Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu mối liên quan giữa 3 alen HLA lớp I với nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng của allopurinol ở người Kinh Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:304

Thêm vào BST

Báo xấu

13
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu mối liên quan giữa 3 alen HLA lớp I với nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng của allopurinol ở người Kinh Việt Nam" được hoàn thành với mục tiêu nhằm xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02. 2. Xác định tần suất của 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 trong cộng đồng người Kinh Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu mối liên quan giữa 3 alen HLA lớp I với nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng của allopurinol ở người Kinh Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM TRẦN THU HÀ NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA 3 ALEN HLA LỚP I VỚI NGUY CƠ PHẢN ỨNG CÓ HẠI TRÊN DA NGHIÊM TRỌNG CỦA ALLOPURINOL Ở NGƯỜI KINH VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM TRẦN THU HÀ NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA 3 ALEN HLA LỚP I VỚI NGUY CƠ PHẢN ỨNG CÓ HẠI TRÊN DA NGHIÊM TRỌNG CỦA ALLOPURINOL Ở NGƯỜI KINH VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 62720408 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Phùng Thanh Hương 2. PGS. TS. Trần Quang Bình HÀ NỘI, NĂM 2022
LỜI CAM ĐOAN Tôi là Phạm Trần Thu Hà, nghiên cứu sinh niên khóa 2017 chuyên ngành Hóa sinh dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, xin cam đoan: 1. Luận án này do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Phùng Thanh Hương, Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội và PGS. TS. Trần Quang Bình, Khoa Dinh dưỡng và Bệnh không lây nhiễm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia. 2. Luận án này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. 3. Các số liệu và thông tin trong luận án chính xác, khách quan, đã được chấp thuận và xác nhận của các cơ sở nơi luận án triển khai thu thập số liệu. 4. Các kết quả công bố chung đã được cán bộ hướng dẫn và các đồng tác giả cho phép sử dụng trong luận án. Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2022 Nghiên cứu sinh Phạm Trần Thu Hà i
LỜI CẢM ƠN Trong hành trình hơn 4 năm làm nghiên cứu sinh, tôi đã được nhận được sự giúp đỡ tận tâm và chân thành của rất nhiều thầy cô, anh chị em, bạn bè, đồng nghiệp và các thành viên trong gia đình. Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Phùng Thanh Hương, Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội và PGS. TS. Trần Quang Bình, Khoa Dinh dưỡng và Bệnh không lây nhiễm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia - hai người thầy đã luôn tận tâm hướng dẫn và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tinh thần trách nhiệm, kiến thức và sự nhiệt tâm đối với học trò của thầy cô là tấm gương và động lực để tôi không ngừng cố gắng, nỗ lực vượt qua những giai đoạn khó khăn nhất để hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô, các kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh đã luôn đồng hành và hỗ trợ tôi từ khi còn là học viên cao học của Bộ môn tới ngày hôm nay. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, PGS. TS. Đỗ Hồng Quảng và các thầy cô Phòng Sau đại học đã luôn đồng hành và giúp đỡ trong quá trình tôi học tập tại trường. Tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ Y tế đã cấp kinh phí cho Đề tài cấp Bộ Y tế “Khảo sát tần suất một số alen HLA lớp I trong cộng đồng người Kinh Việt Nam và trong nhóm bệnh nhân sử dụng allopurinol” để tôi có cơ hội thực hiện luận án tiến sĩ. Tôi chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Hoàng Anh và các anh/chị/em trong Trung tâm Quốc gia về Thông tin thuốc và Theo dõi phản ứng có hại của thuốc đã nhiệt tình hỗ trợ trong quá trình xây dựng và triển khai đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Rosita Gabbianelli, TS. Donatella Fedeli, TS. Laura Bordoni đã hết lòng hỗ trợ và tạo những điều kiện thuận lợi nhất để tôi làm quen với công việc trong phòng thí nghiệm trong thời gian tôi học tập trao đổi tại Đại học Camerino, Ý. ii
