Luận án Tiến sĩ Dược học: Phân tích một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:301

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là xây dựng được phương pháp phân tích đồng thời một số acid amin cùng thành phần khác trong chế phẩm bằng HILIC-DAD và xác định được một số yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ và hình dáng pic trong HILIC; Xây dựng được phương pháp phân tích một số acid amin thơm trong huyết tương bằng HILIC-MS/MS nhằm hỗ trợ theo dõi và điều trị bệnh rối loạn chuyển hoá các acid amin này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Phân tích một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ NGÂN BÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ NGÂN BÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 9720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà HÀ NỘI, NĂM 2022
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Vũ Ngân Bình i
LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập và nghiên cứu thực hiện luận án, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà, giảng viên Bộ môn Hoá phân tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ, truyền dạy cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và luôn động viên, chia sẻ để tôi hoàn thành luận án. Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học và các phòng ban trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia học tập và hoàn thành luận án đúng thời hạn. Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện cho tôi sử dụng thiết bị để có thể hoàn thành luận án đúng thời hạn. Các thầy, cô, anh, chị, em trong Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình làm việc, học tập và nghiên cứu khoa học. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên và chia sẻ với tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. Tác giả luận án Vũ Ngân Bình ii
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ xi ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC 3 1.1.1. Đặc điểm các pha 3 1.1.2. Cơ chế tách và các yếu tố ảnh hưởng 9 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁU TRÚC, SINH TỔNG HỢP, THOÁI HOÁ VÀ VAI TRÒ CỦA ACID AMIN TRONG CƠ THỂ 16 1.2.1. Cấu trúc của các acid amin 16 1.2.2. Sinh tổng hợp và thoái hoá acid amin 18 1.2.3. Vai trò của các acid amin trong cơ thể 20 1.3. BỆNH DO RỐI LOẠN CHUYỂN HOÁ ACID AMIN THƠM 21 1.3.1. Phenylketon niệu (PKU) 21 1.3.2. Tăng phenylalanin huyết không do PKU (HPA) 22 1.3.3. Tyrosin huyết (TYR) 23 1.4. TỔNG QUAN VỀ PHÂN TÍCH ACID AMIN 25 1.4.1. Tổng quan về phân tích acid amin trong chế phẩm 25 1.4.2. Tổng quan về phân tích acid amin trong dịch sinh học 29 Chương 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 36 2.1. NGUYÊN LIỆU 37 2.3. TRANG THIẾT BỊ 38 2.4. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.4.1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới thời gian lưu của một số acid amin trong HILIC 39 2.4.2. Xây dựng phương pháp phân tích chế phẩm chứa acid amin bằng HILIC 40 2.4.3. Xây dựng phương pháp phân tích phenylalanin, tryptophan và tyrosin trong huyết tương bằng HILIC-MS 44 iii
