Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường trên đối tượng cây Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng công nghệ gen thực vật

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:157

Thêm vào BST

Báo xấu

116
lượt xem 21
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu luận án: Thông qua công nghệ chuyển gen để nghiên cứu khả năng tăng cường tính chống chịu các điều kiện môi trường bất lợi trên đối tượng cây Xoan ta nhằm bổ sung thêm cơ sở khoa học và thực tiễn cho việc tạo giống cây trồng lâm nghiệp có khả năng chống chịu tốt với điều kiện môi trường bất lợi.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường trên đối tượng cây Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng công nghệ gen thực vật

1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Biến đổi khí hậu ngày càng diễn ra mạnh mẽ là nguyên nhân làm tăng những bất lợi từ môi trƣờng, ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nhiều loài cây trồng. Do sự thay đổi khí quyển với hiệu ứng nhà kính, nhiệt độ của khí quyển ấm dần lên, băng tan ở hai cực sẽ tạo sự ngập lụt ở các vùng đất thấp. Lũ lụt, hạn hán và sự xâm nhập mặn sẽ trở thành vấn đề lớn gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến phát triển nông lâm nghiệp. Để thích ứng với những biến đổi khí hậu và những hệ quả của chúng, chiến lƣợc chung của ngành nông lâm nghiệp là ƣu tiên tạo ra những giống cây trồng chống chịu đƣợc khô hạn, mặn, ngập úng, lạnh và chống chịu với đất có vấn đề nhƣ acid, thiếu lân, ngộ độc sắt, ngộ độc nhôm. Những tác động bất lợi từ môi trƣờng nhƣ khô hạn, đất nhiễm mặn, ngập úng, nhiệt độ cực đoan thƣờng làm mất cân bằng về áp suất thẩm thấu gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng của nhiều loài cây trồng (Linhui et al., 2012). Một trong những phản ứng thƣờng gặp nhất khi cây gặp các điều kiện bất lợi về nƣớc đó là tăng cƣờng tổng hợp và tích lũy các chất chuyển hóa nhƣ các loại đƣờng tan, axít amin, v.v. để tăng cƣờng áp suất thẩm thấu cho tế bào. Proline và glycine betaine đƣợc biết đến là một trong những chất đóng vài trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào khi thực vật sống trong các điều kiện bất lợi nhƣ khô hạn, mặn, lạnh (Sávio et al., 2012). Trong tế bào thực vật, glycine betaine (GB) đƣợc tổng hợp từ choline thông qua hai phản ứng liên tiếp đƣợc xúc tác bởi choline monooxygenase (CMO) và betain aldehyde dehydrogenase (BADH) (Rathinasbapathi et al., 1997). Cũng giống nhƣ thực vật bậc cao, ở vi khuẩn E. coli và ở một số động vật, con đƣờng sinh tổng hợp GB cũng trải qua hai bƣớc là khử choline thành betaine aldehyde và oxy hóa betaine aldehyde thành GB (Takabe et al., 1998). Ngƣợc lại, con đƣờng sinh tổng hợp GB ở vi khuẩn Arthrobacter globiformis và Arthrobacter panescens lại rất đơn giản, từ choline chuyển hóa thành sản phẩm trực tiếp là GB chỉ cần xúc tác bởi choline oxydase (COD) (Ikuta et al., 1977). Sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao có thể đƣợc thực hiện qua hai con đƣờng hoặc từ glutamate hoặc từ ornithine. Con đƣờng sinh tổng hợp proline từ glutamate đƣợc chứng minh đầu tiên ở vi khuẩn bởi Leisinger (Leisinger, 1987) và sau đó là ở nhiều loài sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn
2 khác nhau. Ở thực vật bậc cao, chu trình này chỉ đƣợc xác định sau khi các nhà khoa học thành công trong việc phân lập đƣợc đoạn cDNA của gen mã hóa cho enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) (Hu et al., 1992). P5CS là một enzyme giữ hai chức năng, thứ nhất enzyme hoạt hóa glutamate trở thành dạng hoạt động là glutamic semialdehyde và sau đó xúc tác cho phản ứng đóng vòng để tạo ra pyrroline-5-carboxylate. Dẫn xuất này sau đó sẽ bị khử bằng phản ứng xúc tác bởi enzyme pyrroline-5-carboxylate reductase để tạo proline. Từ những hiểu biết sâu sắc về con đƣờng sinh tổng hợp glycine betaine và proline ở sinh vật, cùng với sự phát triển mãnh mẽ của lĩnh vực công nghệ gen, đặc biệt là kỹ thuật tạo cây trồng biến đổi gen. Các nhà khoa học đã phân lập đƣợc các gen: codA (COD), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT, SDMT, P5CS và P5CR từ nhiều nguồn khác nhau, mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp GB và proline. Các gen này đã đƣợc thiết kế với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng, các loài cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trƣờng (Amudha & Balasubramani, 2011). Các kết quả công bố cho thấ y : Cây Arabidopsis thaliana chuyể n gen codA,COX, GSMT/SDMT tăng cƣờng khả năng chiụ la ̣nh , nhiê ̣t đô ̣ cao, chịu mă ̣n và băng giá (Ali et al., 1998a, 1998b; Hayashi et al., 1997, 1998; Sakamoto et al., 2000; Huang et al., 2000), cây cải be ̣ (Brassica juncea) chuyể n gen codA có khả năng chiụ mă ̣n tố t hơn cây đố i chƣ́ng (Waditee et al., 2005). Tƣơng tự, cây lúa (Oriza sativa) chuyển gen codA, betA,COX, CMO, cây cà chua, cây hồng, cây bạch đàn chuyể n gen codA cũng tăng cƣờng kh ả năng chiụ la ̣nh , hạn, mă ̣n và oxy hóa (Sakamoto et al., 1998, Takabe et al., 1998; Su et al., 2006; Shirasawa et al., 2006; Mohanty et al., 2002; Park et al., 2004, 2007a; Yu et al., 2009). Cây thuốc lá chuyển gen COX, betA, CMO, BADH (Lilius et al., 1996; Nuccio et al., 1998; Yang et al., 2008), cây cà rốt chuyển gen BADH (Kumar et al., 2004); cây bông và ngô chuyển gen betA (Lv et al., 2007; Quan et al., 2004a, 2004b) cũng đã đƣợc chứng minh là chống chịu tốt hơn với các điều kiện cực đoan của môi trƣờng. Kết quả nghiên cứu chuyển gen P5CS, P5CR,  -OAT tham gia sinh tổng hợp proline vào cây thuốc lá, lúa nƣớc, lúa mì, cà rốt, chanh, đậu tƣơng, Arabidopsis cho thấy cây chuyển gen chống chịu tốt hơn với điều kiện môi trƣờng sống bị mặn, hạn, oxy hóa, nhiệt cao và băng giá (Kavi Kishor et al., 1995; Zhu et al., 1998; Hong et al.,