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Hội sinh viên các Trường Đại học Dược Hà Nội, Trường Đại học Hà Tĩnh, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh đã hết lòng giúp đỡ trong giai đoạn thu mẫu cộng đồng. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể bác sĩ, điều dưỡng tại Trung tâm Dị ứng – Miễn dịch Lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai và tập thể bác sĩ bác sĩ, y tá, điều dưỡng tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Thái Bình cùng tập thể cán bộ tại Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Thái Bình đã tạo điều kiện thuận lợi, nhiệt tình tham gia quá trình thu mẫu bệnh nhân. Tôi xin chân thành cảm ơn những người tình nguyện trong cộng đồng và những bệnh nhân đã chấp thuận tham gia nghiên cứu và sẵn lòng chia sẻ thông tin để tôi có thể có được những dữ liệu nghiên cứu giá trị. Tôi xin trân trọng cảm ơn những ý kiến đóng góp chân thành và đầy tính xây dựng của TS. Lê Nhật Minh, TS. Nguyễn Hải Hà, TS. Nguyễn Thị Đông, BS. Trần Ngọc Phương Mai và tập thể cán bộ tại Khoa dinh dưỡng và Bệnh không lây nhiễm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia; tập thể cán bộ tại Phòng sinh học phân tử ứng dụng, Trung tâm Nghiên cứu Y sinh học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Những ý kiến đóng góp quý báu đó đã giúp tôi triển khai và hoàn thiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn DS CKII. Nguyễn Thế Tin, TS. Mai Lệ Hoa và toàn thể các cô chú, anh chị em đồng nghiệp tại Trung tâm đào tạo liên tục – Trường Đại học Đại Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới tất cả những thành viên đã đồng hành từ những ngày đầu triển khai đề tài và rất nhiều người thầm lặng đồng hành giúp đỡ mà tôi không thể kể hết tên. Sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân, bạn bè đã luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. iii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ...................................................... ix DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... xiii DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... xv ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Phản ứng có hại trên da nghiêm trọng của thuốc ........................................... 3 1.1.1. Khái niệm chung ............................................................................................... 3 1.1.2. Các týp SCARs đáng chú ý ............................................................................... 3 1.1.2.1. Hội chứng Stevens–Johnson và hoại tử biểu bì nhiễm độc............................ 3 1.1.2.2. Hội chứng quá mẫn do thuốc ......................................................................... 4 1.1.2.3. Ban mụn mủ toàn thân cấp tính ..................................................................... 4 1.1.3. Dịch tễ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng do allopurinol .......................... 5 1.1.4. Cơ chế phân tử của SCARs do allopurinol ....................................................... 8 1.2. Tổng quan về các alen HLA lớp I ................................................................... 10 1.2.1. Giới thiệu chung về siêu họ gen HLA ............................................................. 10 1.2.2. Danh pháp alen HLA ....................................................................................... 11 1.2.3. Đặc điểm của siêu họ gen HLA ....................................................................... 13 1.2.4. Vị trí, cấu trúc gen HLA lớp I ......................................................................... 15 1.2.4.1. Vị trí gen HLA lớp I...................................................................................... 15 1.2.4.2. Cấu trúc – chức năng gen HLA lớp I ........................................................... 15 1.3. Các nghiên cứu về alen HLA lớp I có liên quan với nguy cơ SCARs do allopurinol ................................................................................................................ 18 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ........................................................................... 18 1.3.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam .......................................................................... 21 1.4. Các phương pháp phát hiện alen HLA lớp I liên quan tới SCARs do allopurinol ................................................................................................................ 24 iv
1.4.1. Các phương pháp phát hiện alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs do allopurinol trên thế giới ............................................................................................. 24 1.4.2. Các phương pháp phát hiện alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs do allopurinol tại Việt Nam............................................................................................ 28 1.4.3. Phương pháp phát hiện alen HLA lớp I của luận án........................................ 29 1.4.3.1. Phương pháp phát hiện alen HLA-A*33:03 và HLA-C*03:02.................... 29 1.4.3.2. Phương pháp phát hiện alen HLA-B*58:01 ................................................ 