Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức năng

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:142

Thêm vào BST

Báo xấu

139
lượt xem 21
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp Coenzyme Q10; nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận Coenzyme Q10; ứng dụng Coenzyme Q10 vào sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức năng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức năng

LỜI CAM ĐOAN Luận án này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài.“Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức năng” mã số ĐT.07.14/CNSHCB của Bộ Công thương. Là người tham gia trực tiếp các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận án này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các công trình nghiên cứu nào và đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 GVHD 1 GVHD 2 Nghiên cứu sinh GS.TS. Đặng Thị Thu PGS.TS. Trƣơng Quốc Phong Nguyễn Việt Phƣơng
LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS.TS Đặng Thị Thu, nguyên Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, PGS.TS Trương Quốc Phong, Trưởng phòng Proteomic - Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cám ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, Trưởng bộ môn Vi Sinh – Hóa sinh và Sinh học Phân tử cùng các thầy giáo, cán bộ bộ môn Vi sinh – Hóa sinh và Sinh học Phân tử, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin chân thành cám ơn tới Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về thời gian và vật chất để tôi hoàn thành Luận án này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn tới gia đình, bố mẹ, vợ, con và các anh chị em, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập và nghiên cứu tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.
MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn MỞ ĐẦU............................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................... 3 1.1. CẤU TẠO COENZYME Q10 ..................................................................................... 3 1.2. NGUỒN THU COENZYME Q10 ............................................................................... 4 1.2.1. Tổng hợp hóa học .................................................................................................... 4 1.2.2. Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật ...................................................................... 6 1.2.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật .................................................................................. 6 1.3. CON ĐƢỜNG TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ VI SINH VẬT ....................... 7 1.4. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A. TUMEFACIENS ........ 10 1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon ................................................ 10 1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ nitơ .......................................................... 11 1.4.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng ............................................................................... 12 1.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................................................ 12 1.4.5. Ảnh hưởng của pH................................................................................................. 13 1.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan ..................................................................... 13 1.5. KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 ........................... 14 1.5.1. Lên men gián đoạn ................................................................................................ 14 1.5.2. Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – batch) .................................... 14 1.6. TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH COENZYME Q10 ................................................ 15 1.6.1. Tách chiết Coenzyme Q10 .................................................................................... 15 1.6.2. Tinh sạch Coenzyme Q10...................................................................................... 17 1.6.3. Đặc tính của Coenzyme Q10 ................................................................................. 18 1.7. CẢI BIẾN CHỦNG VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 ......... 21 1.7.1. Đột biến chủng ...................................................................................................... 21 1.7.2. Chủng tái tổ hợp .................................................................................................... 21 1.8. VAI TRÕ VÀ ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 ............................................. 29 1.8.1. Vai trò của Coenzyme Q10 ................................................................................... 29 1.8.2. Ứng dụng của Coenzyme Q10 .............................................................................. 31 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 35 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ.................................................................. 35 2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid ................................................................................ 35 2.1.2. Hóa chất ................................................................................................................. 35 2.1.3. Thiết bị sử dụng ..................................................................................................... 36 2.1.4. Môi trường và các dung dịch sử dụng ................................................................... 37 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................. 38 2.2.1. Phương pháp vi sinh .............................................................................................. 