Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:158

Thêm vào BST

Báo xấu

60
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án là tuyển chọn được chủng virus PRRS phân lập từ lợn mắc PRRS ở Việt Nam sử dụng làm giống gốc phục vụ sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS. Giống gốc là chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam, có tính đại diện cho các chủng virus đang lưu hành tại Việt Nam, có đặc tính sinh học và sinh học phân tử ổn định qua nhiều đời cấy chuyển, đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần khiết, có khả năng kích thích miễn dịch ở lợn để sản sinh kháng thể kháng virus PRRS tương ứng và có tương đồng kháng nguyên rộng rãi với các chủng thực địa. Sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ giống gốc PRRS đã được tuyển chọn đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ PHẠM VĂN SƠN NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ PHẠM VĂN SƠN NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên 2. TS. Nguyễn Văn Cảm HÀ NỘI, 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Phạm Văn Sơn i
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả: Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên và TS. Nguyễn Văn Cảm, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy mà luận án của tôi đã được hoàn thành. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Trân trọng cảm ơn nhóm các nhà Khoa học nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin vô hoạt phòng Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”. Thuộc chương trình KC-04 do PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên chủ nhiệm đã tạo điều kiện cho chúng tôi tham gia nhiều công đoạn nghiên cứu và cho phép tôi sử dụng một số kết quả nghiên cứu trong luận án này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và cơ quan mà tôi đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Phạm Văn Sơn ii
MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................................ iii Danh mục chữ viết tắt ..................................................................................................... vii Danh mục bảng ................................................................................................................ ix Danh mục hình ................................................................................................................. xi Trích yếu luận án ........................................................................................................... xiv Thesis abstract................................................................................................................ xvi Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................................ 2 1.2.1. Mục tiêu chung...................................................................................................... 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ...................................................................................................... 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 2 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 2 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................... 3 1.4. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................ 3 1.5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................. 3 1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài .................................................................................. 3 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài .................................................................................. 4 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 5 2.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn .................................................................. 5 2.1.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới .............................................. 5 2.1.2. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam ............................................. 8 2.2. Căn bệnh ............................................................................................................. 14 2.2.1. Cấu trúc virus PRRS ........................................................................................... 14 2.2.2. Phân loại virus PRRS .......................................................................................... 17 2.2.3. Khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus PRRS......................................... 18 2.3. Truyền nhiễm học ............................................................................................... 19 2.3.1. Loài vật mắc bệnh ............................................................................................... 19 iii
2.3.2. Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây ..................................................... 19 2.3.3. Cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây và đáp ứng miễn dịch ...................... 20 2.4. Triệu chứng và bệnh tích .................................................................................... 22 2.4.1. Triệu chứng lâm sàng .......................................................................................... 22 2.4.2. Bệnh tích ............................................................................................................. 23 2.5. Chẩn đoán và phòng trị bệnh .............................................................................. 24 2.5.1. Chẩn đoán ........................................................................................................... 24 2.5.2. Các biện pháp phòng trị bệnh ............................................................................. 25 2.6. Giống gốc trong sản xuất vacxin ........................................................................ 27 2.6.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 27 2.6.2. Cách chế tạo giống gốc ....................................................................................... 27 2.6.3. Cách quản lý giống gốc ....................................................................................... 27 2.6.4. Các phương pháp bảo quản giống gốc PRRSV trong phòng thí nghiệm............ 28 2.7. Nghiên cứu sản xuất vacxin phòng PRRS .......................................................... 