32 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 33 2.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................... 33 2.1.1. Đối tượng trong nghiên cứu xây dựng, tối ưu hóa và thẩm định quy trình phát hiện 3 alen HLA lớp I ................................................................................................ 33 2.1.2. Đối tượng trong nghiên cứu trên cộng đồng người Kinh Việt Nam ............... 34 2.1.3. Đối tượng trong nghiên cứu trên bệnh nhân sử dụng allopurinol ................... 35 2.1.3.1. Nhóm bệnh nhân dung nạp với allopurinol ................................................. 35 2.1.3.2. Nhóm bệnh nhân bị SCARs do allopurinol .................................................. 36 2.2. Nguyên liệu, trang thiết bị dùng trong nghiên cứu ....................................... 37 2.2.1. Nguyên liệu, hóa chất, vật tư tiêu hao dùng trong nghiên cứu ....................... 37 2.2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu ....................................................................... 37 2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 38 2.3.1.Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ................................................................................. 38 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu giải quyết mục tiêu 1 “Xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02” .................. 39 2.3.2.1. Phương pháp tách chiết ADN ...................................................................... 39 2.3.2.2. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ................. 39 2.3.2.3. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 ................. 42 2.3.2.4. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 ................. 43 2.3.2.5. Phương pháp thẩm định các quy trình đã xây dựng .................................... 45 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu giải quyết mục tiêu 2 “Xác định tần suất của 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 trong cộng đồng người Kinh Việt Nam”……………. .................................................................................................... 46 v
2.3.3.1. Phương pháp nghiên cứu chung .................................................................. 46 2.3.3.2. Phương pháp thu mẫu .................................................................................. 46 2.3.3.3. Phương pháp phát hiện 3 alen HLA lớp I và tính tần suất alen .................. 47 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu giải quyết mục tiêu 3 “Đánh giá mối liên quan của 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 với nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng khi dùng allopurinol ở bệnh nhân người Kinh Việt Nam”…………….. ................................................................................................... 48 2.3.4.1. Phương pháp nghiên cứu chung .................................................................. 48 2.3.4.2. Phương pháp thu mẫu .................................................................................. 50 2.3.4.3. Phương pháp phát hiện 3 alen HLA lớp I .................................................... 52 2.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 52 2.5. Đạo đức nghiên cứu.......................................................................................... 53 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 54 3.1. Kết quả của mục tiêu 1 “Xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01, HLA-C*03:02” ...................................................... 54 3.1.1. Kết quả xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ....... 54 3.1.1.1. Kết quả thiết kế mồi và xây dựng các bước PCR của quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03….. ...................................................................................................... 54 3.1.1.2. Kết quả khảo sát điều kiện hoạt động của cặp mồi HLAAB1F/HLAAB1R sử dụng cho phản ứng PCR bước 1 ............................................................................... 57 3.1.1.3. Kết quả khảo sát điều kiện hoạt động của 3 cặp mồi sử dụng cho các phản ứng PCR bước 2 ...................................................................................................... 59 3.1.1.4. Kết quả thử nghiệm quy trình nested AS – PCR phát hiện alen HLA-A*33:03 với các mẫu chứng .................................................................................................... 63 3.1.1.5. Kết quả thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 bằng phương pháp giải trình tự Sanger ................................................................................................... 64 3.1.2. Kết quả xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 ....... 65 3.1.2.1. Kết quả lựa chọn mồi ................................................................................... 65 3.1.2.2. Kết quả khảo sát điều kiện hoạt động của các cặp mồi ............................... 67 vi