38 2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử .............................................................................. 39 2.2.3. Phương pháp hóa lý, hóa sinh................................................................................ 46 2.2.4. Phương pháp toán học ........................................................................................... 52 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 55 3.1. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN A. TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 ............................................................................................................. 55 3.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng sinh tổng hợp Coenzyme Q10 .................................. 55 3.1.2. Định tên chủng A. tumefaciens TT4 ...................................................................... 59 3.2. NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN A. TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 ...................................................................................................................................... 61
3.2.1. Tách dòng gen dps và dxs từ A. tumefaciens TT4 ................................................. 61 3.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs ......................................................... 66 3.3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A. TUMEFACIENSTÁI TỔ HỢP............................................. 73 3.3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10.... 74 3.3.2. Ảnh hưởng của pH đầu môi trường ....................................................................... 78 3.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống .................................................................................... 78 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy .......................................................................... 79 3.3.5. Ảnh hưởng của thời gian ....................................................................................... 80 3.4. TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A. TUMEFACIENS............................................................................................................ 81 3.4.1. Chọn miền khảo sát ............................................................................................... 81 3.4.2. Thiết lập mô hình................................................................................................... 82 3.4.3. Tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp 84 3.5. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH COENZYME Q10 TỪ CHỦNG A. TUMEFACIENSTÁI TỔ HỢP ............................................................. 85 3.5.1. Đánh giá các phương pháp phá vỡ tế bào .............................................................. 85 3.5.2. Xác định điều kiện xử lý tế bào bằng ethanol ....................................................... 86 3.5.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 ................................................................... 88 3.5.4. Quy trình thu nhận Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp .......................... 93 3.6. KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH HÓA LÝ CỦA COENZYME Q10 ................................. 95 3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của Coenzyme Q10 ....................................... 95 3.6.2. Ảnh hưởng của pH tới độ bền của Coenzyme Q10 ............................................... 96 3.6.3. Ảnh hưởng của ánh sáng tới độ bền của Coenzyme Q10 ...................................... 97 3.7. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA COENZYME Q10 .......... 98 3.7.1. Hoạt tính chống oxy hóa của Coenzyme Q10 ....................................................... 98 3.7.2. Khả năng ức chế tế bào ung thư của Coenzyme Q10 ........................................... 99 3.8. ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DƢỚI DẠNG VIÊN NANG .................................................................. 101 3.8.1. Nghiên cứu tạo phức hợp Coenzyme Q10 với β-Cyclodextrin ........................... 101 3.8.2. Khảo sát một số đặc tính phức CoQ10- β- Cyclodextrin .................................... 102 3.8.3. Xây dựng quy trình điều chế viên nang cứng chứa Coenzyme Q10 ................... 105 3.8.4. Phân tích, đánh giá viên nang chứa Coenzyme Q10 ........................................... 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ......................... 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 115 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 124
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT Kí hiệu Tên Amp Ampicilline ATP Adenosine triphosphate Bp Cặp base Cfu Colony forming unit CoQ Coenzyme Q CoQ10 Coenzyme Q10 CoQ10H2 Coenzyme Q10 quinol CSL Corn steep Liquor CSP Corn steep Powder DO Dissolved oxygen DNA Deoxyribonucleic acid DPS Decaprenyl diphosphate synthase DXS 1- deoxy-D- xylulose 5- phosphate synthase DMAPP Dimethylallyl diphosphate EtBr Ethidium bromide FPP Farnesyl phosphate HPLC High-performance liquid chromatography IPP Isopentenyl diphosphate Kan Kannamycine kDa Killo Dalton LB Luria-Bertani MEP 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate MVA Mevalonate OD Mật độ quang (độ hấp thụ) PCR Phản ứng chuỗi polymerase Phba p-hudroxybenzoic acid v/w Thể tích/khối lượng v/v Thể tích/thể tích