3 2000; Anoop et al., 2003; Su & Wu, 2004; Sawahel & Hassan, 2002; Han & Hwang, 2003; Hur et al., 2004; Molinari et al., 2004; De Ronde et al., 2004). Việt Nam là một trong những quốc gia bị tác động mạnh mẽ của việc biến đổi khí hậu, do đó hạn hán và đất nhiễm mặn hoang hóa đang ngày một gia tăng, đây sẽ là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lƣợng cây trồng nông lâm nghiệp và thu hẹp diện tích đất canh tác. Vì vậy, viê ̣c triể n khai các nghiên cƣ́u nhằ m ta ̣o ra đƣơ ̣c các giố ng cây trồ ng nông lâm nghiệp có khả năng chố ng chiụ đƣơ ̣c các điề u kiê ̣n bấ t lơ ̣i của môi trƣờng nhƣng vẫn đảm bảo đƣơ ̣c năng suấ t và chấ t lƣơ ̣ng tố t đang là vấ n đề cấ p bách và cầ n thiế t nhấ t hiê ̣n nay. Trên thế giới, các nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi chủ yếu tập chung vào nhóm cây nông nghiệp, còn nhóm cây lâm nghiệp (cây gỗ) mới chỉ có một vài công trình công bố (Yu et al., 2009, Yu et al., 2010). Trong lâm nghiệp, cây dƣơng (Populus sp.) đƣợc sử dụng nhƣ là cây mô hình cho các nghiên cứu chuyển gen. Tuy nhiên, hạn chế duy nhất của loài cây này đó là khó sinh trƣởng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam. Vì vậy, việc tìm kiếm một loài cây dễ thích ứng và phổ biến ở Việt Nam để làm cây mô hình cho các nghiên cứu theo hƣớng quan tâm trên đối tƣợng cây lâm nghiệp trở nên rất cần thiết. Cây Xoan ta đƣợc đánh giá là một trong những cây trồng quan trọng trong chiến lƣợc phát triển lâm nghiệp ở nƣớc ta. Nó có mặt ở 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp, trong đó 3 vùng: Vùng Trung tâm, vùng Đồng bằng Sông Hồng và vùng Nam Trung bộ Xoan ta đứng đầu trong danh mục các cây trồng đƣợc ƣu tiên phát triển theo quyết định số 16/2005/QĐ-BNN ngày 15/03/2005 của Bộ trƣởng Bộ NN&PTNT. Hơn nữa, những kết quả nghiên cứu bƣớc đầu trong việc xây dựng phƣơng pháp chuyển gen ở đối tƣợng cây Xoan ta là rất có triển vọng (Bui Van Thang et al., 2007a; Nirsatmanto & Gyokusen, 2007; Ngo Van Thanh et al., 2010) cho phép các nhà khoa học có thể tiến hành các nghiên cứu cải thiện giống, đặc biệt là nâng cao tính chống chịu của loài cây này và có thể sử dụng nhƣ một loài cây mô hình cho các nghiên cứu chuyển gen vào cây lâm nghiệp ở Việt Nam. Xuấ t phát tƣ̀ nhƣ̃ng lý do nêu trên, chúng tôi đã tiế n hành thƣ̣c hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu tăng cƣờng khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng trên đối tƣợng cây Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng công nghệ gen thực vật”.
4 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2.1. Mục tiêu chung: Thông qua công nghệ chuyển gen để nghiên cứu khả năng tăng cƣờng tính chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi trên đối tƣợng cây Xoan ta nhằm bổ sung thêm cơ sở khoa học và thực tiễn cho việc tạo giống cây trồng lâm nghiệp có khả năng chống chịu tốt với điều kiện môi trƣờng bất lợi. 2.2. Mục tiêu cụ thể: (1) Xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta đạt hiệu suất cao để làm công cụ nghiên cứu; (2) Đánh giá đƣợc hoạt động của promoter rd29A cảm ứng hạn ở các dòng Xoan ta chuyển gen; (3) Đánh giá đƣợc khả năng chịu hạn của các dòng Xoan ta chuyển gen P5CS đột biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngƣợc (P5CSm); (4) Đánh giá đƣợc khả năng chịu hạn, mặn của các dòng thuốc lá và Xoan ta chuyển gen codA. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Xây dựng và tối ƣu hóa quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta thông qua Agrobacterium tumefaciens; (2) Tạo các dòng Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen rd29A::gus intron và đánh giá hoạt động của promoter rd29A điều khiển biểu hiện gen gus trong điều kiện bình thƣờng và xử lý hạn nhân tạo; (3) Tạo các dòng Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen rd29A:: P5CSm và đánh giá kiểu hình, đặc tính sinh lý, sinh hóa của cây chuyển gen trong điều kiện xử lý hạn nhân tạo;
5 (4) Tạo các dòng thuốc lá và Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen 35S::TP- codA/35S::codA và đánh giá kiểu hình, đặc tính sinh lý, sinh hóa của cây chuyển gen trong điều kiện xử lý hạn, mặn nhân tạo. 4. Đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta đạt hiệu suất cao thông qua Agrobacterium tumefaciens. Luận án là công trình đầu tiên tạo đƣợc các dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm/codA và chứng minh đƣợc khả năng tăng cƣờng tính chịu hạn và chịu mặn ở các dòng cây chuyển gen. Luận án cũng là công trình đầu tiên sử dụng gen codA đã đƣợc thích ứng mã di truyền ở thực vật để chuyển vào cây thuốc lá và cây Xoan ta, kết quả cho thấy cây chuyển gen sinh tổng hợp và tích lũy hàm lƣợng glycine betaine cao hơn rất nhiều lần so với các công trình công bố trƣớc đây. Luận án đã góp phần bổ sung thêm cơ sở lý luận và thực tiễn cho việc ứng dụng công nghệ chuyển gen trong tạo giống cây trồng nông lâm nghiệp nói chung và cây Xoan ta nói riêng chống chịu tốt với các điều kiện môi trƣờng bất lợi.