2.4.4. Thẩm định phương pháp phân tích trong chế phẩm 46 2.4.5. Thẩm định phương pháp phân tích trong huyết tương 47 2.4.6. Một số tính toán thống kê 48 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 3.1. SƠ BỘ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐẾN SỰ LƯU GIỮ CỦA ACID AMIN 50 3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM CHỨA ACID AMIN BẰNG HILIC 58 3.2.1. Phân tích đồng thời các acid amin thơm trong chế phẩm tiêm truyền 58 3.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng acid amin và hoạt chất khác trong chế phẩm 66 3.3. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ACID AMIN THƠM TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HILIC KẾT NỐI KHỐI PHỔ 99 3.3.1. Xây dựng phương pháp 99 3.3.2. Thẩm định phương pháp 108 Chương 4. BÀN LUẬN 118 4.1. BÀN LUẬN VỀ PHÂN TÍCH ACID AMIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG HILIC-DAD 118 4.1.1. Chế phẩm chứa đa acid amin 118 4.1.2. Chế phẩm chứa acid amin và thành phần khác 119 4.1.3. Bàn luận về ưu nhược điểm của phương pháp HILIC-DAD 123 4.2. BÀN LUẬN VỀ PHÂN TÍCH ACID AMIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HILIC-MS/MS 124 4.2.1. Bàn luận về lựa chọn nền 124 4.2.2. Bàn luận về ưu nhược điểm của phương pháp HILIC-MS/MS 125 4.3. BÀN LUẬN VỀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ LƯU GIỮ, HÌNH DÁNG PIC CỦA ACID AMIN TRONG HILIC 126 4.3.1. Ảnh hưởng của pha tĩnh 126 4.3.2. Ảnh hưởng của pha động 129 4.3.3. Ảnh hưởng của dung môi pha mẫu 135 4.4. MỘT SỐ ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 136 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 137 iv
KẾT LUẬN 137 ĐỀ XUẤT 137 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PL PHỤ LỤC 1 PL1 PHỤ LỤC 2 PL3 PHỤ LỤC 3 PL38 PHỤ LỤC 4 PL61 PHỤ LỤC 5 PL73 PHỤ LỤC 6 PL124 v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt chữ viết tắt AA Amino acid Acid amin ACN Acetonitrile Acetonitril AG Ammonium glycyrrhizinate Amoni glycyrrhizinat Ala Alanine Alanin Atmospheric Pressure Chemical APCI Ion hóa tại áp suất khí quyển Ionization 6-aminoquinolyl-N- 6-aminoquinolyl-N- AQC hydroxysuccinimidyl carbamate hydroxysuccinimidyl carbamat Arg Arginine Arginin Asn Asparagine Asparagin Asp Aspatic acid Acid aspatic BEH Ethylene Bridged Hybrids Cầu liên kết etylen BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết thanh bò Heptaflorobutanol N,O- Heptaflorobutanol N,O- BSTFA Bis(trimethylsilyl) Bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide trifluoroacetamid CE Capillary electrophoresis Điện di mao quản CPT Chất phân tích Cys Cysteine Cystein DAD Diod Array Detector Detector mảng diod DEA Diethylamine Diethylamin DMF Dimethyl formamide Dimethyl formamid ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử FMOC 9-fluorenylmethyl chloroformate 9-fluorenylmethyl cloroformat GC Gas Chromatography Sắc ký khí Gln Glutamine Glutamin Glu Glutamic acid Acid glutamic Gly Glycine Glycin vi
HFBA Heptafluorobutyric acid Acid heptaflorobutyric Non PKU Tăng phenylalanin huyết không HPA hyperphenylalaninemia do PKU Hydrophilic Interaction Liquid HILIC Sắc ký lỏng tương tác thân nước Chromatography His Histidine Histidin High Performance Liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HQC High quality control Dung dịch kiểm tra nồng độ cao HSA Human Serum Albumin Albumin huyết thanh người HT Huyết tương IEC Ion Exchange Chromatography Sắc ký trao đổi ion Ile Isoleucine Isoleucin Leu Leucine Leucin LLOQ Lower Limit of Quantitation Giới giạn định