3.1.2.3. Kết quả thử nghiệm quy trình SSP – PCR phát hiện alen HLA-B*58:01 với các mẫu chứng… ...................................................................................................... 71 3.1.2.4. Kết quả thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 bằng phương pháp giải trình tự Sanger ................................................................................................... 72 3.1.3. Kết quả xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 ....... 72 3.1.3.1. Kết quả thiết kế mồi và xây dựng các bước PCR của quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02….. ...................................................................................................... 72 3.1.3.2. Kết quả khảo sát điều kiện hoạt động của cặp mồi HLACB1F/HLACB1R sử dụng cho phản ứng PCR bước 1 ............................................................................... 76 3.1.3.3. Kết quả khảo sát điều kiện hoạt động của 3 cặp mồi sử dụng cho các phản ứng PCR bước 2 ...................................................................................................... 78 3.1.3.4. Kết quả thử nghiệm quy trình nested AS – PCR phát hiện alen HLA-C*03:02 với các mẫu chứng .................................................................................................... 83 3.1.3.5. Kết quả thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 bằng phương pháp giải trình tự Sanger ................................................................................................... 84 3.2. Kết quả của mục tiêu 2 “Xác định tần suất của 3 alen HLA-A*33:03, HLA- B*58:01, HLA-C*03:02 trong cộng đồng người Kinh Việt Nam” ...................... 85 3.2.1. Kết quả tóm tắt đặc điểm nhóm cộng đồng người Kinh Việt Nam ................ 85 3.2.2. Kết quả về tần suất cá thể mang alen, tần suất alen và đặc điểm phân bố của các alen giữa 2 giới và 3 miền................................................................................... 86 3.2.3. Kết quả về tần suất cá thể mang alen và tần suất tổ hợp các alen................... 89 3.3. Kết quả của mục tiêu 3 “Đánh giá mối liên quan của 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01, HLA-C*03:02 với nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng khi dùng allopurinol ở bệnh nhân người Kinh Việt Nam” ................................. 90 3.3.1. Kết quả tóm tắt đặc điểm của nhóm SCARs do allopurinol và nhóm dung nạp với allopurinol ........................................................................................................... 90 3.3.2. Kết quả so sánh tần suất cá thể mang alen và tần suất alen giữa các nhóm nghiên cứu…............. . .......................................................................................................... 95 3.3.3. Kết quả đánh giá mối liên quan giữa các alen với nguy cơ SCARs do allopurinol…. .. ......................................................................................................... 99 vii
3.3.4. Kết quả đánh giá mối liên quan giữa các yếu tố không di truyền và di truyền liên quan tới nguy cơ SCARs do allopurinol .......................................................... 102 Chương 4. BÀN LUẬN ......................................................................................... 109 4.1. Về kết quả mục tiêu 1 “Xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02” ................................................ 109 4.1.1. Về quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ................................................... 109 4.1.2. Về quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 ................................................... 114 4.1.3. Về quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 ................................................... 117 4.2. Về kết quả mục tiêu 2 “Xác định tần suất của 3 alen HLA-A*33:03, HLA- B*58:01 và HLA-C*03:02 trong cộng đồng người Kinh Việt Nam” ................ 121 4.3. Về kết quả mục tiêu 3 “Đánh giá mối liên quan của 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 với nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng khi dùng allopurinol ở bệnh nhân người Kinh Việt Nam” ..................... 126 4.3.1. Về tần suất 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 ở 2 nhóm dung nạp với allopurinol và nhóm SCARs do allopurinol ...................................... 