợp chất phân lập được từ hai loài nghiên cứu: S. venosa và S. viridiflavens .............................................................................................................125
ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Stephania Lour. thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) là một chi lớn, trên thế giới có khoảng 100 loài phân bố ở nhiều nước như Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Myanma, Thái Lan, Lào, Nhật Bản,… [25]. Ở Việt Nam đã công bố có khoảng 22 loài thuộc chi Stephania Lour.. Trong luận án tiến sĩ của Nguyễn Tiến Vững [48] mới nghiên cứu 3 loài: Stephania glabra (Roxb.) Miers thu hái ở Ninh Bình, Stephania kuinanensis H. S. Lo et M. Yang thu hái ở Lạng Sơn, Stephania sp3. (chưa xác định được tên loài vì chưa thu được đủ hoa đực và hoa cái) thu hái ở Quảng Ninh; Luận án tiến sĩ của Nguyễn Quốc Huy [23] nghiên cứu 3 loài: Stephania brachyandra Diels thu hái ở Sapa (Lào Cai), Stephania dielsiana Y. C Wu. thu hái ở Ba Vì (Hà Nội), Stephania sinica Diels thu hái ở Quảng Bình; Luận án tiến sĩ của Ngô Thị Tâm [41] nghiên cứu loài Stephania pierrei Diels mọc ở Bình Định; Luận văn cao học của Vũ Xuân Giang [20] bước đầu nghiên cứu loài Stephania viridaflavens H. S. Lo et M. Yang thu hái ở Sơn La; ngoài ra, Lê Ngọc Liên, Phạm Gia Điền [30] có công bố thành phần hóa học cây bình vôi đỏ (Stephania sp.) chưa xác định rõ tên loài. Trần Thị Thủy, Trần Văn Sung [171] công bố thành phần hóa học loài Stephania rotunda thu hái ở Sơn La. Qua đó cho thấy còn nhiều loài Stephania mọc ở Việt Nam chưa được nghiên cứu đầy đủ. Năm 2014, tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, chúng tôi thu được mẫu Bình vôi có dịch màu đỏ, được người dân địa phương sử dụng làm thuốc khớp. Cùng thời điểm đó, trên địa bàn tỉnh Văn Chấn – Yên Bái, chúng tôi cũng nhận thấy người dân địa phương đang sử dụng loài Bình vôi có dịch màu trắng (có trữ lượng lớn trên địa bàn) để sử dụng chữa mất ngủ, khớp và bệnh dạ dày. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về các mẫu Bình vôi thu hái tại hai địa phương trên. Nhằm xác minh cơ sở khoa học của việc sử dụng hai loài Bình vôi tại Bà Rịa – Vũng Tàu và Văn Chấn – Yên Bái, hướng đến việc tiêu chuẩn hóa dược liệu, tìm kiếm các hợp chất và đánh giá hoạt tính sinh học, để từ đó góp phần nâng cao giá trị sử dụng của hai loài Bình vôi ở Việt Nam, luận án "Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour. ở Việt Nam", đã được thực hiện với các mục tiêu: - Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, giám định tên khoa học và xác định đặc điểm vi học hai loài bình vôi thu hái tại Bà Rịa – Vũng Tàu và Yên Bái. - Nghiên cứu thành phần hóa học hai loài đã xác định được tên khoa học. - Thử độc tính cấp và đánh giá một số tác dụng sinh học. 1
Để thực hiện được 3 mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung sau: Về mặt thực vật: - Thu hái mẫu có đủ hoa đực, hoa cái, phân tích đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học hai mẫu nghiên cứu. - Xác định đặc điểm vi phẫu thân, cuống lá, lá, đặc điểm bột củ hai loài nghiên cứu. Về thành phần hóa học: - Định tính các nhóm chất chính trong củ hai loài nghiên cứu. - Định lượng alcaloid toàn phần và rotundin trong củ hai loài. - Chiết xuất, phân lập các hợp chất trong củ hai loài. - Xác định cấu trúc hóa học các chất đã phân lập được. Về độc tính và tác dụng sinh học: - Thử độc tính cấp của cao chiết ethanol 70% hai loài nghiên cứu. - Đánh giá tác dụng giảm đau của cao chiết ethanol 70% hai loài nghiên cứu. - Đánh giá tác dụng chống viêm cấp và mạn của cao chiết ethanol 70% hai loài nghiên cứu. - Đánh giá tác dụng gây độc trên một số dòng tế bào ung thư và tác dụng chống oxy hóa các chất phân lập được và cao chiết toàn phần. 