lượng dưới LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện Dung dịch kiểm tra nồng độ LQC Low quality control thấp Lys Lysine Lysin MeOH Methanol Methanol Met Methionine Methionin Dung dịch kiểm tra nồng độ MQC Medium quality control giữa MS Mass Spectrometry Khối phổ MSA Methane sulfonic acid Acid metan sulfonic 4-fluoro-7-nitro-2,1,3- 4-floro-7-nitro-2,1,3- NBD-F benzoxadiazole benzoxadiazol Normal Phase Liquid NPLC Sắc ký lỏng pha thuận Chromatography OPA o-phthalaldehyde o-phthalaldehyd PĐ Pha động PITC Phenylisothiocyanate phenylisothiocyanat Phe Phenylalanine Phenylalanin vii
PKU Phenylketonuria Phenylketon niệu Pro Proline Prolin PT Pha tĩnh RLCH Rối loạn chuyển hoá Reversed Phase Liquid RPLC Sắc ký lỏng pha đảo Chromatography Ser Serine Serin SSA 5-sulfosalicylic acid Acid 5-sulfosalicylic TCA Trichloroacetic acid Acid tricloroacetic TFA Trifluoroacetic acid Acid trifloroacetic TLTK Tài liệu tham khảo Thr Threonine Threonin TMCS Trimethylclorosilane trimethylclorosilan Trp Tryptophan Tryptophan Tyr Tyrosine Tyrosin TYR Tyrosinemia Tyrosin huyết UV-VIS Ultraviolet – visible Tử ngoại – khả kiến Val Valine Valin ZIC Zwitterionic Lưỡng cực viii
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Số bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Cấu trúc của một số pha tĩnh dùng trong HILIC 4 Bảng 1.2. Đặc điểm cấu tạo của 20 acid amin thường gặp 17 Bảng 1.3. Giá trị chẩn đoán và mục tiêu điều trị một số bệnh RLCH AA 24 Bảng 1.4. Công thức cấu tạo và một số tính chất của hoạt chất nghiên 26 cứu Bảng 1.5. Một số phương pháp phân tích acid amin trong dịch sinh học 35 Bảng 2.1. Các chất chuẩn đối chiếu 37 Bảng 3.1. Thời gian lưu của một số AA trên cột Zorbax NH2 (150 x 4,6 mm; 5 μm) 52 Bảng 3.2. Thời gian lưu của một số AA trên cột Zorbax Rx-Sil (150 x 4,6 mm, 5 µm) 55 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ CH3COONH4 lên thời gian lưu của Trp và độ phân giải của Trp-Phe - Pha tĩnh Inertsil Amide (150´4,6 mm; 5 µm) 60 Bảng 3.4. Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống 62 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát đường chuẩn 63 Bảng 3.6. Kết quả thẩm định độ chính xác 64 Bảng 3.7. Kết quả thẩm định độ đúng 65 Bảng 3.8. Kết quả định lượng Trp, Phe và Tyr trong chế phẩm 66 Bảng 3.9. Thời gian lưu của AG, Cys và Gly sử dụng hai cột và hai tốc độ dòng 67 o o Bảng 3.10. Thời gian lưu của AG, Cys và Gly ở nhiệt độ 26 C và 30 C 68 Bảng 3.11. Độ cân xứng của pic AG, Cys và Gly theo pH 68 Bảng 3.12. Độ cân xứng của pic AG, Cys và Gly theo nồng độ đệm 69 Bảng 3.13. Thời gian lưu các chất AG, Cys và Gly 71 Bảng 3.14. Kết quả độ phù hợp hệ thống 71 Bảng 3.15. Kết quả thẩm định độ tuyến tính 71 Bảng 3.16. Kết quả độ lặp lại trong ngày và khác ngày 72 Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp 73 Bảng 3.18. Kết quả định lượng AG, Cys và Gly trong chế phẩm Amiphargen 74 ix