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1 1. Các trạng thái khác nhau của CoQ10 .................................................................... 3 Hình 1 2. Vị trí của CoQ10 trong lớp kép lipid .................................................................... 4 Hình 1.3. Quá trình tổng hợp hợp chất trung gian quan trọng: để tổng hợp CoQ10 ............. 5 Hình 1.4. Con đường trao đổi chất tổng hợp CoQ10 ............................................................ 7 Hình 1.5. Cấu tạo của β – cyclodextrin ............................................................................... 19 Hình 1.6. Chuỗi vận chuyển điện tử .................................................................................... 30 Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang gene dps…………………………….…43 Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang gene dxs ................................................ 44 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang đồng thời hai gene dps và dxs ................ 45 Hình 2.4. Phản ứng giữa ethyl cyanoacetate và CoQ10 ...................................................... 48 Hình 2.5. Phương trình phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa ......... 50 Hình 3.1. Hình ảnh nhuộm Gram một số chủng phân lập (TT4, ML5), chủng chuẩn A. tumefaciens ứng EHA và AA2.......……………………………………………………….55 Hình 3.2. Khả năng sinh 3-ketolactose của các chủng lựa chọn. A: Màu của khuẩn lạc khi mới thêm thuốc thử Benedict. B: Màu của khuẩn lạc khi thêm thuốc thử Benedict sau 75 phút ...................................................................................................................................... 56 Hình 3.3. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và sản phẩm cắt DNA bằng enzyme hạn chế cho gene dps (B). Đường chạy 1-12 (A), sản phẩm PCR gene dps từ DNA tổng số chủng TT1, TT2.1, TT2.2, TT3, TT4, ML1-ML7, tương ứng. Đường chạy 1-8 (B), sản phẩm PCR trước và sau khi cắt bằng PstI của 4 chủng TT1, TT2-1, TT2-2, TT4, tương ứng. M, thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas) .......................................................................................... 58 Hình 3 4. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và sản phẩm cắt DNA bằng enzyme hạn chế cho gene dxs (B). Đường chạy 1-12 (A), sản phẩm PCR gene dxs từ DNA tổng số chủng TT1, TT2.1, TT2.2, TT3, TT4, ML1-ML7, tương ứng. Đường chạy 1-8 (B), sản phẩm PCR trước và sau khi cắt bằng NdeI của 4 chủng TT1, TT2-1, TT2-2, TT4, tương ứng. M, thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas) ................................................................................ 58 Hình 3.5. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 các chủng A. tumefaciens phân lập ................ 59 Hình 3.6. Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ A. tumefaciens TT4 ............................... 61 Hình 3.7. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA tổng số của A. tumefaciensTT4. M, thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scientific, Mỹ) ................ 62 Hình 3. 8. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA plasmid của các dòng tái tổ hợp. C3, C6 là khuôn DNA plasmid tách chiết từ clone số 3 và số 6. TT4 là khuôn DNA tổng số tách chiết từ chủng A. tumefaciens TT4. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) ........................................................... 63 Hình 3. 9. Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid bằng các enzyme hạn chế đối với dòng số 3 mang gen dps (A) và dòng 6 mang gen dxs (B). Đường chạy 1, 3 là DNA plasmid chưa cắt; đường chạy 2, 4 là DNA plamid được cắt bằng cặp enzyme SacI/BamHI và BamHI/SalI tương ứng với clone 3 và 6. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) .................................................................................................... 63 Hình 3.10. Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của gen dps được tách dòng ........... 64 Hình 3.11. Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của gen dxs được tách dòng ........... 66 Hình 3. 12. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa chọn đối với gen dps. Đường chạy 1-8 tương ứng với 8 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. Đường chạy (+) là sản phẩm PCR từ khuôn gốc. Đường chay (-) là sản phẩm cắt plasmid đối chứng. M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) ........................................................... 67 Hình 3.13. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa chọn đối với gen dxs. Đường chạy 1-2 tương ứng với 2 dòng được lựa chọn. ĐC là sản
phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) ..................................................................... 68 Hình 3.14. Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng sử dụng cặp mồi DpsF/R (A) và sản phẩm cắt enzyme hạn chế (B). Đường chạy 1-10, sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng tương ứng; mẫu đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs (ĐC); RE/9, dòng số 9 được xử lý bởi SacI/BamHI thang DNA chuẩn 100 bp (M1) và 1kb (M2) ............................................................................................................................................. 69 Hình 3.15. Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) .......................................................... 70 Hình 3.16. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng A. tumefaciens tái tổ hợp. Chủng tái tổ hợp chứa vector tái tổ hợp mang đơn gen pCAM-pds và pCAM-dxs và đồng thời hai gen pCAM-dps-dxs. Chủng đối chứng mang vector pCAMBIA1301 ................... 71 Hình 3.17. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs ...................................................................................................... 72 Hình 3.18. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B), sản phẩm cắt enzyme hạn chế SacI/BamHI từ DNA plasmid của A. tumefaciens DPSX12 .................... 73 Hình 3.19. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens .......................................................................................................................... 