126 4.3.2. Về mối liên quan giữa từng alen/tổ hợp các alen HLA lớp I với nguy cơ SCARs do allopurinol 129 4.3.3. Về mối liên giữa yếu tố di truyền và các yếu tố không di truyền khác với nguy cơ SCARs do allpurinol .......................................................................................... 132 4.3.4. Về mức độ ảnh hưởng của yếu tố di truyền và chức năng thận với nguy cơ SCARs do allopurinol ............................................................................................. 137 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 142 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ........................................... 145 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC viii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ tiếng Anh Nghĩa đầy đủ tiếng Việt ADRs Adverse drug reactions Phản ứng có hại của thuốc AFND Allele frequency net database Cơ sở dữ liệu tần suất alen AGEP Acute generalized Ban mụn mủ toàn thân cấp exanthematous pustulosis tính AH Allopurinol hypersensitivity Quá mẫn với allopurinol ALDEN Algorithm of drug causality for Bảng điểm xác định thuốc epidermal necrolysis gây dị ứng trong hoại tử thượng bì APC Antigen presenting cell Tế bào trình diện kháng nguyên AS – PCR Allele specific Polymerase chain PCR với mồi đặc hiệu alen reaction AUC Area under the ROC Curve Diện tích dưới đường cong ROC cADRs Cutaneous adverse drug Phản ứng có hại của thuốc reactions trên da CFB Complement factor B Bổ thể B CI Confidence Interval Khoảng tin cậy CP Cytoplasmic part Vùng mã hóa phần đuôi nằm trong bào tương CPIC Clinical pharmacogenetics Tổ chức thực hành gen dược implementation consortium trên lâm sàng DIHS Drug induced hypersensitivity Hội chứng quá mẫn do thuốc syndrome ix
DRESS Drug reaction with eosinophilia Phản ứng thuốc có tăng bạch and systemic symptoms cầu ái toan và triệu chứng toàn thân ĐTNC Đối tượng nghiên cứu E Exon Exon eGFR Estimated glomerular filtration Mức lọc cầu thận ước tính rate HLA Human Leukocyte Antigen Kháng nguyên bạch cầu người HR Hazard ratio Tỷ số rủi ro HSS Hypersensitivity syndrome Hội chứng quá mẫn HW Hardy Weinberg Cân bằng Hardy Weinberg I Intron Intron LAMP Loop Mediated Isothermal Phương pháp khuếch đại Amplification đẳng nhiệt xoay vòng LD Linkage disequilibrium Mất cân bằng liên kết MDRD Modification of Diet in Renal Thay đổi chế độ ăn uống Disease trong bệnh thận MHC Major Histocompatibility Phức hợp hòa hợp tổ chức Complex chính NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới NHANES National Health and Nutrition Khảo sát Sức khỏe và Dinh Examination Survey dưỡng Quốc gia NIS Nationwide Inpatient Sample Cơ sở dữ liệu bệnh nhân nội trú toàn quốc NPV Negative predictive value Giá trị tiên đoán âm tính PBMCs Peripheral blood mononuclear Tế bào đơn nhân máu ngoại cells vi x
P-I Pharmacological interaction of Tương tác dược lý của thuốc drugs with immune receptor với thụ thể miễn dịch PPV Positive predictive value Giá trị tiên đoán dương tính RCT Randomized controlled clinical Thử nghiệm lâm sàng đối trial chứng ngẫu nhiên RegiSCAR European Registry of Severe Cơ quan đăng ký châu Âu Cutaneous Adverse Reactions về các phản ứng có hại trên da nghiêm trọng của thuốc RFLP – PCR Polymerase chain reaction – Phản ứng khuếch đại chuỗi – Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài đoạn cắt Polymorphism giới hạn ROC Receiver operating characteristic Đường cong ROC ROR Reporting odds ratio Tỷ suất chênh ghi nhận SBT Sequencing base typing Giải trình tự gen SCARs Severe cutaneous adverse Phản ứng có hại trên da reactions nghiêm trọng của thuốc SJS Stevens–Johnson syndrome SNP Single-nucleotide polymorphism Đa hình đơn nucleotid SP Signal peptide Vùng mã hóa peptit tín hiệu SSOP – PCR Sequence-specific Phản ứng khuếch đại chuỗi Oligonucleotide Probes – với đầu dò oligonucleotid có Polymerase chain reaction trình tự đặc hiệu SSP – PCR Sequence-specific Primer – Phản ứng khuếch đại chuỗi Polymerase chain reaction với mồi có trình tự đặc hiệu TCR T-cell receptors Thụ thể của tế bào T TEN Toxic epidermal necrolysis Hoại tử biểu bì nhiễm độc TLS Tumor lysis syndrome Hội chứng tiêu khối u TLTK Tài liệu tham khảo xi
TM Transmem-brane part Vùng mã hóa phần xuyên màng TNF Tumor necrosis factor Các yếu tố hoại tử u ULD Uratelowering drug Thuốc làm giảm acid uric ULDAEs Uratelowering drug adverse Phản ứng có hại của các events thuốc làm giảm acid uric UT Untranslated region Vùng không mã hóa VIF Variance inflation factor Hệ số phóng đại phương sai WES Whole exome sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ exon WGS Whole genome sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gen WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới xii