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát dung môi pha mẫu (Cystine B6 Bailleul) 75 Bảng 3.20. Kết quả khảo sát thể tích dung môi pha mẫu (Cystine B6 Bailleul) 75 Bảng 3.21. Kết quả khảo sát thời gian siêu âm và lắc xoáy (Cystine B6 Bailleul) 76 Bảng 3.22. Kết quả độ phù hợp hệ thống 80 Bảng 3.23. Kết quả sự phụ thuộc diện tích pic theo nồng độ vitamin B6 và cystin 81 Bảng 3.24. Kết quả thẩm định độ chính xác của phương pháp 82 Bảng 3.25. Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp 83 Bảng 3.26. Kết quả định lượng vitamin B6 và cystin trong chế phẩm 84 Bảng 3.27. Kết quả độ phù hợp hệ thống 92 Bảng 3.28. Kết quả khảo sát đường chuẩn 93 Bảng 3.29. Kết quả thẩm định độ chính xác của phương pháp 94 Bảng 3.30. Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp 95 Bảng 3.31. Kết quả đánh giá độ ổn định của phương pháp 96 Bảng 3.32. Kết quả định lượng Par và Met trong chế phẩm 99 Bảng 3.33. Điều kiện khối phổ phân tích Trp, Phe, Tyr và Phe-d5 100 Bảng 3.34. Các thành phần mẫu nghiên cứu 106 Bảng 3.35. Tổng %RE của từng mô hình 111 Bảng 3.36. Độ đúng và độ chính xác trong ngày 112 Bảng 3.37. Độ đúng và độ chính xác khác ngày (n=15) 112 Bảng 3.38. Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã đông (n=3) 115 Bảng 3.39. Độ ổn định sau 5 ngày ở -20oC (n=3) 116 Bảng 3.40. Kết quả định lượng mẫu huyết tương tham chiếu 117 x
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Số hình Tên hình Trang Hình 1.1. Các lớp dung môi trên bề mặt pha tĩnh trong một hệ thống 10 HILIC Hình 1.2. Công thức cấu tạo chung của các acid amin 16 Hình 1.3. Con đường chuyển hóa Phe, Tyr và các rối loạn liên quan 22 Hình 3.1. Sắc ký đồ của mẫu pha động và 19 AA - cột Zorbax NH2 (150 51 x 4,6 mm; 5 μm); pha động ACN - CH3COOH 2 mM Hình 3.2. Sắc ký đồ của mẫu pha động và 19 AA -cột Zorbax Rx-Sil 54 (150 x 4,6 mm; 5 μm); pha động ACN - CH3COONH4 10 mM Hình 3.3. Thời gian lưu một số AA theo pH pha động, cột Zorbax Rx-Sil 56 (150 x 4,6 mm, 5 µm) Hình 3.4. Hệ số αTrp của các AA theo pH pha động (2 mM), cột Zorbax 57 Rx-Sil (150 x 4,6 mm, 5 µm) Hình 3.5. Hệ số αTrp của các AA theo pH pha động (10 mM), cột Zorbax Rx-Sil (150 x 4,6 mm, 5 µm) 57 Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỉ lệ ACN lên thời gian lưu của Tyr (a) và khả năng tách Trp, Phe và Tyr (b) - Pha tĩnh Ascentis Silica (250´4,6 mm; 5 µm) 59 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ CH3COONH4 lên thời gian lưu của Tyr - Pha tĩnh Ascentis Silica (250´4,6 mm; 5 µm), pha động ACN-CH3COONH4 = 80:20 59 Hình 3.8. Ảnh hưởng của tỉ lệ ACN lên thời gian lưu của Trp, Phe và Tyr trên pha tĩnh Inertsil Amide (150´4,6 mm; 5 µm) 60 Hình 3.9 Sắc ký đồ tách Trp, Phe và Tyr - pha động ACN: CH3COONH4 125 mM, 80:20, f 0,8 mL/phút - Pha tĩnh Inertsil Amide (150´4,6 mm; 5 µm) 61 Hình 3.10. Sắc ký đồ các dung dịch trong thẩm định độ chọn lọc - mẫu trắng (a,b), mẫu chuẩn (c,d) và mẫu thử (e,f) tại 2 bước sóng 210 nm (a,c,e) cho định lượng Phe và 230 nm (b,d,f) cho định lượng Trp và Tyr 62 Hình 3.11. Hình ảnh chồng phổ mẫu thử Kidmin và mẫu chuẩn Trp (a); Phe (b) và Tyr (Tyr) 63 xi
Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu thử Kidmin (KM) và Nephosteril (NS) ở hai bước sóng 210 nm và 230 nm 66 Hình 3.13. Sắc ký đồ của chuẩn Cys pha trong dung dịch đệm phosphat (a), dung dịch đệm phosphat – acetonitril (b) và nước (c) 67 Hình 3.14. Phổ hấp thụ UV-VIS của AG (a), Cys (b) và Gly (c) 69 Hình 3.15. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp tại bước sóng 254 và 200 nm 70 Hình 3.16. Sắc ký đồ các dung dịch kiểm tra độ chọn lọc (ở 200 nm và 254 nm) 70 Hình 3.17. Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa diện tích pic (mAU*s) và 72 nồng độ của AG, Cys và Gly Hình 3.18. Quy trình chuẩn bị mẫu thử Cystine B6 Bailleul 77 Hình 3.19. Kết quả khảo sát thành phần pha động: H3PO4 10 mM (a), HCOOH 10 mM (b), Natri citrat 10 mM (c), KH2PO4 20 mM (d), CH3COONa 20 mM (e), CH3COONH4 30 mM (f) 78 Hình 3.20. Kết quả khảo sát nồng độ muối CH3COONH4 15 mM (a), 50 mM (b) 78 Hình 3.21. Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động CH3COONH4 50 mM 70:30 (a), 65:35 (b) 79 Hình 3.22. Phổ hấp thụ UV của cystin (a) và vitamin B6 (b) 79 Hình 3.23. Kết quả độ chọn lọc ở bước sóng 250 nm (a) và 286 nm (b) 80 Hình 3.24. Kết quả chồng phổ pic vitamin B6 (a) và cystin 286 nm (b) 81 Hình 3.25. Kết quả đánh giá độ ổn định của vitamin B6 và cystin trong dung dịch thử (a) và dung dịch chuẩn (b) 83 Hình 3.26. Phổ hấp thụ UV của Par (a) và Met (b) 84 Hình 3.27. Kết quả khảo sát các pha động chứa ACN và acid acetic 15 mM (a); acid formic 10 mM (b) - cột Zorbax SB-CN 85 Hình 3.28. Ảnh hưởng của DEA lên thời gian lưu và hệ số cân xứng của Met trên cột Zorbax SB-CN 86 Hình 3.29. Ảnh hưởng của DEA lên thứ tự rửa giải và khả năng tách Met và Par trên cột Zorbax SB-CN 86 Hình 3.30. Kết quả khảo sát các pha động chứa ACN và dung dịch acid/muối trên cột Zorbax Rx silica 87 xii
Hình 3.31. Kết quả khảo sát nồng độ DEA 10 mM (a) và 5 mM (b) 88 Hình 3.32. Kết quả khảo sát tốc độ dòng 0,5 mL/phút (a);0,6 mL/phút (b); 0,7 mL/phút (c) 88 Hình 3.33. Quy trình chuẩn bị mẫu thử Pasafe 90 Hình 3.34. Sắc ký đồ các dung dịch mẫu trắng (a,b), chuẩn (c,d) và thử (e,f) tại bước sóng 210 nm (a,c,e) (định lượng Met) và 254 nm (b,d,f) (định lượng Par) 92 Hình 3.35. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của Par (a) và Met (b) 93 Hình 3.36. Kết quả thẩm định độ ổn định của phương pháp: Ảnh hưởng chung của các yếu tố khảo sát (a) ảnh hưởng lên hàm lượng Met (b); ảnh hưởng lên tR Met (c); ảnh hưởng lên độ cân xứng pic Met (d) 97 Hình 3.37. Phổ MS ở chế độ MRM của Trp (a); Phe (b); Tyr (c) và Phe- d5 (d) 99 Hình 3.38. Kết quả phân tích Trp trong BSA (a); HSA (b) và trong các mẫu thêm chuẩn: BSA (c); HSA (d); Glucose (e), NaCl (f); PBS (g); Ringer lactat (h); nước (i); HT (k) 100 Hình 3.39. Kết quả phân tích Phe trong BSA (a); HSA (b) và trong các mẫu thêm chuẩn: BSA (c); HSA (d); Glucose (e), NaCl (f); PBS (g); Ringer lactat (h); nước (i); HT (k) 101 Hình 3.40. Kết quả phân tích Tyr trong BSA (a); HSA (b) và trong các mẫu thêm chuẩn: BSA (c); HSA (d); Glucose (e), NaCl (f); PBS (g); Ringer lactat (h); nước (i); HT (k) 101 Hình 3.41. Kết quả đáp ứng pic Tyr trong khảo sát dung môi xử lý mẫu 102 Hình 3.42. Đáp ứng của Tyr trong PBS và HT thêm chuẩn cùng nồng độ 103 Hình 3.43. Đáp ứng Tyr trong mẫu tỷ lệ 400/1 (a) và 200/1 (b) 103 Hình 3.44. Quy trình xử lý mẫu định lượng Trp, Phe và Tyr trong huyết 104 tương Hình 3.45. Kết quả khảo sát pha tĩnh silica (a); diol (b); amid (c) 105 Hình 3.46. Kết quả khảo sát thành phần pha động - PĐ 2 (a); PĐ 3 (b); PĐ 4(c) 105 Hình 3.47. Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 80:20 (a); 85:15 (b) 106 xiii
Hình 3.48. Kết quả độ chọn lọc PBS (a); Chuẩn đơn (b); Chuẩn hỗn hợp (c); Thử (d); Thử thêm chuẩn (e) 109 Hình 3.49. Đồ thị thể hiện %RE theo nồng độ Tyr từ các mô hình không sử dụng trọng số và sử dụng các trọng số khác nhau 110 Hình 3.50. Kết quả khảo sát đường chuẩn 111 Hình 3.51 Ảnh hưởng của nền mẫu thông qua so sánh hệ số góc 114 Hình 3.52 Sắc ký đồ phân tích mẫu QC II: pic Phe (a) và pic Phe-d5 (b) 118 xiv