30 2.7.1. Sản xuất vacxin bằng phương pháp vô hoạt virus .............................................. 30 2.7.2. Sản xuất vacxin bằng phương pháp nhược độc virus trên môi trườngtế bào............. 31 2.7.3. Phương pháp sản xuất vacxin thế hệ mới ........................................................... 32 Phần 3. Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................. 36 3.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................... 36 3.2. Thời gian nghiên cứu .......................................................................................... 36 3.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 36 3.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 36 3.4.1. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn ở những ổ dịch PRRS và thu thập mẫu ........... 36 3.4.2. Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRSV .............................................. 36 3.4.3. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS ............ 37 3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 37 3.5.1. Phương pháp mổ khám ....................................................................................... 37 3.5.2. Phương pháp RT - PCR ...................................................................................... 37 3.5.3. Phương pháp làm tiêu bản vi thể......................................................................... 40 3.5.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào .............................................................................. 41 3.5.5. Phương pháp nhân virus PRRS ........................................................................... 43 3.5.6. Phương pháp xác định hiệu giá virus .................................................................. 43 iv
3.5.7. Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus ........................................ 43 3.5.8. Phương pháp giải trình tự gen ............................................................................. 44 3.5.9. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein ..................... 45 3.5.10. Phương pháp gây tối miễn dịch trên chuột ......................................................... 45 3.5.11. Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh pha loãng) ............................................................................................................ 46 3.5.12. Phương pháp IPMA ............................................................................................ 47 3.5.13. Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống PRRS (master seed và working seed)... 48 3.5.14. Phương pháp kiểm tra thuần khiết của giống (master seed và workingseed) bằng kỹ thuật PCR/RT-PCR ............................................................................... 50 3.5.15. Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 trên hệ thống Bioreactor .................. 50 3.5.16. Phương pháp cô đặc virus PRRS bằng lọc tiếp tuyến ......................................... 50 3.5.17. Phương pháp vô hoạt virus ................................................................................. 51 3.5.18. Phương pháp kiểm tra sau vô hoạt ...................................................................... 51 3.5.19. Phương pháp nhũ hóa vacxin .............................................................................. 52 3.5.20. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của vacxin ....................................... 52 3.5.21. Kiểm tra chỉ tiêu an toàn ..................................................................................... 53 3.5.22. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin ............................................ 53 3.5.23. Phương pháp Realtime RT-PCR ......................................................................... 54 3.5.24. Phương pháp ELISA ........................................................................................... 55 3.5.25. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu .................................................................. 56 Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 57 4.1. Nghiên cứu một số biểu hiện bệnh lý của lợn mắc PRRS .................................. 57 4.1.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm .................................................................................... 57 4.1.2. Chẩn đoán PRRS bằng phương pháp RT-PCR ................................................... 58 4.1.3. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể ................................................................... 60 4.1.4. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể ..................................................................... 62 4.2. Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRS ..................................................... 65 4.2.1. Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 .................................. 65 4.2.2. Nghiên cứu sự ổn định một số đặc tính sinh học của các chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam ......................................................................................... 71 4.2.3. Đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus PRRS ........................................ 79 v
4.2.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus PRRS nghiên cứu ................................................................................................ 98 4.2.5. Sản xuất giống gốc ............................................................................................ 102 4.3. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS .......... 107 4.3.1. Nhân giống sản xuất (Working seed) vacxin .................................................... 107 4.3.2. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS ................................... 109 4.3.3. Nghiên cứu kiểm nghiệm vacxin vô hoạt PRRS............................................... 115 Phần 5. Kết luận và kiến nghị .................................................................................... 123 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 123 5.2. Kiến nghị........................................................................................................... 123 Danh mục công trình đã công bố có liên quan đến luận án .......................................... 