6 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÁC ĐỘNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG BẤT LỢI ĐẾN CÂY TRỒNG Thực vật có đặc điểm về trạng thái sống đặc thù, đó là bám trụ vào đất tại một chỗ, không di chuyển từ nơi sống này đến nơi sống khác trong suốt quá trình phát triển. Do đó, khác với động vật, thực vật thƣờng xuyên đối mặt trực tiếp với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tác động lên quá trình sinh trƣởng và phát triển. Những tác động bất lợi từ môi trƣờng có thể gây ra những biến đổi sinh lý, hóa sinh và hình thái; từ đó ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng cây trồng. 1.1.1. Tác hại của hạn đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lƣợng sản phẩm của cây trồng. Khi môi trƣờng hạn hán cây bị stress mất nƣớc dẫn đến nhiều hậu quả nghiêm trọng (Abdullah et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013): (i) Gây nên hiện tƣợng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo. Sự co nguyên sinh chất xảy ra khi tế bào bị stress nƣớc làm cho nƣớc trong tế bào thất thoát ra ngoài nên khối nguyên sinh chất của tế bào co lại, thể tích không bào bị thu hẹp. Khi cây sống trong môi trƣờng thiếu nƣớc kéo dài, tế bào mất nƣớc dẫn đến các mô trở nên mềm yếu và sự héo xảy ra. Mô thực vật bị héo tạm thời nhƣng cũng có thể vĩnh viễn nếu sự thiếu nƣớc xảy ra nghiêm trọng và trong thời gian dài. (ii) Môi trƣờng sống bị khô hạn cản trở sự vận chuyển nƣớc trong mạch gỗ. Khi thiếu nƣớc do khô hạn sự cung cấp nƣớc cho rễ không đủ trong đêm để thủy hóa các mô đã bị thiếu nƣớc ban ngày, dẫn đến các lông hút bị tổn thƣơng lớp ngoài vùng vỏ bị phủ chất sáp (suberin) làm giảm áp suất rễ nên ảnh hƣởng đến đẩy cột nƣớc lên cao trong mạch gỗ. Đặc biệt khi thiếu nƣớc sẽ hình thành nhiều bọt khí trong mạch gỗ dẫn đến phá vỡ tính liên tục của cột nƣớc nên cột nƣớc trong mạch gỗ không đƣợc đẩy lên liên tục. (iii) Hạn hán làm dày lớp cutin trên bề mặt lá làm giảm sự thoát hơi nƣớc qua biểu bì. (iv) Sự thiếu nƣớc làm giảm cƣờng độ quang hợp. Khi hàm lƣợng nƣớc
7 trong lá còn khoảng 40 -50% quang hợp của lá bị đình trệ. (v) Đặc biệt, hạn hán cản trở sự sinh trƣởng của cây trồng. Thiếu nƣớc ảnh hƣởng đến các hoạt động sinh lý, nhất là quang hợp nên làm giảm sinh trƣởng và năng suất cây trồng nghiêm trọng. 1.1.2. Tác hại của đất nhiễm mặn đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng Đất mặn là loại đất chứa hàm lƣợng muối cao (>0,2%) có nhiều ion độc. Nếu hàm lƣợng muối trong đất cao, áp suất thẩm thấu của dung dịch đất rất cao, có thể đạt 200 - 300 atm. Do đất nhiễm mặn có áp suất thẩm thấu cao nên cây không thể hút đƣợc nƣớc từ môi trƣờng gây nên hiện tƣợng hạn sinh lý. Cây bình thƣờng không thể sống trong môi trƣờng có áp suất thẩm thấu trên 40 atm. Ngoài ra, trong đất nhiễm mặn còn chứa nhiều ion độc. Các ion này cạnh tranh với chất dinh dƣỡng trong quá trình hút của rễ làm cho rễ khó hút chất dinh dƣỡng dẫn đến cây trồng sinh trƣởng chậm và giảm năng suất mạnh. Trong đất nhiễm mặn có các muối NaCl, Na2SO2, Na2SO4, Na2CO3, MgCl2,, v.v. các muối này có hàm lƣợng cao trong đất đều gây độc cho cây. Khi cây hút các ion độc vào trong tế bào sẽ gây ra rối loạn các quá trình trao đổi chất của tế bào. Các ion độc sẽ ức chế hoạt động của các enzyme, các chất điều hòa sinh trƣởng dẫn đến làm rối loạn các quá trình trao đổi chất và các hoạt động sinh lý bình thƣờng của tế bào. Các ion độc còn làm ảnh hƣởng bất lợi đến nguyên sinh chất, làm giảm mạnh độ nhớt, tính thấm của nguyên sinh chất làm cho tế bào mất chất dinh dƣỡng. Các hoạt động sinh lý của tế bào cũng bị ảnh hƣởng nghiêm trọng khi cây bị tác động của muối mặn. Quá trình quang hợp giảm mạnh do lá kém phát triển, sắc tố quang hợp ít do các chất độc ức chế quá trình tổng hợp các sắc tố quang hợp. Quá trình hô hấp tăng mạnh, các cơ chất bị phân hủy mạnh nhƣng hiệu quả tạo năng lƣợng thấp do phần lớn năng lƣợng của các quá trình dị hóa bị thải ra dƣới dạng nhiệt làm cho tế bào thiếu năng lƣợng ATP để duy trì các hoạt động bình thƣờng. Phân hủy mạnh, tổng hợp lại yếu nên không bù đủ lƣợng vật chất do hô hấp phân hủy, dẫn đến các chất dự trữ bị hao hụt mạnh, do đó cây không sinh trƣởng hoặc sinh trƣởng chậm, còi cọc và năng suất
8 thấp. Cây sẽ bị chết nếu bị tác động của môi trƣờng nhiễm mặn cao hay nhiễm mặn trong thời gian dài (Jouyban, 2012). 1.1.3. Tác hại của nhiệt độ cao đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng Thực vật là sinh vật biến nhiệt nên nhiệt độ môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn đến hoạt động sống của cây. Biên độ nhiệt độ sinh lý của cây khoảng 1 – 45oC. Stress nhiệt do nhiệt độ môi trƣờng xung quanh cao là một mối đe dọa nghiêm trọng đối với cây trồng sản xuất trên toàn thế giới (Hall, 2001; Harrison et al., 2011). Nhiệt độ cao gián đoạn hoặc liên tục là nguyên nhân gây ra một loạt thay đổi về hình thái giải phẫu, sinh lý và sinh hóa ở thực vật, ảnh hƣởng đến sự tăng trƣởng và phát triển của thực vật và có thể dẫn đến suy giảm sản lƣợng. Sự tiếp xúc của thực vật tới nhiệt độ cao, hạt giống có thể đẩy nhanh quá trình lão hóa, làm giảm sự đậu quả, trọng lƣợng hạt giống và làm giảm năng suất. Điều này là do thực vật có xu hƣớng chuyển hƣớng các nguồn năng lƣợng để chống lại stress do nhiệt và do đó hạn chế sinh trƣởng và sinh sản. Một ảnh hƣởng khác của stress do nhiệt cao cho nhiều loài thực vật là gây ra vô sinh khi nhiệt cao tác dụng ngay trƣớc hoặc trong khi nở hoa. Cây họ đậu đặc biệt nhạy cảm với stress do nhiệt ở giai đoạn nở hoa, chỉ có một vài ngày tiếp xúc với nhiệt độ cao (30 – 35oC) có thể gây ra tổn thất nặng cho năng suất thông qua giảm lƣợng hoa hoặc tình trạng không phát triển đầy đủ của vỏ quả. Ở nhiệt độ rất cao gây tổn thƣơng tế bào nghiêm trọng và thậm chí làm cho tế bào bị chết trong vòng vài phút, dẫn đến sự sụp đổ nhanh chóng của các tổ chức tế bào (Schoffl et al., 1999). Ở nhiệt độ cao vừa phải, tổn thƣơng hoặc chết chỉ có thể xảy ra sau khi tiếp xúc lâu dài. Tổn thƣơng trực tiếp do nhiệt độ cao bao gồm sự biến tính protein và sự kết tụ, tăng tính lƣu động của màng lipid. Tổn thƣơng gián tiếp hoặc tổn thƣơng nhiệt chậm hơn bao gồm bất hoạt các enzyme trong lục lạp và ty thể, ức chế tổng hợp protein, suy thoái protein và màng tế bào mất tính linh hoạt (Howarth, 2005).