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các nghiên cứu về alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs do allopurinol trên thế giới ....................................................................................18 Bảng 1.2. Các nghiên cứu về tần suất 3 alen HLA lớp I ở các nước trên thế giới ...............21 Bảng 1.3. Các nghiên cứu về tần suất 3 alen HLA lớp I trong cộng đồng người Kinh Việt Nam .........................................................................................................22 Bảng 1.4. Các nghiên cứu về alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs do allopurinol tại Việt Nam ...................................................................................23 Bảng 1.5. So sánh các phương pháp sử dụng để phát hiện alen HLA-B*58:01........26 Bảng 1.6. Nguyên tắc thêm mismatch trên mồi đặc hiệu alen ..................................30 Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi của quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03............57 Bảng 3.2. Thông số hoạt động của quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 .............62 Bảng 3.3. So sánh kiểu gen HLA-A của 7 mẫu chứng ADN và kết quả kiểu gen HLA- A xác định bằng quy trình mới xây dựng .........................................................64 Bảng 3.4. Kết quả thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 đã xây dựng bằng phương pháp giải trình tự Sanger ........................................................................65 Bảng 3.5. Trình tự các cặp mồi của quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01............67 Bảng 3.6. Thông số hoạt động của quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 .............70 Bảng 3.7. So sánh kiểu gen HLA-B của 6 mẫu chứng ADN và kết quả xác định bằng quy trình mới xây dựng ....................................................................................71 Bảng 3.8. Kết quả thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 đã xây dựng bằng phương pháp giải trình tự Sanger .......................................................................72 Bảng 3.9. Trình tự các cặp mồi của quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 ...........76 Bảng 3.10. Thông số hoạt động của quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 ...........82 Bảng 3.11. So sánh kiểu gen HLA-C của 10 mẫu chứng ADN và kết quả kiểu gen HLA-C xác định bằng quy trình mới xây dựng ................................................84 Bảng 3.12. Kết quả thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 đã xây dựng bằng phương pháp giải trình tự Sanger ............................................................85 Bảng 3.13. Đặc điểm nhóm cộng đồng người Kinh Việt Nam .................................85 xiii
Bảng 3.14. Tần suất cá thể mang alen và tần suất 3 alen HLA lớp I trong nhóm cộng đồng người Kinh Việt Nam ..............................................................................86 Bảng 3.15. So sánh tần suất cá thể mang alen giữa nam và nữ trong nhóm cộng đồng người Kinh Việt Nam ...................................................................................................87 Bảng 3.16. So sánh tần suất cá thể mang alen và tần suất alen của từng miền.........88 Bảng 3.17. Tần suất cá thể mang alen/tổ hợp các alen của từng phân nhóm ...........89 Bảng 3.18. Đặc điểm của nhóm bệnh nhân SCARs do allopurinol và nhóm bệnh nhân dung nạp với allopurinol ..................................................................................91 Bảng 3.19. So sánh tần suất cá thể mang alen và tần suất alen trong nhóm SCARs do allopurinol và nhóm dung nạp với allopurinol ......................................................96 Bảng 3.20. So sánh tần suất cá thể mang alen và tần suất alen trong nhóm dung nạp với allopurinol và nhóm cộng đồng người Kinh Việt Nam .............................98 Bảng 3.21. Mối liên quan giữa từng alen/tổ hợp các alen HLA lớp I tới nguy cơ SCARs do allopurinol ....................................................................................100 Bảng 3.22. Mối liên quan giữa alen HLA-B*58:01 và HLA*C*03:02 và các týp SCARs do allopurinol ....................................................................................101 Bảng 3.23. Phân tích hồi quy đa biến các yếu tố liên quan với nguy cơ SCARs do allopurinol.......................................................................................................103 Bảng 3.24. Phân tích ảnh hưởng của kiểu gen HLA-C*03:02 và chức năng thận với nguy cơ SCARs do allopurinol.......................................................................104 Bảng 3.25. Phân tích ảnh hưởng của alen HLA-B*58:01 và chức năng thận với nguy cơ SCARs do allopurinol................................................................................106 Bảng 3.26. So sánh các giá trị của xét nghiệm sàng lọc alen nguy cơ....................107 Bảng 4.1. So sánh tần suất cá thể mang alen HLA-B*58:01 giữa cộng đồng người Kinh Việt Nam và một số cộng đồng khác trên thế giới ................................122 xiv