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI VÀ PHÂN BỐ CHI STEPHANIA LOUR. 1.1.1. Vị trí phân loại Chi Stephania Lour. được João de Loureiro (1717-1791) đặt tên lần đầu tiên vào năm 1790, sau đó tiếp tục được nhiều nhà phân loại thực vật nghiên cứu và hoàn thiện dần như Hook & Thoms (1855), Benth & Hook (1862), Miers (1866), Contr. (1871), Diels (1910), Forman (1956), Lo (1978) [129], [208]. Các hệ thống phân loại phần lớn hiện nay đều xếp chi Stephania Lour. vào họ Tiết dê (Menispermaceae) thuộc bộ Hoàng liên (Ranunculales) [60], [69]. Riêng Thorn cũng xếp chi Stephania Lour. vào họ Tiết dê nhưng ở bộ Hoàng liên gai (Berberidales) [60]. Các nhà khoa học Việt Nam như Nguyễn Tiến Bân [3], [4], Lê Khả Kế [25], Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến [10], Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn [6] đều tán đồng hệ thống phân loại của Takhtajan [168] (được chỉnh sửa thêm năm 1996) là bỏ bậc phân loại phân bộ Menispermineae, và đi đến kết luận chi Stephania Lour. có vị trí trong hệ thống phân loại thực vật như sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae) Bộ Hoàng liên (Ranunculales) Họ Tiết dê (Menispermaceae) Chi Stephania Lour. Chi Stephania Lour. có quan hệ họ hàng gần gũi với 2 chi khác là Cissampelos L. và Cyclea Arn. Ex Wight do cùng là dây leo, có cuống đính vào phiến lá, bộ nhị có các nhị liền nhau thành một trụ, bao phấn hàn liền thành 1 bệ ngang; khác nhau ở chỗ cụm hoa của chi Stephania Lour. là xim tán kép, còn của 2 chi Cissampelos L. và Cyclea Arn. Ex Wight là xim tán đơn (hay ngù) [4], [129], [170], [208]. 1.1.2. Phân bố của chi Stephania Lour. 1.1.2.1. Phân bố của chi Stephania Lour. trên thế giới Chi Stephania Lour. phân bố khắp thế giới trong đó tập trung nhiều ở các nước vùng nhiệt đới, á nhiệt đới như: Trung Quốc (43 loài), Thái Lan (18 loài), Indonesia (17 loài), Việt Nam (22 loài), các nước châu Phi (12 loài), Malaysia (11 loài), Ấn Độ (11 loài), Philippin (8 loài), Papua New Guinea (8 loài), Australia (7 loài), Myanma (5 loài), Đài Loan (5 loài), khu vực Hymalaya (3 loài), Campuchia (3 loài), 3
Nhật Bản (2 loài), Sri Lanka (2 loài), Lào (2 loài), Đông Timor (1 loài), Quần đảo Solomon (1 loài), Banglades (1 loài), Nepal (1 loài)… 1.1.2.2. Phân bố của chi Stephania Lour. tại Việt Nam Theo các tài liệu đã công bố ở Việt Nam có 22 loài Bình vôi, thường mọc hoang từ vùng núi cao đến vùng đồng bằng, ven biển, có loài mọc ngay trên bãi cát hoặc gò hoang vùng ven biển (S. pierei Diels.). Các loài phân bố rộng khắp trên cả 3 miền, từ miền Bắc (Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Yên Bái, Lào Cai, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Phú Thọ, Hà Giang, Sơn La, Nam Định, Ninh Bình) đến miền Trung (Thanh Hóa, Nghệ An, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Ninh Thuận, Quảng Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Bình Định, Phú Yên) và miền Nam (An Giang, Đồng Nai, Sông Bé, Bà Rịa-Vũng Tàu),… Phân bố của một số loài thuộc chi Stephania Lour. tại Việt Nam được trình bày ở Bảng 1.1. Bảng 1.1. Phân bố một số loài thuộc chi Stephania Lour. tại Việt Nam Stt Tên loài Tên Việt Nam Phân bố TLTK S. brachyandra Bình vôi núi cao, Lai Châu, Lào Cai [11], [13], 1. Diels Bình vôi nhị [38], [43] ngắn S. cambodica Bình vôi Đắc Lắc, Lâm Đồng [11], [13], 