74 Hình 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp .......................................................................................................... 75 Hình 3. 21. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens .......................................................................................................................... 76 Hình 3. 22. Ảnh hưởng của nồng độ cao ngô đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp .......................................................................................................... 77 Hình 3. 23. Ảnh hưởng của pH đầu đến khả năng tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp ....................................................................................................................................... 78 Hình 3.24. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens .......................................................................................................................... 79 Hình 3.25. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp .......................................................................................................... 80 Hình 3. 26. Ảnh hưởng của thời gian đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens ............................................................................................................................................. 81 Hình 3.27. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng CoQ10 ............................................................ 84 Hình 3.28. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu nuôi cấy chủng A. tumefacienstái tổ hợp..... 84 Hình 3.29. Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào tách thu CoQ10 ..................................... 85 Hình 3.30. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/sinh khối đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ ... 86 Hình 3.31. Ảnh hưởng của thời gian đồng hóa đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp .......................................................................................................... 87 Hình 3.32. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp ................................................................................................................................... 88 Hình 3.33. Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) và dịch chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp (B) ................................................................................................................................. 89 Hình 3.34. So sánh độ sạch của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn, S dịch CoQ10 chuẩn ........................................................................ 90 Hình 3.35. Phổ hấp thụ dịch chiết CoQ10 theo số lần chiết khác nhau .............................. 91 Hình 3.36. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 1 lần chiết, L3, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết, S dịch CoQ10 chuẩn ....................................................................................................................... 92 Hình 3.37. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L3, dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 3 lần chiết; E1, dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica gel; S, dịch CoQ10 chuẩn ..................................................................................... 93
Hình 3.38. Quy trình thu nhận CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp................................. 94 Hình 3.39. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A. tumefaciens .......................................................................................................................... 96 Hình 3.40. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A. tumefaciens ............................................................................................................................................. 97 Hình 3.41. Ảnh hưởng của ánh sáng đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A. tumefaciens .......................................................................................................................... 97 Hình 3.42. Khả năng chống oxi hóa của CoQ10 ................................................................. 98 Hình 3.43. Phản ứng của CoQ10 các nồng độ khác nhau với DPPH (T-mẫu trắng) .......... 99 Hình 3.44. Ảnh hưởng của CoQ10 lên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C (A), FL (B) và tế bào thận thỏ bình thường RK13 (C). Một số hình ảnh tế bào đại diện ở nồng độ 0, 20 và 80 µM CoQ10 ............................................................................................................... 100 Hình 3.45. Hiệu suất thu hồi CoQ10 theo tỷ lệ phối trộn giữa CoQ10 với β-cyclodextrin ........................................................................................................................................... 102 Hình 3.46. Khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong nước. CoQ10 tạo phức với Cyclodextrin theo các tỷ lệ khác nhau ............................................................................... 103 Hình 3.47. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10 trong phức β- CDQ10......... 104 Hình 3.48. Ảnh hưởng của ánh sáng đến độ bền của CoQ10 trong phức β- CDQ10 ....... 105 Hình 3.49. Quy trình công nghệ sản xuất viên nang thực phẩm chức năng chứa CoQ10. 106 Hình 3.50. Viên nang thực phẩm chức năng bổ sung chứa CoQ10 .................................. 107