124 Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 125 Phụ lục .......................................................................................................................... 137 vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ BEI Binary Ethylenimine CSF Classical swine fever CPE Cytophathogenic Effect DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EMCV Encephalomyocarditis virus ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum GP Glyco protein HE Haematoxylin – Eosin IFA Immunofluorescence assay IHC Immuno Histochemistry IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay KKT Kháng kháng thể MLV Modifier Live Vacine MOI Multiplicity Of Infection MSD Mystery Swine Disease NSP Non structural protein OD Optical Density OIE Office International des Epizooties ORF Open Reading Frame PAM Porcine Alveolar Macrophage PBS Photphat Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PCV2 Porcine circovirus type 2 PEDV Porcine epidemic diarrhea virus PEARS Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome vii
Từ viết tắt Viết đầy đủ PPV Porcine parvovirus PPLO Pleuropneumonia-like organism PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PRV Porcine Pseudorabies virus RNA Ribonucleic acid RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SIRD Swine Infertility and Respiratory Disease SIV Swine Influenza Virus S/P Sample/Positive SP Structural protein TAE Tris-acetate-EDTA TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TGE Transmissible gastroenteritis TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine TPB Triptose phosphas broth viii
DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Lịch sử phát hiện bệnh.......................................................................................... 6 2.2. Một số tên thường gặp trong các tài liệu .............................................................. 6 2.3. Protein cấu trúc của PRRSV................................................................................. 7 2.4. Tổng hợp các ổ dịch PRRS xảy ra ở Việt Nam từ 2007-2016 ........................... 10 2.5. Cấu trúc và chức năng protein phi cấu trúc ........................................................ 16 2.6. Các vacxin đã thử nghiệm sản xuất .................................................................... 33 3.1. Thành phần phản ứng RT – PCR........................................................................ 38 3.2. Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR: ....................................................... 38 3.3. Chu kỳ nhiệt trong máy PCR.............................................................................. 39 3.4. Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml .......................................................... 44 3.5. Chương trình chạy PCR giải trình tự .................................................................. 44 4.1. Số lượng mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được .............................................. 57 4.2. Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán PRRS..................................................... 59 4.3. Bệnh tích đại thể ở phổi lợn mắc PRRS ............................................................. 60 4.4. Bệnh tích đại thể ở một số khí quan khác của lợn mắc PRRS ........................... 60 4.5. Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch phổi và hạch amidan của lợn mắc PRRS ............ 62 4.6. Bệnh tích vi thể ở gan, lách và thận của lợn mắc PRRS .................................... 63 4.7. Bệnh tích vi thể ở tim, hạch ruột và ruột của lợn mắc PRRS ............................. 63 4.8. Kết quả phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 .................... 65 4.9. Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được ........ 66 4.10. Kết quả lựa chọn các chủng virus PRRS xác định hiệu giá ............................... 67 4.11. Kết quả xác định hiệu giá của các chủng PRRSV phân lập được ...................... 68 4.12. Các chủng virus PRRS được lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên ................ 69 4.13. Kết quả lựa chọn sơ bộ các chủng virus PRRS cho nghiên cứu ......................... 72 4.14. Khả năng gây bệnh tích tế bào theo thời gian của các chủng virus qua 5 đời cấy chuyển .................................................................................................... 73 4.15. Hiệu giá của các chủng virus PRRS nghiên cứu qua 5 đờicấy chuyển .............. 75 4.16. Kết quả lựa chọn chủng virus PRRS để nghiên cứu các đặc tính sinh học phân tử ................................................................................................................ 79 ix
4.17. Tương đồng nucleotide gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng tham chiếu ..................................................................................... 81 4.18. Tương đồng axit amin gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu......... 83 4.19. Tương đồng nucleotide gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng tham chiếu ............................................................................... 86 4.20. Tương đồng axit amin gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng tham chiếu ............................................................................... 88 4.21. Kết quả tinh chế kháng nguyên các chủng virus PRRS nghiên cứu................... 98 4.22. Kết quả của phản ứng IPMA kiểm tra kháng thể kháng PRRSV ở thời điểm 14 ngày sau khi tiêm kháng nguyên PRRS cho chuột ............................... 99 4.23. Kết quả phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV ......... 100 4.24. Phản ứng trung hòa xác định tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu..................................................................................... 101 4.25. Kết quả kiểm tra vô trùng của giống gốc PRRS ............................................... 103 4.26. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của giống gốc PRRS ............................. 104 4.27. Kết quả nhân giống sản xuất vacxin PRRS ...................................................... 108 4.28. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của các lô giống sản xuất ........................... 108 4.29. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của các lô giống sản xuất ...................... 109 4.30. Hiệu giá virus sau khi cô đặc bằng phương pháp lọc tiếptuyến ....................... 