9 Stress nhiệt cao cũng ảnh hƣởng đến tổ chức của các cấu trúc vi ống bằng cách chia tách và/hoặc kéo dài của chúng, hình thành các thể sao hình ống trong các tế bào phân bào và kéo dài của vi ống hạt vách. Tổn thƣơng này cuối cùng dẫn tới ức chế sự tăng trƣởng, giảm dòng ion, tạo ra hợp chất độc hại và các loại ôxy phản ứng (reactive oxygen species = ROS) gây độc cho tế bào (Howarth, 2005). Sinh trƣởng của cây trồng giảm sút là kết quả chính của việc cây sinh trƣởng trong điều kiện nhiệt độ cao. Nguyên nhân chủ yếu là do nhiệt độ cao làm giảm năng suất quang hợp, năng lƣợng tạo ra giảm sút nghiêm trọng. Có giả thiết cho rằng trong các phản ứng của pha sáng, nhiệt độ của lá tăng lên do việc tổng hợp ATP liên tục (bằng quá trình vận chuyển điện tử có tính chu trình) cho đến khi cân bằng với lƣợng ATP tiêu thụ (Bukhov et al., 1999). Trong các phản ứng pha tối của quá trình quang hợp, sự hoạt hóa Rubisco trong chu trình Calvin đã đƣợc xác định nhƣ là bƣớc trung gian, sự hoạt hóa này bị ức chế ở 35–40◦C dẫn đến việc giảm tiêu thụ CO2 và giảm tạo ra các carbohydrates (Dubey, 2005; Wahid et al., 2007). Trong ty thể, điều kiện bất lợi thông thƣờng sẽ là nguyên nhân phá hủy NAD+, ATP tiêu thụ vƣợt trội và việc hô hấp sẽ tăng lên. Việc phá vỡ NAD+ một phần do nguyên nhân của việc tăng cƣờng hoạt động của poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), chất sử dụng NAD+ nhƣ là cơ chất để tổng hợp ADP-ribose. Quá trình poly(ADP) ribosyl hóa này là quá trình điều hòa sau dịch mã của các protein nhân, là bƣớc đƣợc khởi đầu bởi sự oxi hóa và các dạng khác của việc phá hỏng DNA. Sự suy yếu gây ra bởi điều kiện bất lợi mang lại sự suy yếu của năng lƣợng khi mà các phân tử ATP đòi hỏi để tái tổng hợp NAD+ (Zidenga, 2005). Cuối cùng, có thể nói rằng việc chống chịu nhiệt độ của cây là một quá trình tiêu tốn nhiều năng lƣợng nội bào đáng kể để đối phó nhiệt độ cao. Nói chung các phản ứng đó làm suy yếu năng lƣợng và tăng cƣờng sản xuất ROS, rốt cuộc có thể gây chết tế bào, mô và cả cơ thể (De Block et al., 2005).
10 1.1.4. Tác hại của nhiệt độ thấp đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng Nhiệt độ thấp làm cho lá cây bị héo mặc dù môi trƣờng vẫn đủ nƣớc do nhiệt độ thấp ức chế sự hút nƣớc của hệ rễ và sự vận chuyển nƣớc của hệ mạch. Nhiệt độ thấp cũng gây ức chế quá trình quang hợp của lá, làm giảm hô hấp, ức chế các quá trình tổng hợp nhất là tổng hợp các phân tử protein do các enzyme hoạt động yếu. Ở nhiệt độ thấp làm cho màng nguyên sinh chất bị tổn thƣơng dẫn đến tăng tính ngoại thấm nên thất thoát chất dinh dƣỡng của tế bào ra bên ngoài. Nhiệt độ thấp ảnh hƣởng đến cấu trúc và chức năng của hệ rễ. Sự hút nƣớc và chất khoáng bị giảm mạnh làm cho cây thiếu nƣớc và chất dinh dƣỡng. Nhiệt độ thấp còn làm tổn hại màng lục lạp, ty thể dẫn đến ảnh hƣởng nghiêm trọng đến các quá trình sinh lý của cây nhƣ quá trình quang hợp, hô hấp. Nói chung nhiệt độ thấp làm giảm mạnh sinh trƣởng, năng suất và chất lƣợng sản phẩm của cây trồng (Gulzar et al., 2011). 1.1.5. Phản ứng của thực vật đối với các điều kiện môi trƣờng bất lợi Các yếu tố cực đoan nhƣ nhiệt độ cao, băng giá, ánh sáng, oxy hóa,v.v. thƣờng tác động lên lá. Hạn, úng và mặn muối thƣờng tác động lên bộ rễ. Các yếu tố cực đoan thƣờng gây ra diện rộng về các phản ứng của thực vật, từ việc thay đổi biểu hiện gen, trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi lớn liên quan đến tốc độ sinh trƣởng và năng suất cây trồng. Những biến đổi lớn liên quan đến mức độ sinh trƣởng và trao đổi chất khi gặp các yếu tố cực đoan của môi trƣờng sẽ làm thay đổi sự biểu hiện của gen. Điều đó bắt đầu từ việc nhận biết tín hiệu ở mức độ tế bào, lan truyền tín hiệu này trong tế bào và tiếp sau đó lan truyền khắp cơ thể sinh vật. Sự biểu hiện của các gen phản ứng đối với các yếu tố cực đoan thể hiện đầu tiên là ở mức độ tế bào, sau đó đến mức độ toàn bộ cơ thể, tiếp theo là sự thay đổi về hình thái, sinh trƣởng, phát triển và cuối cùng làm ảnh hƣởng đến khả năng tạo năng suất và chất lƣợng sản phẩm của cây trồng (Trần Thị Phƣơng Liên, 2010). Sự biểu hiện các gen phản ứng với các yếu tố cực đoan của môi trƣờng phụ thuộc vào khả năng nhận biết chúng. Bằng chứng là tăng cƣờng các chất điều khiển
11 những phản ứng của cây trồng đối với các yếu tố cực đoan nhƣ xuất hiện abscisic acid (ABA), jasmonic acid (JA), ethylene, sau đó xuất hiện các phản ứng thứ cấp nhƣ xuất hiện Ca2+ (Shinozaki et al., 2007). Mức độ biểu hiện của một số gen tăng hẳn lên, một số khác yếu hẳn đi. Điều hòa việc biểu hiện các gen này khi gặp các yếu tố cực đoan của môi trƣờng đã và đang đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ở các giai đoạn khác nhau: trƣớc khi phiên mã, sau phiên mã, dịch mã, sau dịch mã và từng bƣớc làm sáng tỏ dần cơ chế phân tử liên quan đến tích chống chịu các điều kiện cực đoạn của thực vật. Nhƣ vậy, khi gặp các yếu tố cực đoan đột ngột, thực vật phải điều chỉnh để thích ứng với sự thay đổi môi trƣờng sống nhằm kéo dài khả năng tồn tại, sinh trƣởng và phát triển. Phản ứng của thực vật khi gặp điều kiện nhƣ hạn, mặn, v.v. gây mất nƣớc tế bào, chúng thƣờng tăng cƣờng biểu hiện các gen liên quan đến tổng hợp các chất thứ cấp nhƣ các loại