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các gen mã hóa cho các enzyme xúc tác tới quá trình tổng hợp CoQ10 .............. 9 Bảng 1.2. Chủng chủ và hệ biểu hiện vi khuẩn được dùng để sinh tổng hợp CoQ10 ......... 26 Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng……………………………………………………………35 Bảng 2.2. Máy và thiết bị .................................................................................................... 36 Bảng 2.3. Chương trình thực hiện phản ứng PCR nhân gen dps ......................................... 40 Bảng 2.4. Chương trình thực hiện phản ứng PCR nhân gen dxs ......................................... 40 Bảng 2.5. Các biến số và khoảng chạy của chúng ............................................................... 52 Bảng 2.6. Ma trận thực nghiệm ........................................................................................... 53 Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng phân lập…………………………….57 Bảng 3.2. Mã số trình tự một số chủng A. tumfaciens trên ngân hàng gen ........................ 60 Bảng 3.3. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng CoQ10 thu được . 82 Bảng 3.4. Phân tích phương sai ANOVA của mô hình ....................................................... 83 Bảng 3 5. Khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong nước. .................................... 102 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến độ hòa tan của phức β-CDQ10 ................................... 103 Bảng 3.7. Kết quả kiểm nghiệm độ đồng đều về khối lượng ............................................ 107 Bảng 3.8. Kết quả đo độ rã ................................................................................................ 108 Bảng 3.9. Kết quả định lượng CoQ10 trong viên nang ..................................................... 109 Bảng 3.10. Kết quả phân tích viên nang thực phẩm chức năng CoQ10 ............................ 110 Bảng 3.11. Bảng theo dõi trọng lượng chuột………………………………….................110
MỞ ĐẦU Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), là một trong những coenzyme tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử bám màng ở cả prokaryote và eukaryote, được cấu tạo bởi vòng benzoquinone và chuỗi isoprenoid kị nước. CoQ10 có vai trò quan trọng trong việc sản xuất ra ATP - nguồn năng lượng sinh học của cơ thể. Do có tính chất chống oxy hóa mạnh, trung hòa các gốc tự do nên CoQ10 ngày càng được sử dụng nhiều làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe và được đưa vào các mỹ phẩm làm đẹp như một chất chống oxy hóa, chống lão hóa để giúp cơ thể trẻ hóa; ứng dụng trong y tế nhằm ngăn ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh về tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng hệ thống miễn dịch, giảm huyết áp...[5, 71, 72, 74]. Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một tăng lên. Để đáp ứng nhu cầu đó đã có nhiều giải pháp được đưa ra như tổng hợp hóa học, bán tổng hợp và công nghệ sinh học. Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên hiện nay CoQ10 được sản xuất chủ yếu bằng con đường lên men nhờ vi khuẩn như Agrobacterium tumefaciens, Escherichia. coli, Sporobolomyces salmonicolor, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus denitrificans...[34, 36, 43, 54, 67, 91, 102]. Để nâng cao hiệu quả sản xuất CoQ10, từ năm 1993 nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tập trung vào tối ưu hóa quá trình lên men chủng tự nhiên hoặc cải biến chủng. Việc cải biến chủng được thực hiện bằng cách gây đột biến ngẫu nhiên hoặc tạo chủng tái tổ hợp. Mặc dù các chủng đột biến có khả năng tổng hợp CoQ10 cao hơn so với chủng gốc, tuy nhiên hàm lượng CoQ10 từ các chủng này vẫn chưa được như mong đợi. Hiện nay nhiều nghiên cứu đã và đang tập trung vào việc tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang gen mã hóa một số enzyme quan trọng của con đường sinh tổng hợp CoQ10 như dxs và dps, song khả năng tổng hợp CoQ10 còn thấp so với các chủng đột biến. Ngoài ra, các chủng E. coli tái tổ hợp không chỉ tổng hợp CoQ10 mà còn tổng hợp cả CoQ8 và CoQ9. Đây là điều bất lợi cho việc tách tinh sạch thu CoQ10 đặc biệt là khi sản xuất ở quy mô công nghiệp. A. tumefaciens là một trong những vi khuẩn đang được sử dụng để sản xuất CoQ10 hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có hàm lượng CoQ10 tương đối cao so với các vi sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất ở quy mô công nghiệp [16, 33, 34, 101]. Chiến lược sử dụng chính vi khuẩn A. tumefaciens làm chủng chủ để cải biến gen tạo chủng tái tổ hợp có khả năng tổng hợp CoQ10 tăng lên 1
là một giải pháp khả thi và đã bước đầu thành công bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc năm 2008 [16]. Ở Việt Nam hiện nay các nghiên cứu về hướng này mới chỉ là các nghiên cứu về phân lập các chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 [2, 4]. Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng A. tumefaciens tái tổ hợp”  Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp Coenzyme Q10. - Nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận Coenzyme Q10. - Ứng dụng Coenzyme Q10 vào sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức năng.  Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn chủng A. tumefaciens sinh tổng hợp Coenzyme Q10. - Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoenzymeQ10. - Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 và xác định đặc tính của Coenzyme Q10 từ chủng A. tumefaciens tái tổ hợp.  Khảo sát khả năng ứng dụng của Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng dưới dạng viên nang.  Những đóng góp mới của luận án - Đã phân lập và tuyển chọn được chủng A. tumefaciens TT4 sinh tổng hợp CoQ10 cao. - Đã tách dòng và giải trình tự được 2 gen dps và dxs mã hóa cho 2 enzyme chìa khóa của con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A. tumefaciens TT4 phân lập ở VN và tạo được chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang 2 gen trên cho năng suất sinh tổng hợp CoQ10 cao. - Bước đầu ứng dụng Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng dưới dạng viên nang. 