ĐẶT VẤN ĐỀ Sắc ký lỏng tương tác thân nước (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography – HILIC) là kỹ thuật tách sử dụng pha tĩnh phân cực và pha động phân cực[14]. HILIC có khả năng lưu giữ tốt các chất phân cực. Các đặc điểm về cơ chế, sự lưu giữ và các yếu tố ảnh hưởng trong HILIC hiện vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu trên thế giới và các ứng dụng của HILIC ở Việt Nam chưa nhiều. Acid amin là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein, phân tử sinh học đóng vai trò chủ yếu trong sự hình thành, duy trì cấu trúc và chức năng của cơ thể sống. Ngoài ra, các acid amin còn tham gia tổng hợp nên các hợp chất có hoạt tính sinh học và có vai trò quan trọng trong cơ thể [88]. Các chế phẩm chứa acid amin được sử dụng trong trường hợp cơ thể bị thiếu protein cần bổ sung nhanh trong thời gian ngắn [47], điều trị mất cân bằng về dẫn truyền thần kinh, chữa bệnh gan, tiểu đường, ngăn ngừa ung thư…[89] Đặc điểm làm cho việc phân tích acid amin khó khăn là do tính phân cực cao, kém lưu giữ trong sắc ký lỏng pha đảo, do đó chúng thường cần phải được dẫn xuất hoá. Với chế phẩm chứa acid amin và thành phần khác thường phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau để định lượng. HILIC có thể khắc phục được nhược điểm kém lưu giữ của acid amin trong RPLC. Bên cạnh đó, HILIC cũng có thể lưu giữ các chất có độ phân cực mạnh và trung bình khác nên có thể xây dựng phương pháp định lượng đồng thời acid amin với thành phần khác (phân cực, phân cực trung bình) trong chế phẩm đa thành phần, khắc phục nhược điểm cần sử dụng các phương pháp khác nhau cho loại chế phẩm này. Rối loạn chuyển hóa acid amin là một tình trạng bệnh tuy hiếm gặp nhưng lại có ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe của người bệnh. Trong rối loạn chuyển hóa acid amin, các enzym tham gia quá trình tổng hợp hoặc chuyển hóa acid amin bị thay đổi hoạt tính, dẫn đến nồng độ các acid amin trong cơ thể bị thay đổi đột biến, có thể nguy hiểm đến tính mạng [98]. Một nhóm rối loạn chuyển hoá hay gặp là rối loạn chuyển hoá acid amin thơm. Bệnh thường có tiên lượng tốt nếu được phát hiện sớm nhưng lại có tỷ lệ tử vong cao nếu không được điều trị kịp thời [111]. Do đó việc xác định được các acid amin trong cơ thể là vô cùng quan trọng để phát hiện sớm các bất thường trong cơ thể, tăng cơ hội cải thiện sức khỏe cho người bệnh. Bên cạnh sàng lọc nhanh, phân tích acid amin trong máu và các dịch sinh học khác còn giúp đánh giá tình trạng bệnh nhân và theo dõi hiệu quả điều trị của phác đồ chữa bệnh. Nền mẫu dịch sinh học rất phức tạp, các nghiên cứu phân tích acid amin sử dụng kỹ thuật dẫn xuất hoá và phân tích bằng RPLC-UV thường gặp khó khăn về độ chọn lọc. Do tính phân cực của các acid amin, các nghiên cứu sử dụng RPLC không dẫn xuất hoá kết nối với detector MS thường sử dụng pha 1