đƣờng tan, proline, glycine betaine, v.v. để tăng cƣờng áp suất thẩm thấu của tế bào (Khan et al., 2009; Szabados & Savoure´, 2009) hoặc biểu hiện các gen mã hóa cho các protein chịu hạn, mặn nhƣ protein LEA (Porcel et al., 2005). Đối với hiện tƣợng nhiệt độ cao, chúng sẽ tăng cƣờng mức độ biểu hiện các gen mã hóa cho các protein sốc nhiệt (Hsp – heat shock protein) (Simões-Araújo et al., 2003). Thời gian, mức độ khốc liệt của các yếu tố cực đoan ảnh hƣởng khác nhau đến khả năng phản ứng của cây trồng. Hiện tƣợng mất nƣớc cục bộ chỉ gây thiệt hại cho một nhóm nhỏ, nhƣng hạn hán, nhiễm mặn kéo dài sẽ gây thiệt hại cho nhiều loài cây trồng trên một vùng rộng lớn, ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng sản phẩm cây trồng (Trần Thị Phƣơng Liên, 2010). Ngoài ra, các cơ quan, các mô tế bào khác nhau sẽ phản ứng với các yếu tố cực đoan không giống nhau. Các loài thực vật khác nhau sẽ có khả năng chống chịu khác nhau với các yếu tố cực đoan của môi trƣờng phụ thuộc vào bản chất di truyền (hệ gen) của chúng. Vì vậy, khi đối mặt trực tiếp với các yếu tố bất lợi của môi trƣờng có loài cây có thể chống chịu đƣợc để tồn tại, sinh trƣởng và phát triển, có loài cây sẽ bị chết. Ngay trong cùng một loài cây, các cá thể khác nhau cũng có mức độ phản ứng khác nhau với yếu tố cực đoan của môi trƣờng (Buchanan et al., 2000).
12 1.2. TÍNH CHỐNG CHỊU VỚI CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG BẤT LỢI CỦA THỰC VẬT 1.2.1. Cơ chế chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi Điều kiện bất lợi từ môi trƣờng sống - stress (điều kiện bất lợi phi sinh học nhƣ mặn, hạn, lạnh, nhiệt độ cao, băng giá, v.v.) dẫn đến hàng loạt các thay đổi về hình thái, tính chất vật lý, hóa sinh, phân tử, điều đó ảnh hƣởng xấu đến sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Để đảm bảo tính toàn vẹn và sống còn, nhiều loài thực vật có các chiến lƣợc đối phó với những bất lợi phi sinh học khác nhau. Sự phản ứng của cơ thể sống với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào từng loài, kiểu gen, thời gian tác động và tính khốc liệt của yếu tố cực đoan, độ tuổi và giai đoạn phát triển, dạng đặc thù của các cơ quan hoặc tế bào và phần ngoại vi của chúng. Khi bị tác động bởi các yếu tố bất lợi của môi trƣờng, thực vật sẽ tạo ra một số chất kích thích, protein giải độc hoặc hoormon giúp chúng có khả năng thích ứng. Hiện nay, các nghiên cứu về cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng ở thực vật đang đƣợc tập trung vào hƣớng nghiên cứu làm tăng cƣờng các chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào khỏi sự mất cân bằng về nƣớc. Sự tăng cƣờng các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu đƣợc phát hiện trong nhiều trƣờng hợp môi trƣờng bất lợi nhƣ hạn hán, muối mặn và lạnh giá (Khan et al., 2009; Szabados & Savoure´, 2009). Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính rất quan trọng của tế bào khi bị mất nƣớc do lạnh, muối hoặc hạn. Những thực vật sống trong môi trƣờng thiếu nƣớc bị mất cân bằng về áp suất thẩm thấu trong tế bào đòi hỏi phải có khả năng chống chịu lại điều kiện khắc nghiệt đó. Một trong những phƣơng thức của thực vật chống lại sự mất cân bằng về áp suất thẩm thấu đó là dựa trên sự thay đổi trong chuyển hóa tế bào chất dẫn đến sự xuất hiện và tích lũy các chất hòa tan tƣơng tích, protein hoặc các axít amin đặc hiệu (Ashraf et al., 2009). Hiện tƣợng này xảy ra rất nhanh khi tế bào bị mất nƣớc. Sự tích lũy các chất này không làm ảnh hƣởng đến hoạt động bình thƣờng của các enzyme nội bào. Ngƣợc lại, sự tích lũy lƣợng lớn các chất hòa tan trong tế bào sẽ điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng tác động tổng thể mà chúng có khả năng giữ và lấy nƣớc vào tế bào. Ngoài ra, chúng có thể thay thế vị trí nƣớc nơi xảy ra các phản ứng hóa sinh, tƣơng tác với lipid hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng tế bào và các phức hệ protein. Về mặt hóa học, chúng thƣờng là những phân
13 tử trung hòa về điện, có kích thƣớc rất nhỏ, đóng vai trò quan trọng giúp các phân tử protein và màng tế bào chống lại sự biến tính dƣới tác động của các điều kiện bất lợi phi sinh học (Trần Thị Phƣơng Liên, 2010). Chất bảo vệ áp suất thẩm thấu hay các chất hòa tan tƣơng thích đƣợc chia làm 4 nhóm chất sau đây: (1) glycine betaine (là dẫn xuất methyl hóa nhóm nitơ của axít amin), (2) proline và ectoine (axít amin), (3) polyols và trehalose (là một hợp chất polyme không phải đƣờng) và (4) các loại đƣờng tan: glucose, sucrose, fructan, manitol và pinitol. Glycine betaine, proline và các nhóm đƣờng thực hiện chức năng nhƣ các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu và bảo vệ tế bào khỏi bị mất nƣớc. Quá trình này liên quan đến một số enzyme chức năng đã đƣợc phân lập và phân tích về mặt sinh hóa nhƣ các enzyme chủ chốt tham gia sinh tổng hợp và chuyển hóa các chất điều hòa áp suất thẩm thấu, các enzyme giải độc và các loại protease khác. Protein vận chuyển nƣớc qua màng, chất vận chuyển các đƣờng đơn, proline và glycine betaine đƣợc xem nhƣ có chức năng chuyển nƣớc, proline, glycine betaine, các chất đƣờng đơn qua màng nguyên sinh chất và màng không bào để điều chỉnh áp suất thẩm thấu khi gặp điều kiện