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. CẤU TẠO COENZYME Q10 Coenzyme Q10 (2,3-dimethoxy-5-methyl-6-multiprenyl-1,4-benzoquinone) còn gọi là (ubiquinone, ubidecarenone, CoQ10) lần đầu tiên được phân lập từ tim bò bởi Frederick Crane (USA) năm 1957 [21]. CoQ10 là một hợp chất kị nước, tan trong chất béo và các dung môi phân cực, có những tính chất tương tự như vitamin [60, 63]. Cấu trúc hóa học của coenzyme Q10 bao gồm một vòng quinone liên kết với chuỗi mạch bên isoprene. Coenzyme Q10 có công thức phân tử C59H90O4, khối lượng mol: 863.34 g/ mol [63]. Coenzyme Q có thể tồn tại dưới 3 trạng thái: dạng khử ubiquinol (CoQH2), dạng trung gian (CoQH •), và dạng ôxi hóa ubiquinone (CoQ) [24, 63]. Hình 1 1. Các trạng thái khác nhau của CoQ10 CoQ10 được xác định chủ yếu nằm ở lớp màng trong ty thể của sinh vật nhân chuẩn và màng plasma của sinh vật nhân sơ. CoQ10H2 là một phân tử rất kỵ nước nằm ở giữa lớp phospholipid kép. 3
Coenzyme Q10 có cấu trúc một đầu quinone, nó có thể chuyển giao điện tử và đuôi là một chuỗi isoprenoid dài bên trong màng ti thể hay màng tế bào chất của các sinh vật hô hấp hiếu khí. Đuôi này giúp cho các phân tử CoQ10 có thể khuếch tán dễ dàng trong lớp màng lipid [63]. Hình 1 2. Vị trí của CoQ10 trong lớp kép lipid [63] 1.2. NGUỒN THU COENZYME Q10 CoQ10 được sản xuất từ ba phương pháp: lên men (tổng hợp sinh học), tổng hợp hóa học hoặc tách chiết từ mô động vật, thực vật. 1.2.1. Tổng hợp hóa học CoQ10 có thể tổng hợp theo một số con đường bán tổng hợp [51, 80, 100]. Trong số đó sử dụng solanesol cho quá trình tổng hợp chuỗi mạch nhánh isoprene liên kết với dẫn xuất quinone là phương pháp đầy tiềm năng. Solanesol có thể dễ dàng thu được bằng cách chiết xuất từ lá thuốc lá hoặc khoai tây. Tuy nhiên, việc sản xuất theo phương pháp này ở quy mô công nghiệp vẫn còn bị hạn chế bởi việc thiếu một phương pháp hiệu quả cho việc tổng hợp các dẫn xuất quinone, là chìa khóa trung gian của CoQ10. Do đó, phương pháp tổng hợp các dẫn xuất quinone một cách hiệu quả là rất cấp thiết. Terao và Fujita đã chứng minh một quy trình hiệu quả để tổng hợp dẫn xuất quinone. [30, 88]. Tuy nhiên quy trình tổng hợp phải trải qua nhiều bước phức tạp và tốn kém. Vì vậy, quá trình tổng hợp CoQ10 vẫn được cải tiến để ứng dụng trọng sản xuất công nghiệp. Min và cộng sự (2003) đã đề xuất một phương pháp hiệu quả hơn cho quá trình tổng hợp các chất trung gian quan trọng tổng hợp CoQ10 qua một loạt các phản ứng alkyl hóa Friedel-Crafts bằng cách gắn thêm các mạch (–R) bất kì vào các vòng thơm [61]. Tuy nhiên, thời gian phản ứng dài và hiệu suất thấp. Một số phương pháp mới để tổng hợp 4
CoQ10 như chloromethyl mạch vòng CoQo với các ion, tuy nhiên những phương pháp này vẫn không áp dụng được trong quy mô công nghiệp [13, 51, 76]. Mu và cộng sự (2011) đã tiến hành tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp hóa học một cách đơn giản và hiệu quả thông qua hợp chất (2'E) -1- (3-methyl-4-p-toluenesulfonyl-2- butene)-6-methyl-2 ,3,4,5-tetramethoxybenzene là tiền thân của vòng quinone. Hợp chất này là chất trung gian quan trọng để tổng hợp CoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi với các bromide solanesyl. CoQ10 được tổng hợp bắt đầu từ toluenesulfonyl p- (TsCl) với isoprene để có được (2E)-1-p-toluenesulfonyl-2-methyl-4-hydroxy-2-butene bằng cách kết hợp phương pháp este hóa và thủy phân. Tiếp theo với việc bổ sung 2,3,4,5- tetramethoxytoluene (TeMT), đã kết hợp 2 thành phần thành (2‟E)-1-(3-methyl-4-p- toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2,3,4,5 tetramethoxybenzene. Hợp chất này là chìa khóa quan trọng để tổng hợp CoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi với các bromide solanesyl [64]. Hình 1.3. Quá trình tổng hợp hợp chất trung gian quan trọng: để tổng hợp CoQ10 [64] (1): (2E)-1-p-Toluenesulfonyl-2-methyl-4-chloride-2-butene; (2): (2E)-1-p-Toluenesulfonyl-2- methyl-4-acetoxy-2-butene; (3): (2E)-1-p-Toluenesulfonyl-2-methyl-4-hydroxy-2-butene; (4): (2'E) -1- (3-methyl-4-p-toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2 ,3,4,5-tetramethoxybenzene. (a): isoprene, copper (I) chloride (CuCl), triethylamine hydrochloride (Et3N·HCl), 90°C, 75.9%; (b): NaOAc, glacial acetic acid, 120°C, 90.7%; (c): MeOH, 20% Na2CO3, 0°C, 68.8%; (d): 2,3,4,5-tetramethoxytoluene (TeMT), 1,2-dichloroethane, boron trifluoride etherate (BF3·OEt2), 80°C, 58.8%. 5
1.2.2. Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật CoQ10 hiện diện trong tự nhiên với số lượng nhỏ trong nhiều loại thực phẩm, nhưng mức độ đặc biệt cao trong các loại nội tạng như tim, gan, thận, cũng như thịt bò, dầu đậu nành. CoQ10 lần đầu tiên được phân lập từ tim bò bởi Frederick Crane (USA) năm 1957. Một số loài có chất béo như cá thu, cá trích là những nguồn tài nguyên có chứa hàm lượng dầu và CoQ10 cao trong mô cơ của chúng [24, 63, 81, 85]. Hàm lượng CoQ10 trong thịt là 8 - 200 μg/g, gia cầm 17 - 21 μg/g, cá 4 - 64 μg/g [24]. Ngoài ra CoQ10 cũng có trong trái cây, cây thuốc lá và rau nhưng với hàm lượng nhỏ [60, 95]. Mặc dù có thể thu nhận CoQ10 từ động vật và thực vật tuy nhiên nồng độ CoQ10 trong tế bào rất thấp không thể chiết tách ở quy mô công nghiệp do hiệu suất thấp và chi phí cao. Đây là lí do chính khiến cho các nghiên cứu về CoQ10 từ động vật và thực vật bị hạn chế. 1.2.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật 1.2.3.1. Coenzyme Q10 từ nấm men và nấm mốc Một số loại nấm men đã được nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp coenzyme Q10, một số giống có hàm lượng CoQ10 cao như Cyptococcus,Trichosporon, Dexomyces, Rhdoporium. Một số chủng vi sinh vật khác có sinh tổng hợp CoQ10 nhưng với hàm lượng thấp hơn như Bullera, Candida, Rhodoturola, Sporobolomyces, Utilago [2, 4]. Schizosaccharomyces pombe cũng là một hệ thống phổ biến để sản xuất protein và CoQ10 [15]. Saccharomyces cerevisiae cũng đã được nghiên cứu tối ưu quá trình sản xuất CoQ10 [66]. Trong một số loài nấm mốc như Neurospora crassa và Aspergillus fumigatus cũng sinh tổng hợp CoQ10 nhưng với hàm lượng thấp [45]. 1.2.3.2. Coenzyme Q10 từ vi khuẩn CoQ10 từ vi khuẩn đã được hai nhà khoa học là Carr và Exell nghiên cứu từ năm 1965 [12]. Đặc biệt, các nghiên cứu chọn lọc các chủng dại sinh CoQ10 cao đã tìm được các loài A. tumefaciens [19], Rhodopseudomonas spheroids và P. denitrificans [54]. CoQ10 cũng được tìm thấy ở một số vi khuẩn quang hợp như R sphaeroides, R. sulfidophilus [91], Rhodospirillum rubrum [89]. Trong đó hàm lượng CoQ10 đạt cao nhất trong R. Rubrum đạt 10 mg/l. Ngoài ra CoQ10 cũng được thu nhận từ vi khuẩn Sphingomnas sp [106], Rhizobium radiobacter [84], P. dentrificans [99], P. seudomonas Các loài A. tumefaciens, R. sphaeroides, P. denitrificans đã được sử dụng cho sản xuất CoQ10 ở quy mô công nghiệp và đạt nồng độ từ 30 † 130 mg/l [34, 91]. 6