động có nhiều nước, do đó gặp vấn đề về tính tương thích của dung môi pha động với detector MS. Trong khi đó, pha động HILIC chứa tỷ lệ cao dung môi hữu cơ, thể hiện ưu điểm tương thích với detector MS. Để triển khai một kỹ thuật phân tích chưa được phổ biến nhiều ở nước ta và ứng dụng trong phân tích các acid amin, luận án “Phân tích một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước” được thực hiện với hai mục tiêu sau: 1. Xây dựng được phương pháp phân tích đồng thời một số acid amin cùng thành phần khác trong chế phẩm bằng HILIC-DAD và xác định được một số yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ và hình dáng pic trong HILIC. 2. Xây dựng được phương pháp phân tích một số acid amin thơm trong huyết tương bằng HILIC-MS/MS nhằm hỗ trợ theo dõi và điều trị bệnh rối loạn chuyển hoá các acid amin này. 2
Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC Sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC – hydrophillic interaction liquid chromatography) được định nghĩa bởi Alpert [14]. Kỹ thuật này sử dụng pha tĩnh (PT) phân cực và pha động (PĐ) phân cực, có khả năng lưu giữ tốt các chất phân cực. HILIC thể hiện ưu điểm so với sắc ký lỏng pha đảo ở khả năng lưu giữ các chất phân cực [14]; ưu điểm so với sắc ký lỏng pha thuận do sử dụng các dung môi hữu cơ an toàn, thân thiện hơn và có khả năng hoà tan các chất phân cực tốt hơn [23]. HILIC có PĐ tương thích với detector khối phổ. Để tách các hợp chất phân cực thân nước trong điều kiện thích hợp để liên kết với ESI thì HILIC là lựa chọn tốt nhất [58]. 1.1.1. Đặc điểm các pha 1.1.1.1. Pha tĩnh * Phân loại pha tĩnh Pha tĩnh (PT) sử dụng trong phân tích HILIC là những bề mặt phân cực, phổ biến nhất là silica không dẫn xuất hoặc silica dẫn xuất hoá với nhiều nhóm chức phân cực khác nhau. Ngoài ra, polyme [39], carbon graphit xốp (porous graphitic carbon), titan dioxid [82] cũng có thể được sử dụng làm vật liệu nền cho PT trong HILIC, tuy nhiên các PT trên nền silica được sử dụng nhiều hơn do hiệu lực tách tốt hơn, phổ biến hơn và ổn định hơn [60], [82]. Các PT được sử sụng đầu tiên có bản chất giống với PT trong sắc ký lỏng pha thuận. Năm 1975, Linden và Lawhead sử dụng PT amino tách các carbohydrat, sau đó, PT amid silica được dùng để tách các peptid [75], [114]. Hiện nay vật liệu chế tạo PT HILIC đa dạng và có những đặc điểm lưu giữ khác nhau [23], [39], [50], [60]. Bảng 1.1. dưới đây trình bày cấu trúc một số PT thường gặp. Dựa trên cấu trúc và các tương tác với chất phân tích, các PT được chia thành PT có bề mặt không tích điện, PT tích điện dương, PT tích điện âm, PT lưỡng cực. - Pha tĩnh không tích điện Pha tĩnh này có bề mặt không tích điện trong khoảng pH từ 3-8, do đó không có tương tác trao đổi ion với các chất phân tích [39], [50]. Các PT thuộc nhóm này là các dẫn xuất của silica với các nhóm thế tạo thành pha liên kết chứa nhóm diol, cyano, amid…. Lưu ý với các PT pha liên kết chưa khoá nhóm silanol dư, ở pH PĐ trên 4, nhóm silanol tạo thành ion âm dẫn đến sự xuất hiện các tương tác tĩnh điện của PT với chất phân tích tương tự PT silica [50]. 3
Bảng 1.1. Cấu trúc của một số pha tĩnh dùng trong HILIC Vật liệu Cấu trúc của pha tĩnh Pha tĩnh không tích điện Diol Cyano Amid Pha tĩnh tích điện dương NH3+ Amino Pha tĩnh tích điện âm Silica trần Si – O – Si – O– Pha tĩnh lưỡng cực Sulfobetain Pha liên kết diol là PT đầu tiên được sử dụng trong HILIC. Các pha diol liên kết hóa học có chứa nhóm dihydroxypropyl liên kết với silica, thể hiện tính phân cực cao và có khả năng liên kết hydro, không chứa các nhóm ion khác ngoài các nhóm silanol chưa phản ứng [23]. Một dạng đặc biệt của pha liên kết diol là pha diol liên kết chéo, các 4