môi trƣờng cực đoan. 1.2.2. Cơ chế phân tử liên quan đến tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi Dƣới tác động của yếu tố cực đoạn của môi trƣờng, đầu tiên tế bào thực vật sẽ nhận biết tín hiệu, cảm ứng với điều kiện môi trƣờng, tiếp đến tổng hợp các hormone nhƣ ABA, sau đó hoạt hóa các yếu tố phiên mã – TF (transcrition factor). Phần lớn các protein cảm ứng với ABA đƣợc xếp vào nhóm RAB. Tuy nhiên, có một số gen có thể biểu hiện trong điều kiện thiếu ABA. Đa số các gen cảm ứng điều kiện môi trƣờng bất lợi đều đáp ứng với xử lý ABA ngoại sinh, một số khác thì không (Ingram & Barttels, 1996; Shinozaki et al., 1997). Vì vậy, sự biểu hiện gen liên quan đến các đặc tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi không chỉ có các con đƣờng phụ thuộc ABA mà còn có cả các con đƣờng độc lập ABA (không phụ thuộc ABA). ABA là một hormone thực vật, điều chỉnh sự phát triển cây trồng, hạt giống ngủ, nảy mầm, phân chia tế bào và phản ứng của tế bào với các áp lực môi trƣờng nhƣ hạn hán, mặn muối, lạnh giá, các tác nhân gây bệnh và bức xạ UV (Ueno, 1998; Albinsky et al., 1999). ABA thƣờng thấy trong các loài thực vật bậc thấp và bậc cao. Con đƣờng sinh tổng hợp và dị hóa của ABA đã đƣợc làm sáng tỏ (Zeevaart, 1999). ABA hoạt động để thực hiện các thay đổi trên nhiều quá trình sinh lý, ví dụ nhƣ
14 nhanh chóng gây đóng các lỗ khí khổng bằng việc bơm các ion từ tế bào bảo vệ, do đó hạn chế sự mất nƣớc thông qua sự thoát hơi nƣớc (Hetherington et al., 1998; Assmann & Shimazaki, 1999) và bằng cách kích hoạt sự biểu hiện gen, đƣợc cho là để tái lập trình các tế bào để chống chịu đƣợc áp lực do mất nƣớc gây ra (Ingram & Bartels, 1996; Leung & Giraudat, 1998). Hạt trong giai đoạn phát triển, ABA đạt mức cao nhất trong giai đoạn phôi muộn khi các protein lƣu trữ và dự trữ dinh dƣỡng, sau đó giảm dần (Rock & Quatrano, 1995). Khi mô thực vật bị stress (hạn, mặn,v.v.), mức ABA tăng gấp nhiều, có thể đến 40 lần trong vài giờ và giảm dần sau khi đƣợc bù nƣớc (Zeevaart, 1999). Các bằng chứng hiện có cho thấy, quá trình này ít nhất là do sự điều khiển phiên mã của các gen sinh tổng hợp và dị hóa ABA (Cutler et al., 1997; Qin & Zeevaart, 1999). Khi gặp điều kiện cực đoan, các gen liên quan đến tính chống chịu thƣờng biểu hiện với tốc độ nhanh. Bởi vậy, vấn đề khởi động phiên mã cũng nhƣ cấu trúc của promoter và các protein tham gia vào điều khiển sự biểu hiện gen thông qua việc nhận biết và hoạt hóa quá trình khởi động đƣợc đặc biệt quan tâm. Trong quá trình này, có thể đồng thời tham gia của nhiều gen tổng hợp cùng một lúc nhiều loại protein điều hòa phiên mã cũng nhƣ các protein/enzyme liên quan đến tính chống chịu. Phần lớn các gen cảm ứng với điều kiện khô hạn đều cảm ứng với các điều kiện lạnh, mặn (điều kiện mất nƣớc sinh lý). Sự điều hòa biểu hiện gen đƣợc điều khiển ở nhiều bƣớc khác nhau, từ trƣớc phiên mã, sau phiên mã và dịch mã. Nhƣng nhìn chung, kiểu điều hòa cơ bản nhất là ở giai đoạn khởi đầu phiên mã. Gen đƣợc biểu hiện khi RNA-polymerase có thể liên kết vào vùng promoter (trình tự khởi động) của nó và tiến hành tổng hợp bản phiên mã mRNA chứa vùng mã hóa của gen. Mức độ biểu hiện của gen trong tế bào đƣợc xác định bằng mức gắn kết (ái lực) của RNA-polymerase và các yếu tố phiên mã với promoter. Promoter hay vùng gen khởi động là trình tự DNA rất cần thiết để biểu hiện gen. Phần lớn các gen đều đƣợc biểu hiện mạnh hay yếu dƣới sự điều khiển của các yếu tố phiên mã – TF (transcription factor). TF là các protein có khả năng nhận biết các trình tự cis đặc hiệu trên promoter và hoạt hóa sự phiên mã. Các đoạn trình tự cis – yếu tố cis còn đƣợc gọi là các yếu tố điều hòa (regulatory element). Yếu tố điều hòa phiên mã – TF có rất nhiều loại khác nhau thích hợp với nhiều loại đoạn trình tự cis, các nghiên cứu ở cây đậu tƣơng cho thấy có trên
15 1.200 loại TF đặc hiệu cho các loại mô và trong các điều kiện ngoại cảnh môi trƣờng khác nhau. Trong đó, biết đến có trên 180 loại TF đặc hiệu ở mô rễ liên quan đến tính chịu hạn, mặn, v.v.. Khoảng 5,9% hệ gen của cây Arabidopsis mã hóa cho trên 1.500 loại TF (Trần Thị Phƣơng Liên, 2010). Các protein tham gia điều khiển biểu hiện gen có thể có chức năng trong việc phản ứng với các điều kiện cực đoan nhƣ là protein kinase và các TF. TF có các motif có khả năng gắn với trình tự DNA nhƣ bZIP (ABI5, ABF và ABREB), MYB, MYC, CBF4, DREB2, v.v. (Choi, 2000). Các yếu tố cực đoan của môi trƣờng tác động lên các TF, tiếp theo các TF hoạt hóa khả năng phát hiện và gắn với trình tự cis trên promoter của gen tạo thành đƣờng truyền tín hiệu phức tạp. Từ sự nhận biết, cảm ứng với điều kiện môi trƣờng đến việc tổng hợp hormone nhƣ ABA, sau đó hoạt hóa các TF. Phần lớn các protein cảm ứng với ABA đƣợc xếp vào nhóm RAB (Choi, 2000). Tuy nhiên, có một số gen có thể biểu hiện trong điều kiện thiếu ABA. Phụ thuộc vào phản ứng với ABA, những yếu tố điều hòa trên promoter có thể chia thành 2 loại (hình 1.1): Các yếu tố điều hòa phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA (Shinozaki et al., 2007). Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế biểu hiện gen khi thực vật bị tác động bởi điều kiện môi trƣờng bất lợi (Shinozaki et al., 2007).