Trong số các chủng vi sinh vật thì vi khuẩn A. tumefaciens là một trong những vi khuẩn đang được sử dụng để sản xuất CoQ10 hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có hàm lượng CoQ10 tương đối cao so với các vi sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất ở quy mô công nghiệp [16, 33, 34]. 1.3. CON ĐƢỜNG TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ VI SINH VẬT Con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ vi sinh vật bao gồm 3 phần (Hình 1.4): tổng hợp mạch vòng quinonoid, tổng hợp mạch nhánh decaprenyl diphosphate, và biến đổi vòng quinonoid [18, 41, 58]. Sơ đồ chi tiết con đường sinh tổng hợp được trình bày ở phụ lục 8. Con đƣờng MEP Con đƣờng MVA Hình 1.4. Con đường trao đổi chất tổng hợp CoQ10 từ vi sinh vật [41]  Tổng hợp vòng quinonoid (A) Sự tạo thành 4-hydroxybenzoate (pHBA) từ chorismate là bước đầu tiên trong quá trình sinh tổng hợp CoQ10. Phản ứng này, được xúc tác bởi enzym chorismate pyruvatelyase được mã hóa bởi gen ubiC. Ở E. coli, pHBA, tiền chất của vòng quinonoid thu được tạo thành từ con đường shikimate, đây là con đường quan trọng để tổng hợp các axit amin thơm thông qua chorismate. pHBA được sử dụng cho quá trình prenyl hóa và biến đổi vòng. Ở động vật có vú, pHBA được tạo thành từ axit amin tyrosine do thiếu con đường shikimate. 7
Ở nấm men pHBA được tổng hợp trực tiếp từ chorismate giống với E. coli hoặc từ tyrosine giống với các vi sinh vật nhân chuẩn bậc cao [18, 41, 63].  Tổng hợp mạch nhánh (decaprenyl diphosphate) (B, C) Isopentenyl diphosphate (IPP) và đồng phân của nó dimethylallyl diphosphate (DMAPP) là một tiền chất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp CoQ10. Để tổng hợp IPP, có hai con đường: con đường mevalonate (MVA) (C) và con đường 2-C-methyl- D- erythritol 4-phosphate (MEP) (non-MVA) (B). Ở E. coli, tảo lục và có thể là hầu hết các vi khuẩn khác, IPP bắt đầu được tổng hợp từ con đường MEP theo một phản ứng tổng hợp khởi đầu giữa pyruvate và glyceraldehyde-3- phosphate (GA3P) để tạo ra IPP và DMAPP [25, 47]. Thực vật và Streptomycetes sử dụng cả 2 con đường MVA và MEP. Phản ứng đầu tiên của tổng hợp IPP của con đường MEP ở E. coli là hình thành 1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate (DXP) dưới sự xúc tác của gen dxs. DXP sau đó bị khử thành MEP dưới sự xúc tác của EXP reductoisomerase (DXR) được mã hóa bởi gen ispC (dxr). Sau đó MEP chuyển hóa thành IPP dưới sự xúc tác của các enzym được mã hóa bởi các gen ispD (ygbP), ispE (ychB), ispF (ygbB), ispG (gcpE), và ispH (lytB) trong các phản ứng tiếp và bị đồng phân hóa thành DMAPP bởi gen idi. Vi sinh vật nhân chuẩn như nấm mốc và nấm men không có con đường MEP nên tổng hợp IPP dựa vào con đường MVA[42]. Sinh tổng hợp IPP sử dụng con đường MVA bắt đầu với sự chuyển 3 phân tử của acetyl-CoA thành MVA thông qua acetoacetyl-CoA và HMG-CoA. MVA được chuyển thành MVA diphosphate bằng 2 quá trình phosphoryl hóa nhờ xúc tác bởi lần lượt 2 enzym MVA kinase và phospho-MVA kinase. Sau đó, MVA diphosphate trải qua quá trình dehydate hóa-decarboxyl hóa trong một phản ứng cần ATP, tạo ra IPP. Enzym IPP isomerase xúc tác quá trình đồng phân hóa của IPP thành DMAPP. Ở bước tiếp theo của con đường này, farnesyl diphosphate (FPP) synthase xúc tác sự bắt cặp 1‟-4 của IPP với DMAPP và geranyl diphosphate (GPP) dẫn đến sự hình thành lần lượt GPP và FPP. Sản phẩm này được kéo dài bởi decaprenyl diphosphate synthase (DPS) [41].  Biến đổi vòng quinonoid (D) Bước đầu tiên trong quá trình biến đổi vòng là pHBA bị prenyl hóa bởi một enzyme bám màng 4- hydroxybenzoate decaprenyltransferase, chuyển các loại decaprenyl diphosphate [6, 59]. Các phản ứng sau đó bao gồm 1 phản ứng decarboxyl hóa, 3 phản ứng hydroxyl hóa và 3 phản ứng methyl hóa xảy ra với các thứ tự khác nhau ở sinh vật nhân sơ 8
và sinh vật nhân chuẩn [58]. CoQ cuối cùng được tổng hợp là kết quả của các phản ứng biến đổi vòng. Ở nấm men, tiền chất chuỗi phụ được sử dụng cho prenyltransferase là hexaprenyl diphosphate. Sản phẩm của phản ứng này, 3-hexa prenyl pHBA, trải qua các phản ứng biến đổi vòng tiếp theo trong một thứ tự khác so với ở E. coli. Do đó, 3-hexa prenyl pHBA trải qua hydroxyl hóa, methyl hóa, và decarboxyl hóa thành 2-polprenyl-6- methoxyphenol. O-methylase được mã hóa bởi gen CoQ3 như UbiG chuyển 2-polyprenyl- 3-methyl-5-hydroxy-6-methoxy-1,4-benzoquinol thành ubiquinol. Ở con đường sinh tổng hợp CoQ này, pHBA:polyprenyl diphosphate transferase, chuyển chuỗi phụ isoprenoid thành khung quinone. pHBA:polyprenyl diphosphate transferase có tính đặc hiệu cơ chất rộng, và chiều dài của cơ chất isoprenoid không làm thay đổi hoạt tính chuyển đổi của nó. Chiều dài của chuỗi phụ không được xác định bởi tính đặc hiệu cơ chất của pHBA: polyprenyl diphosphate transferase, nhưng được xác định bởi tính chất của isoprenoids. Ở E. coli, quá trình prenyl hóa của pHBA thành 3-octaprenyl pHBA được xảy ra bởi enzym liên kết màng pHBA:octaprenyltransferase. Enzym này là không đặc hiệu và có thể sử dụng nhiều prenyl diphosphate như là các tiền chất chuỗi phụ. Enzym này cũng không có tính đặc hiệu đối với cơ chất thơm này. Chiều dài của chuỗi phụ prenyl là một hằng số đối với mỗi sinh vật, điều này được quyết định bởi sự sẵn có của prenyl diphosphate trong tế bào. 3-octaprenyl pHBA được decarboxyl hóa thành 2-octaprenylphenol bởi 3-octaprenyl pHBA decarboxylase. 