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Mô hình tương tác dược lý "P-I" được đề xuất để giải thích cơ chế phân tử của SCARs do allopurinol. ...............................................................................10 Hình 1.2. Sơ đồ vùng gen HLA trên nhiễm sắc thể số 6 ...........................................11 Hình 1.3. Danh pháp alen HLA .................................................................................12 Hình 1.4. Các HLA haplotype di truyền trong một gia đình theo định luật Menden ...........14 Hình 1.5. Cấu trúc chung của gen HLA lớp I ............................................................16 Hình 1.6. Cấu trúc phân tử MHC lớp I .....................................................................17 Hình 1.7. Nguyên tắc thiết kế mồi đặc hiệu alen ......................................................31 Hình 1.8. Nguyên tắc của quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 bằng phương pháp SSP – PCR ..................................................................................................................32 Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ..........................................................................38 Hình 3.1. Vị trí gắn của cặp mồi HLAAB1F/HLAAB1R sử dụng ở phản ứng PCR bước 1 của quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03..........................................55 Hình 3.2. Vị trí gắn của các mồi đặc hiệu alen sử dụng cho các phản ứng PCR bước 2 của quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ...................................................55 Hình 3.3. Sơ đồ quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 và cách đọc kết quả kiểu gen HLA-A*33:03 ...................................................................................................56 Hình 3.4. Điện di đồ khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi HLAAB1F/ HLAAB1R - quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ............................................................57 Hình 3.5. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ phản ứng của cặp mồi HLAAB1F/ HLAAB1R - quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ......................................58 Hình 3.6. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi HLAA3AF/HLAA3303R - lần 3 ......................................................................60 Hình 3.7. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi HLAA3AF/HLAA2AR - lần 3 .........................................................................60 Hình 3.8. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi HLAA18AF/HLAA18AR - lần 3 .....................................................................61 xv
Hình 3.9. Điện di đồ của 7 mẫu chứng thử nghiệm với quy trình phát hiện alen HLA- A*33:03 đã xây dựng........................................................................................63 Hình 3.10. Vị trí gắn của cặp mồi HLAB5801F/HLAB5801R trên khuôn ADN ....66 Hình 3.11. So sánh các cặp mồi phát hiện alen HLA-B*58:01 đã công bố ..............66 Hình 3.12. Sơ đồ quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 và cách đọc kết quả ........67 Hình 3.13. Điện di đồ khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các mồi – quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 ...................................................................................................68 Hình 3.14. Điện di đồ kết quả khảo sát nồng độ cặp mồi HLAB5801F/ HLAB5801R – quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 .........................................................69 Hình 3.15. Điện di đồ kết quả khảo sát nồng độ MgCl2 – quy trình phát hiện alen HLA- B*58:01 .............................................................................................................69 Hình 3.16. Điện di đồ của 6 mẫu chứng thử nghiệm với quy trình phát hiện alen HLA- B*58:01 đã xây dựng........................................................................................71 Hình 3.17. Vị trí gắn của cặp mồi HLACB1F/HLACB1R sử dụng ở phản ứng PCR bước 1 ...............................................................................................................73 Hình 3.18. Vị trí gắn của các mồi sử dụng cho các phản ứng PCR bước 2 ..............74 Hình 3.19. Sơ đồ quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 và cách đọc kết quả kiểu gen HLA-C*03:02 ...................................................................................................75 Hình 3.20. Điện di đồ khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi HLACB1F/ HLACB1R - quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 ..........................................................77 Hình 3.21. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ của phản ứng PCR bước 1 ......................78 Hình 3.22. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi HLAC0302F/HLAC3CR - lần 3 ......................................................................79 Hình 3.23. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi HLAC2CF/HLAC3CR - lần 3 ..........................................................................80 Hình 3.24. Điện di đồ gradient nhiệt của cặp mồi HLAC15CF/HLAC15CR ..........81 Hình 3.25. Điện di đồ của 10 mẫu chứng thử nghiệm với quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 đã xây dựng ..............................................................................83 xvi
0 ĐẶT VẤN ĐỀ Allopurinol là thuốc điều trị tăng acid uric máu được sử dụng rộng rãi trên thế giới và Việt Nam do thuốc thường được dung nạp tốt, cho hiệu quả điều trị cao và chi phí hợp lý [143]. Tuy nhiên, những phản ứng có hại trên da nghiêm trọng (Severe cutaneous adverse reactions – SCARs) khi dùng allopurinol dù hiếm gặp nhưng thường rất nghiêm trọng, có tỷ lệ tử vong cao từ 10% đến 50% tổng số bệnh nhân bị phản ứng, những bệnh nhân may mắn sống sót cũng phải chịu nhiều di chứng suốt đời [16], [40]. Châu Á – là khu vực được cho là có tỷ lệ cao SCARs do allopurinol. Điều này được giải thích bởi khu vực châu Á có tần suất cao các alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs do allopurinol, bao gồm alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01, HLA- C*03:02 [44], [104]. Trong đó, alen HLA-B*58:01 được nghiên cứu nhiều nhất và một số nước châu Á như Thái Lan, Đài Loan, Singapo đã tiến hành áp dụng sàng lọc alen này trên lâm sàng để dự đoán và ngăn ngừa nguy cơ SCARs do allopurinol trước khi kê đơn cho bệnh nhân [126]. Tại Việt Nam, theo kết quả báo cáo của cơ sở dữ liệu ADRs tự nguyện giai đoạn 2010 − 2015, allopurinol là thuốc đứng thứ 3 trong các thuốc được báo cáo nhiều nhất có liên quan tới týp SCARs nghiêm trọng nhất – hội chứng Stevens Johnson (SJS)/ hoại tử biểu bì nhiễm độc (TEN) [101]. Tuy nhiên, sự liên quan giữa yếu tố di truyền với nguy cơ SCARs do allopurinol mới chỉ được quan tâm trong vòng vài năm trở lại đây với một số nghiên cứu thực hiện trên cỡ mẫu nhỏ, chưa có nhóm chứng cộng đồng. Mặt khác, các nghiên cứu ở Việt Nam mới tập trung vào alen HLA-B*58:01 mà chưa có nghiên cứu về 2 alen HLA-A*33:03, HLA-C*03:02, trong khi 2 alen này có tần suất cao hơn HLA-B*58:01 trong cộng đồng người Kinh Việt Nam [36]. Hơn nữa, phần lớn các nghiên cứu sử dụng bộ kit sẵn có với chi phí cao hoặc thực hiện xét nghiệm gen ở phòng thí nghiệm nước ngoài. Do đó, các kết quả nghiên cứu chưa thực sự góp phần thúc đẩy triển khai sàng lọc các alen HLA lớp I trên thực hành lâm sàng ở Việt Nam như một biện pháp phòng tránh SCARs do allopurinol. 1
Vì những lý do trên, Việt Nam cần có những nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để đánh giá mối liên quan của cả 3 alen HLA lớp I với nguy cơ SCARs do allopurinol cũng như nghiên cứu về các quy trình xét nghiệm gen giúp phát hiện các alen này với độ chính xác cao, tiến hành đơn giản với chi phí thấp để có thể áp dụng trên lâm sàng. Chính vì vậy, luận án “Nghiên cứu mối liên quan giữa 3 alen HLA lớp I với nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng của allopurinol ở người Kinh Việt Nam” được thực hiện. Kết quả của luận án có ý nghĩa khoa học trong việc cung cấp cơ sở dữ liệu về tần suất các cá thể mang alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 trong cộng đồng người Kinh Việt Nam, đồng thời, làm sáng tỏ mối liên quan giữa các alen HLA nói trên với nguy cơ SCARs do allopurinol ở người Việt Nam. Kết quả của luận án là cơ sở dữ liệu và tài liệu tham khảo quan trọng hướng tới thay đổi trong thực hành lâm sàng nhằm đảm bảo hiệu quả điều trị, đồng thời giảm thiểu phản ứng có hại trên da nghiêm trọng do allopurinol. Các mục tiêu cụ thể của luận án như sau: 1. Xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02. 2. Xác định tần suất của 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 trong cộng đồng người Kinh Việt Nam. 3. Đánh giá mối liên quan của 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 với nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng khi dùng allopurinol ở bệnh nhân người Kinh Việt Nam. 2