110 4.31. Kết quả xác định nồng độ formalin sử dụng vô hoạt virus vacxinPRRS ......... 110 4.32. Kết quả quá trình vô hoạt virus vacxin PRRS bằng Formalin ......................... 111 4.33. Lịch tiêm các loại vacxin vô hoạt cho các lô lợn thí nghiệm ........................... 112 4.34. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV của lợn sau khi tiêm vacxin sử dụng chất bổ trợ khácnhau ....................................................... 113 4.35. Kết quả sản xuất vacxin vô hoạtnhũ dầu PRRS ............................................... 115 4.36. Kết quả kiểm tra cảm quan các lô nhũ hoá ....................................................... 115 4.37. Kết quả kiểm tra vô trùng vacxin vô hoạt PRRS.............................................. 116 4.38. Kết quả kiểm tra thuần khiết vacxin vô hoạt PRRS ......................................... 116 4.39. Kết quả theo dõi chỉ tiêu an toàn của vacxin PRRS ở lợn thí nghiệm ............. 117 4.40. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp ELISA ................. 118 4.41. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp IPMA ................... 118 4.42. Kết quả đánh giá công cường độc .................................................................... 120 4.43. Phản ứng Realtime - PCR xác định virus trong máu của lợn sau công cường độc .... 121 x
DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Bản đồ dịch tễ phân bố của PRRS tại Việt Nam từ 2007-2010............................ 9 2.2. Bản đồ dịch tễ phân bố của PRRS tại Việt Nam từ 2011-2013.......................... 10 2.3. Cấu trúc virus PRRS ........................................................................................... 15 2.4. Cấu trúc genome virus PRRS ............................................................................. 16 2.5. Cây phả hệ của virus PRRS ................................................................................ 17 2.6. Gen từ các chủng virus khác nhau ...................................................................... 34 4.1. Tai sung huyết .................................................................................................... 58 4.2. Viêm mí mắt, có rử mắt ...................................................................................... 58 4.3. Ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn ........................................................................................ 58 4.4. Sảy thai ............................................................................................................... 58 4.5. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR .................................................... 59 4.6. Viêm phổi thùy ................................................................................................... 61 4.7. Hạch lympho sưng to .......................................................................................... 61 4.8. Thận xuất huyết .................................................................................................. 61 4.9. Lách nhồi huyết .................................................................................................. 61 4.10. Viêm phổi (HE×10) ............................................................................................ 64 4.11. Dịch tiết trong lòng phế nang (HE×40) ............................................................. 64 4.12. Gan sung huyết (HE×10) .................................................................................... 64 4.13. Gan thâm nhiễm tế bào viêm (HE×40)............................................................... 64 4.14. Đường biểu diễn quy luật nhân lên trên môi trường nuôi cấy của các chủng virus PRRS phân lập được ....................................................................... 70 4.15. Bệnh tích tế bào (CPE) do PRRS gây ra trên tế bào MARC-145ở các thời điểm khác nhau ................................................................................................... 74 4.16. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 010TB ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau ........................................................................................... 76 4.17. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 012NA ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau ........................................................................................... 77 4.18. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 049HY ở P0 và P5 tạicác thời điểm khác nhau ........................................................................................... 77 xi
4.19. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 052TH ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau ........................................................................................... 77 4.20. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 008HN ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau ........................................................................................... 78 4.21. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide của đoạn gen ORF5 nghiên cứu .......................................................................................................... 80 4.22. So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu .......................................................................................................... 80 4.23. So sánh trình tự axit amin gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu .......................................................................................................... 82 4.24. So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng tham chiếu ........................................................................ 85 4.25. So sánh trình tự axit amin gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu .......................................................................................................... 87 4.26. Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF5 .............................................................. 90 4.27. Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF7 .............................................................. 91 4.28. Kết quả điện di sản phẩm đoạn gen ORF5 và ORF7 sau 5 đời cấy chuyển của chủng KTY-PRRS-01 .................................................................................. 