2-octaprenylphenol này trải qua 3 phản ứng hydroxyl hóa và 3 phản ứng methyl hóa dẫn đến sự tạo thành ubiquinol và sau đó là CoQ10 [18, 41]. Bảng 1.1. Các gen mã hóa cho các enzyme xúc tác tới quá trình tổng hợp CoQ10 [41] Gen Enzym đƣợc mã hóa phbA Acetoacetyl-CoA thiolase (PhbA) mvS HMG-CoA synthase (MvaA) mvaA HMG-CoA reductase (MvaS) mvaK1 Mevalonate kinase (MvaK1) mvaK2 Phosphomevalonate kinase (MvaK2) mvaD Mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MvaD) dxs 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS) dxr 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) ispD 4-Diphosphocytidyl-2-C-Methyl-D-erythritol synthase (IspD) ispE 4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase (IspE) 9
ispF 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase ispG 4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate synthase ispH 4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate reductase idi Isopentenyl pyrophosphate isomerase (Idi) ispA Farnesyl diphosphate synthase (IspA) ispB Polyprenyl diphosphate synthase (IspB) – CoQ1 ddsA Decaprenyl diphosphate synthase (DdsA or DPS) – CoQ10 ubiA pHB-polyprenyltransferase (UbiA) – CoQ2 ubiG O-Methyltransferase (UbiG) – CoQ3 ubiE C-Methyltransferase (UbiE) – CoQ5 ubiH Monooxygenase (UbiH) – CoQ6 ubiF Monooxygenase (UbiF) – CoQ7 ubiB Monooxygenase (UbiB) 1.4. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A. TUMEFACIENS Để sử dụng CoQ10 có hiệu quả hơn cho những ứng dụng trong y học, mỹ phẩm và hiểu rõ hơn những đặc tính của CoQ10, việc sản xuất CoQ10 với chi phí thấp là một yêu cầu cần thiết. Giảm chi phí sản xuất CoQ10 bằng cách tối ưu trong quá trình lên men là các nghiên cứu cơ bản để ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. A. tumefaciens được coi là vi khuẩn sản sinh CoQ10 đạt hiệu quả cao [16, 31, 99]. Do đó, đã có rất nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn cacbon, nguồn nitơ và hàm lượng nitơ, pH và các điều kiện môi trường khác đến sự sản xuất CoQ10. 1.4.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon Nguồn cacbon cũng như nồng độ cacbon trong môi trường đóng vai trò quan trọng để sinh tổng hợp CoQ10. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon là đến khả năng sinh CoQ10 của A. tumefaciens, Ha và cộng sự (2007) đã nhận thấy rằng sucrose là nguồn cacbon có hiệu quả hơn so với fructose, glucose trong sản xuất CoQ10 của chủng đột biến A. tumefaciens KCCM 10413. Sản phẩm CoQ10 đạt cao nhất (89,5 mg/l) khi sucrose được sử dụng là nguồn cacbon [34]. Cheong (2008) cũng chứng minh sucrose là nguồn cacbon hiệu quả nhất trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens KCCM- 10554 tái tổ hợp hàm lượng CoQ10 thu được khi tiến hành lên men theo mẻ có bổ sung đường sucrose trong quá trình lên men tăng gấp 1,26 lần so với lên men theo mẻ gián đoạn 10
đạt 352 mg/l [16]. Gu và cộng sự (2006) khi tiến hành nghiên cứu động học quá trình lên men theo mẻ có bổ sung nguồn cacbon là 15% đường sucrose kết hợp với 33% mật đường mía của chủng A. tumefaciens ATCC4452 hàm lượng CoQ10 thu được đạt 71,5 mg/l sau 96 giờ nuôi cấy tăng gấp 3,5 lần so với lên men gián đoạn [31]. Nhiều công trình nghiên cứu cũng đã chứng minh đường sucrose là nguồn cacbon hiệu quả cho quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens [90, 99]. Sử dụng nồng độ cacbon cao trong môi trường lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ vi khuẩn có thể giúp cho sinh trưởng của vi khuẩn nhưng có thể hạn chế sự tổng hợp CoQ10 trong canh trường do nồng độ cơ chất cao làm tăng độ nhớt của dịch lên men, giảm hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường. Để khắc phục hiện tượng này, trong môi trường lên men có thể bổ sung nguồn sucrose ở nồng độ thấp rồi bổ sung dần trong quá trình lên men đảm bảo đồng thời hai quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp CoQ10. 1.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ và nồng độ nitơ Sinh tổng hợp CoQ10 không chỉ phụ thuộc vào nguồn nitơ mà còn phụ thuộc vào hàm lượng nitơ được sử dụng. Hiện nay trong lên men sinh tổng hợp CoQ10, ta có thể cung cấp nitơ bằng cách sử dụng nhiều loại nguyên liệu khác nhau. Có thể sử dụng nguồn nguyên liệu nitơ vô cơ hay hữu cơ. Các nguồn nitơ bao gồm cao ngô, cao nấm men, peptone, trypton, soytone, cao malt, (NH4)2SO4. Tuy nhiên trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens nguồn nitơ là cao ngô được đánh giá là có hiệu quả hơn cả. Ha và cộng sự (2007) khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ tới hàm lượng CoQ10 của chủng đột biến A. tumefaciens KCCM 10413 các nguồn nitơ được lựa chọn là (cao ngô, cao nấm men, peptone, cao malt, casein, troytone và soytone). Kết quả cho thấy vi khuẩn sử dụng cao ngô làm nguồn nitơ cho hàm lượng CoQ10 và sinh khối tế bào cao nhất lần lượt là (2,05 mg/ g sinh khối) và (41,8 g/l) so với các nguồn nitơ khác [16, 34]. Gu và cộng sự (2006) đã sử dụng nguồn nitơ là 4% cao ngô trong quá trình lên men chủng A. tumefaciens ATCC4452 hàm lượng CoQ10 thu được đạt 71,5 mg/l [31]. Cũng có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng cao ngô làm nguồn nitơ cho quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens [90, 99, 101]. Nguồn nitơ vô cơ như (NH4)2SO4 cũng được sử dụng trong nuôi cấy tổng hợp CoQ10. Một số các nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa các nguồn nitơ khác nhau trong sinh tổng hợp CoQ10. Ngoài các nguồn nitơ hữu cơ như cao nấm men, peptone, cao ngô thì (NH4)2SO4 cũng được sử dụng là nguồn nitơ vô cơ kết hợp cho sinh tổng hợp CoQ10. 11