16 1.2.3. Vai trò của proline và con đƣờng sinh tổng hợp proline ở thực vật 1.2.3.1. Proline đối với tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi ở thực vật Proline là một trong những axít amin đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất đối với tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi ở thực vật. Ở nhiều loài thực vật khác nhau hàm lƣợng proline tăng lên rất cao khi gặp các điều kiện môi trƣờng bất lợi nhƣ hạn, mặn, lạnh, nóng, nồng độ chất kim loại cao, nhiễm các loại bệnh, thiếu dinh dƣỡng và bị chiếu tia tử ngoại (Hare & Cress, 1997; Saradhi et al., 1995; Siripornadulsi et al., 2002). Mức độ tích lũy proline ở các loài thực vật khác nhau là khác nhau và có thể cao hơn 100 lần so với cây sống trong điều kiện bình thƣờng. Chính vì vậy, sự tích lũy proline đƣợc khẳng định là có vai trò rất quan trọng trong các cơ chế chống chịu với các điều kiện môi trƣờng bất lợi của thực vật. Proline đƣợc cho là phản ứng nhƣ một loại chất trao đổi thích ứng và là chất để cây dự trữ nguồn carbon và nitơ (Hare & Cress, 1997). Proline còn là một chất có chức năng khử các gốc oxy phản ứng sinh ra trong tế bào khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi oxy hóa (oxidative stress) (Smirnoff & Cumbes, 1989). Ngoài ra, proline cũng giữ chức năng trong quá trình ổn định các cấu trúc protein và tạo ra trạng thái cân bằng pH và oxy hóa khử của tế bào. Với những chức năng của proline nêu trên, nó đƣợc xem là tham gia vào cơ chế truyền tín hiệu của tế bào trong các đáp ứng thích ứng (Maggio et al., 2002). Ngoài những chức năng nêu trên, proline còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây trồng mặc dù proline không phải là một trong những axít amin không thay thế. Sự tích lũy proline đƣợc xác nhận ở các loại mô và cơ quan sinh sản của khá nhiều loài cây, bởi vậy proline còn có vai trò trong quá trình phát triển các loại cơ quan sinh sản ở thực vật. Hai quá trình phát triển đã đƣợc chứng minh đó là proline tham gia vào quá trình kéo dài cuống hoa và thời gian nở hoa (Mattioli et al., 2009). Proline đƣợc xem là một chất thẩm thấu có vai trò bảo vệ các cấu trúc nội bào và các đại phân tử (DNA, protein) khi tế bào bị tác động bởi các điều kiện bất
17 lợi về áp suất thẩm thấu (Szabados & Savoure, 2009). Tuy nhiên, sự tích lũy proline trong tế bào có thể ảnh hƣởng đến khă năng chống chịu của cơ thể thực vật theo nhiều con đƣờng khác nhau. Hình 1.2 khái quát về vai trò của proline đối với đặc tính chống chịu ở thực vật. Hình 1.2: Vai trò của proline ở thực vât (Szabados & Savoure, 2009) Vai trò của proline nhƣ là một chất định hình phân tử trong việc bảo vệ các cấu trúc protein và nâng cao hoạt tính xúc tác của nhiều loại enzyme khác nhau. Nhƣ là, proline có vai trò ổn định hoạt tính của enzyme M4 lactate dehydrogenase khi tế bào bị các tác động bất lợi về nhiệt độ; Proline bảo vệ enzyme nitrate reductase khi tế bào bị các tác động bất lợi về áp suất thẩm thấu và kim loại nặng; Proline cũng có vai trò ổn định hoạt tính của enzyme ribonuclease và protease trong điều kiện tế bào bị tác động bởi nồng độ arsen bên ngoài môi trƣờng tăng cao (Sharma & Dubey, 2005; Mishra & Dubey, 2006). Một số các công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng proline có vai trò nhƣ một chất chống oxy hóa, với chức năng phân cắt các gốc oxy phản ứng và làm bất hoạt các gốc oxy tự do (Matysik et al., 2002). Khi nuôi tế bào nấm men trên môi trƣờng bổ sung proline cho thấy rằng nồng độ các gốc oxy phản ứng giảm mạnh, nên làm chậm quá trình gây chết theo chƣơng trình định sẵn của tế bào (Chen & Dickman, 2005). Proline có thể bảo vệ các tế bào ngƣời chống lại stress oxy hóa gây ung thƣ (Krishnan et
18 al., 2008) và đối với các tế bào tảo nuôi cấy ở các điều kiện có nồng độ kim loại nặng cao thì proline có thể làm giảm quá trình phân giải các hợp chất béo (Mehta & Gaur, 1999). Nghiên cứu ở cây lúa cho thấy proline có vai trò làm giảm độc tính của thủy ngân thông qua quá trình phân cắt các gốc oxy phản ứng nhƣ hydroperoxide (Wang et al., 2009). Khi nghiên cứu trên hệ màng thylakoid cũng nhận thấy rằng proline có vai trò ức chế hiệu ứng phá hủy của các gốc oxy tự do tới bộ máy quang hợp II (Alia & Mohanty, 1997). Tác động tiêu cực của tia phóng xạ đến các tế bào tảo và cây thuốc lá chuyển gen P5CS tăng cƣờng sinh tổng hợp và tích lũy proline cũng bị giảm mạnh (Hong et al., 2000; Siripornadulsil et al., 2002). Mặc dù những dẫn chứng về vai trò bảo vệ và phân cắt các gốc oxy tự do trong tế bào của proline là khá đầy đủ, ngƣợc lại những bằng chứng về khả năng duy trình sự ổn định trạng thái cân bằng nội bào còn rất hạn chế. Sự tích lũy của các enzyme P5CS1 và P5CR trong lục lạp cho thấy, trong các điều kiện khắc nghiệt của