2. Gagnep. Campuchia [44] S. cepharantha Hán phòng kỷ, Quảng Ninh (Cẩm [11], [13], 3. Hayata Bình vôi hoa đầu Phả, Hòn Gai), Hòa [38], [43], Bình (Kỳ Sơn) [44] S. dielsiana Y.C. Củ dòm, củ gà Lào Cai, Yên Bái, [11], [13], Wu ấp, bình vôi nhựa Bắc cạn, Thái [38], [43], tím, cà tòm (Tày, Nguyên, Sơn La, [44], [36] 4. Tuyên Quang) Hòa Bình, Phú Thọ, Hà Tây, Bắc Giang, Bắc Ninh, Quảng Ninh S. excentrica H.S. Bình vôi Vùng núi [13], [44] 5. Lo S. glabra (Roxb.) Ngải tượng, củ Hà Tây, Hòa Bình, [29], [33], Miers một, củ thiên đầu Hà Giang, Tuyên [38], [36] thống, củ Quang, Nam Định, 6. nghếch, củ mối Hà Nam, Ninh Bình, tròn Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Côn Đảo 4
Stt Tên loài Tên Việt Nam Phân bố TLTK S. hainanensis Bình vôi Vùng núi [13], [44] 7. H.S. Lo & Y. Tsoong S. hernandifolia Dây mối, xạ chen Lào Cai, Hà Tây, [11], [13], (Willd.) Walp. Ninh Bình, Đà Nẵng, [204], [205] 8. Quảng Nam, Ninh Thuận, Lâm Đồng, Đồng Nai S. japonica Thiên kim đằng, Hà Nội, Nam Định, [11], [21], 9. (Thunb.) Miers dây lõi tiền Nghệ An, Đồng Nai [38], [33], [204], S. japonica var. Dây mối, Lõi tiền Vùng đồng bằng và [21] 10. discolor (Blume) núi thấp Forman 11. S. kerrii Craib Bình vôi Việt Nam [204] S. kuinanennis Bình vôi Lạng Sơn [47] 12. H.S. Lo & M. Yang S. kwangsiensis Bình vôi Quảng Quảng Ninh, Hà [11], [13], 13. H.S.Lo Tây, bình vôi Nam, Ninh Bình, Hà [21], [38] Tây, Lạng Sơn S. longa Lour. Lõi tiền, dây lõi Vùng đất thấp từ Cao [11], [13], 14. tiền rễ dài Bằng, Lạng Sơn tới [33], [204], Thừa Thiên Huế 15. S. oblata Craib Bình vôi Việt Nam [204] S. pierrei Diels Bình vôi, dây Bình Định, Phú Yên [28], [41] 16. đồng tiền S. polygona N.H. Bình vôi Lâm Đồng, Thừa [65] 17. Xia & V.T. Chinh Thiên Huế S. rotunda Lour. Bình vôi Tây Nguyên, Bình [1], [171] 18. Thuận S. sinica Diels Bình vôi, bình Lạng Sơn, Quảng [11], [13], vôi Trung Quốc, Ninh, Hà Tây, Hòa [21], [38], 19. củ một Trung Bình, Hà Nam, Ninh [44], [204] quốc, dây lõi tiền Bình tới Bà Rịa- bắc Vũng Tàu S. tetrandra S. Phấn phòng kỷ Lào Cai, Yên Bái, Hà [11], [33] 20. Moore Bắc, Hà Giang, Hà Tây, Quảng Ninh. 5
Stt Tên loài Tên Việt Nam Phân bố TLTK S. venosa (Bl.) Bình vôi đỏ, lõi Các tỉnh phía Nam [21], [38] 21. Spreng. tiền đỏ S. viridiflavens Bình vôi Sơn La [15], [20] 22. H.S. Lo et M. Yang 1.2. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI STEPHANIA LOUR. VÀ HAI LOÀI NGHIÊN CỨU 1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Stephania Lour. Theo các tài liệu, chi Stephania Lour. có các đặc điểm chung sau: Dây leo sống lâu năm hoặc hàng năm, hầu hết mảnh khảnh. Thân non thường nhẵn, xanh nhạt, xanh bóng hoặc xanh thẫm. Thân già thường có rãnh dọc, mụn cóc sần sùi màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất [38], [52], [209], [210]. Thân gỗ hay thân cỏ [165], [166]. Gốc thân phình thành củ, có mang rễ dạng sợi. Củ rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc. Củ thường có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hay có hình dạng bất định. Khối lượng của củ thường từ 0,5-2 (3) kg nhưng cũng có loài có thể nặng tới 50-70 kg, cá biệt có nơi đã thu được củ nặng 170 kg. Màu sắc vỏ củ có nhiều thay đổi (nhẵn, xù xì, màu nâu sáng nhạt, xám tro hay đen,...) tùy thuộc vào từng loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống [170], [176]. Thịt củ nạc hoặc có lẫn những vằn xơ, màu trắng ngà, vàng tươi, vàng nhạt hoặc đỏ nâu, đỏ tươi tùy theo loài [2], [38]. Lá mọc cách. Cuống lá thường mảnh, dài 2(-5)-15(-20) cm, hai đầu phình lên [38], có khi gấp khúc ở gốc [48], [170]. Cuống lá đính vào phiến lá thường ở những vị trí cách xa mép dưới của gốc lá ở những khoảng cách nhất định tùy từng loài (có thể từ 1/15 đến 1/3 chiều dài phiến lá. Phiến lá mỏng hoặc dày, nhẵn bóng hoặc rải rác có lông, hình khiên, hình lọng, hình tam giác rộng, hình trứng - tam giác, tam giác tròn hoặc gần tròn, mép lá nguyên hoặc chia thùy, gân lá dạng chân vịt gồm 8 (-9)- 10 (-12) gân lá xuất phát từ đỉnh cuống lá. Chóp lá nhọn, thuôn nhọn, tù hoặc gần tròn. Gốc lá gần tròn, phẳng hoặc gần hình tim. Màu sắc của phiến lá tùy thuộc vào từng loài (màu xanh nhạt, xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt hoặc đốm tía- như ở loài S. dielsiana) [38], [78], [129]. Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực và cái thường mọc từ kẽ lá hay mọc trên thân cây già không lá (S. viridiflavens) [20], [129], thường có dạng tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù [38], có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm ít 6
nhất ở các nhánh của tán cấp 1(2), các nhánh cuối cùng đôi khi không đều, hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa [48]. Hoa đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn; đài 6-8, rời, xếp thành 2 vòng, bằng nhau hay không bằng nhau, hoặc chỉ 2-3 ở loài S. capitata [170], đài ít nhiều hình trái xoan ngược; cánh hoa rời nhau, 3 hay 4, hình trứng ngược, mép bên nhiều khi gập vào trong (hình vỏ sò) (S. brachyandra), màu vàng hay trắng xanh. Nhị 2-6, thường 4; chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, bao phấn dính nhau thành hình đĩa với 4-8 ô nứt ngang. Hoa cái đối xứng hay bất đối xứng, đài thường 1, cánh hoa 2 (ít khi đài 3-4, cánh hoa 3-4 (S. tetrandra)), hình dạng giống như ở hoa đực. Bầu hình trứng, lá noãn 2 (nhưng chỉ có 1 phát triển thành hạt, 1 lá noãn bị thoái hóa); vòi rất ngắn hoặc không có; núm nhụy từ 4-6 (7) chia thùy ngắn hoặc rách, choãi ra hình dùi [38], [48], [129], [170]. Quả hạch, hình gần tròn, hình trứng, hình trứng ngược, trứng bầu, 2 bên dẹt. Quả trưởng thành cuống quả lệch về một phía gần với dấu vết còn lại của núm nhụy. Quả chín màu vàng đậm hay đỏ tươi nhẵn bóng. Hạt (= vỏ quả trong) hình móng ngựa, trứng dẹt hoặc hơi tròn, lưng mang một dải hình móng ngựa gồm 2 hoặc 4 dãy dọc các bướu (gai) hay những gờ ngang (vân). Giá noãn có lỗ thủng hoặc không (S. subpeltata). Đặc điểm hình thái của hạt đặc trưng cho từng loài, là dấu hiệu quan trọng để giám định tên loài [38]. Cây mầm có lá mầm ít nhiều bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ [48]. 1.2.2. Đặc điểm thực vật của loài Stephania venosa (Bl.) Spreng Tên đồng nghĩa: Clypea venosa Bl. [21], [38], [170] Tên thường dùng: Bình vôi đỏ [38] Tên khác: Lõi tiền đỏ [38] Dây leo có củ, mủ đỏ. Củ to trồi lên mặt đất, đường kính có thể lên tới 40 cm. Thân màu rơm đo đỏ, không lông, nhẵn, lúc khô màu lục. Lá mọc cách, phiến lá hình trứng rộng tam giác, kích thước 6-11(-19) x 12 (-20) cm, gốc lá lõm hình tim, ngọn lá nhọn hay tù, mép lá nguyên hoặc hơi chia thùy [38]. Gân đỏ, cuống 6-8 cm. Phát hoa ở nách lá, mang vài tán dày. Hoa đực: đài 6, cánh hoa 3. Hoa cái có cuống; đài 1, màu cam; cánh hoa 2 [21]. Quả hạch hình gần trứng, dẹp nhỏ. Hạt hình trứng bầu, dẹt, dọc chiều lưng bụng có 4 hàng gai, mỗi hàng có 12-20 gai nhỏ [38]. 1.2.3. Đặc điểm thực vật của loài Stephania viridiflavens H. S. Lo et M. Yang Tên thường dùng: Bình vôi Thân leo, hơi hóa gỗ. Phiến lá tròn dạng tam giác, dài rộng từ 8-15 cm, hiếm khi đạt đến 20 cm. Chóp lá nhọn, ngắn hoặc hơi tù. Gốc lá gần bằng, tròn hoặc hơi 7