môi trƣờng, quá trình sinh tổng hợp proline tăng lên ở lạp thể (Székely et al., 2008). Khi cây gặp các điều kiện bất lợi thì tốc độ chu trình Calvin giảm đi nhằm mục đích giảm thiểu quá trình oxy hóa NADPH và dự trữ NAPD+. Khi kết hợp với ánh sáng, dòng điện tử trong chuỗi vận chuyển điện tử bị ức chế bởi không đủ lƣợng NADP+, điều này dẫn đến sự tăng cƣờng sản xuất các gốc oxy tự do ở trung tâm hệ quang hợp I và tích lũy các gốc oxy phản ứng (ROS) (Chaves et al., 2009). Vì quá trình sinh tổng hợp proline là quá trình khử và cần có NADPH để khử glutamate thành P5C và từ P5C thành proline, nên quá trình này sẽ tạo ra nhiều phân tử NADP+. Bên cạnh đó, quá trình phosphoryl hóa glutamate thành glutamic semialdehyde tiêu thụ ATP và tạo ra ADP, các phân tử ADP này sau đó có thể làm cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp ATP thông qua quá trình quang hợp. Chính vì vậy nếu tăng cƣờng tốc độ sinh tổng hợp proline trong lục lạp khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi có thể giúp duy trì trạng thái cân bằng của NADPH:NADP+, do đó ổn định dòng điện tử, trạng thái oxy hóa khử và ngăn ngừa những hƣ tổn đến bộ máy quang hợp (Hare et al., 1997). Ở các dòng đậu tƣơng chuyển gen đối mã với P5CR cho thấy
19 khi ức chế quá trình sinh tổng hợp proline và phản ứng chuyển hóa NADPH - NADP+ thì các dòng chuyển gen này trở nên nhạy cảm hơn với các điều kiện hạn, nhƣng khi tăng cƣờng hoạt động của gen P5CR thì các dòng chuyển gen có tính kháng tốt hơn đối với hạn, kết quả này cho thấy khẳng định rằng quá trình sinh tổng hợp proline rất quan trọng đối với việc duy trì hàm lƣợng NADP+ ở trong tế bào khi cây gặp các điều kiện bất lợi (De Ronde et al., 2004). Trong ty thể, proline có những chức năng bảo vệ rất riêng biệt. Sau khi cây gặp phải các điều kiện môi trƣờng bất lợi, sự tích lũy proline cung cấp thế năng khử cho ty thể thông qua quá trình oxy hóa proline bởi 2 enzyme PDH và P5CDH, cung cấp điện tử cho chuỗi phản ứng hô hấp và do đó cung cấp năng lƣợng để cây phục hồi quá trình sinh trƣởng. Proline cũng giữ chức năng bảo vệ phức hệ phản ứng II của chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể trong điều kiện mặn và do đó ổn định các phản ứng hô hấp của ty thể. Những phát hiện gần đây về chu trình P5C-proline cho thấy trong một vài điều kiện đặc biệt chu trình này có thể cung cấp điện tử cho chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể mà không tạo ra glutamate. Quá trình dị hóa proline cũng còn đƣợc xem là nhân tố điều hòa quan trọng đối với trạng thái cân bằng các gốc oxy phản ứng của tế bào và có thể ảnh hƣởng đến nhiều quá trình điều hoàn khác của ty thể (Szabados & Savoure, 2009). Sinh tổng hợp và tích lũy proline đã đƣợc chứng minh rằng là có tính đặc hiệu cho mỗi loài. Tuy nhiên, liệu sự khác nhau này có liên quan đến tính thích ứng của mỗi loài hay không vẫn còn là câu hỏi đối với các nhà khoa học. Hai loài cây chịu mặn Thellungiella halophila và Lepidium crassifolium tích lũy proline nhiều hơn hẳn so với cây Arabidopsis ở trong điều kiện mặn, mặc dù chúng có họ hàng với nhau. Sự tích lũy proline ở cây Thellungiella halophila là kết quả của sự tăng cƣờng hoạt động của gen P5CS và giảm hoạt động của gen PDH (Taji et al., 2004). Nghiên cứu cho thấy rằng, ở loài cây ƣa mặn Pancratium maritimum có hàm lƣợng proline tích lũy cao trong tế bào đã cải thiện tính chịu mặn thông qua khả năng ổn định hoạt động của các enzyme khử độc, bộ máy vận chuyển protein và kích thích
20 sự tích lũy các protein có chức năng bảo vệ. Ở các loài cây ƣa mặn khác nhƣ Camphorosma annua và Limonium spp hàm lƣợng proline tích lũy không cao nhƣng thay vào đó ở các loài cây này lại tích lũy mạnh nhiều chất thẩm thấu khác nhƣ các loại carbohydrate hay các chất tổng hợp từ betain (Murakeözy et al., 2003). Các nghiên cứu này cho thấy rằng, sự tích lũy proline trong tế bào thƣờng đi kèm với những đặc tính chống chịu ở các loài cây bởi vậy có thể cho rằng quá trình tích lũy proline là để giúp cây tăng cƣờng tính chống chịu với điều kiện môi trƣờng bất lợi. Tuy nhiên, sự tích lũy proline không phải là một yếu tố quá cần thiết cho sự thích ứng của các loài thực vật khác nhau khi sống trong điều kiện môi trƣờng bất lợi (Szabados & Savoure, 2009). 1.2.3.2. Con đƣờng sinh tổng hợp proline ở thực vật Hình 1.3: Con đƣờng sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao (Delauney & Verma, 1993) Con đƣờng sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao có thể đƣợc thực hiện qua hai con đƣờng hoặc từ glutamate hoặc từ ornithine (hình 1.3). Proline đƣợc sinh tổng hợp từ tiền chất glutamate đƣợc coi là một trong những chu trình sinh tổng hợp quan trọng nhất của thực vật ở những điều kiện sinh lý nhất định, khi thực vật bị