92 4.29. So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển .......................................................................................... 93 4.30. So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển .......................................................................................................... 94 4.31. So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-02 qua 5 đời cấy chuyển .......................................................................................... 94 4.32. So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của virus KTY-PRRS-02 qua 5 đời cấy chuyển .......................................................................................................... 95 4.33. So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-03 qua 5 đời cấy chuyển .......................................................................................... 96 4.34. So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của virus KTY-PRRS-03 qua 5 đời cấy chuyển .......................................................................................................... 97 4.35. Hình ảnh điện di kiểm tra tạp nhiễm của giống với virus CSF, PCV2, PPV ................................................................................................................... 105 xii
4.36. Hình ảnh điện di kiểm tra tạp nhiễm của giống với virus giả dại và Mycoplasma ...................................................................................................... 105 4.37. Hình ảnh điện di kiểm tra tạp nhiễm của giống với virus PED, TGE ............. 106 4.38. Tế bào MARC-145 âm tính với KT PRRSV .................................................... 119 4.39. Tế bào MARC-145 dương tính với KT PRRSV bằng kỹ thuật IPMA............. 119 4.40. Kết quả Realtime-PCRxác định virusPRRSV .................................................. 121 1. Môi trường dinh dưỡng trước khi kiểm tra vô trùng ........................................ 137 2. Môi trường dinh dưỡng sau khi kiểm tra vô trùng ........................................... 137 3. Môi trường dinh dưỡng sau khi kiểm tra vô trùng ........................................... 137 4. Giống sản xuất được lấy để kiểm tra vô trùng.................................................. 138 5. Kiểm tra vô trùng giống sản xuất trên thạch Macconkey ................................. 138 6. Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên thạch Sabouraud .................................... 138 7. Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên thạch Macconkey................................... 138 8. Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên Canh thang PPLO .................................. 138 9. Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên Thioglycollat ......................................... 138 10. Phổi lợn được tiêm vacxin vô hoạt PRRS sau công cường độc ....................... 139 11. Phổi lợn được tiêm vacxin vô hoạt sau công cường độc (10X) ....................... 139 12. Phổi lợn không tiêm vacxin sau công cường độc, viêm, xuất huyết .............. 139 13. Phổi lợn không tiêm vacxin sau công cường độc, viêm kẽ phổi (10X) ........... 139 14. Triệu chứng lâm sàng của lợn không tiêm vacxin sau công cường độc (tím tai) ............................................................................................................. 139 15. Bệnh tích đại thể của lợn không tiêm vacxin sau công cường độc (thận xuất huyết điểm) ............................................................................................... 139 xiii
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Phạm Văn Sơn Tên Luận án: “Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam”. Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn được chủng virus PRRS phân lập từ lợn mắc PRRS ở Việt Nam sử dụng làm giống gốc phục vụ sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS. Giống gốc là chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam, có tính đại diện cho các chủng virus đang lưu hành tại Việt Nam, có đặc tính sinh học và sinh học phân tử ổn định qua nhiều đời cấy chuyển, đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần khiết, có khả năng kích thích miễn dịch ở lợn để sản sinh kháng thể kháng virus PRRS tương ứng và có tương đồng kháng nguyên rộng rãi với các chủng thực địa. Sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ giống gốc PRRS đã được tuyển chọn đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực. Phương pháp nghiên cứu Để nghiên cứu các nội dung của đề tài, chúng tôi đã áp dụng các phương pháp nghiên cứu sau: những phương pháp thường quy để nghiên cứu virus như: nuôi cấy tế bào, xác định hiệu giá virus, xác định quy luật sinh trưởng của virus, gây tối miễn dịch, phương pháp trung hòa virus. Phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu virus như: giải trình tự gen. Phương pháp sản xuất vacxin vô hoạt trên môi trường tế bào như: nuôi cấy tế bào trên Bioreactor, vô hoạt virus. Phương pháp kiểm nghiệm vacxin vô hoạt PRRS như: kiểm tra vô trùng, thuần khiết, kiểm tra chỉ tiêu an toàn và hiệu lực. Kết quả chính và kết luận Đề tài đã thu thập mẫu từ 57 ca bệnh nghi mắc PRRS ở lợn được nuôi tại Việt Nam. Chẩn đoán được 33 ca bệnh dương tính với virus PRRS bằng kỹ thuật RT-PCR. Xác định các triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS chúng tôi thấy rằng các triệu chứng lâm sàng chủ yếu là sốt cao, bỏ ăn, thân ửng đỏ, tiêu chảy, tai xanh tím, chảy nước mũi, khó thở và rối loạn sinh sản ở lợn nái. Bệnh tích đại thể bao gồm các biến đổi chủ yếu ở phổi, hạch lympho với hiện tượng viêm, xuất huyết. Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch phổi rất rõ ràng, 100% các tiêu bản đọc thấy xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, các phế nang chứa đầy dịch rỉ viêm. xiv
Phân lập được 33 chủng virus PRRS từ lợn mắc PRRS tự nhiên ở Việt Nam. Các chủng virus này khả năng gây bệnh tích tế bào sau 48h đến 60h gây nhiễm và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 84h đến 108h. Các chủng virus phân lập có hiệu giá từ 1,44 x 102 đến 3,16 x 106 TCID50/ml. Xác định quy luật nhân lên của các chủng virus trên môi trường nuôi cấy thấy hiệu giá virus đạt cao nhất ở thời điểm 72h sau gây nhiễm. Qua khảo sát, sàng lọc các đặc tính sinh học lựa chọn được 10 chủng virus PRRS điển hình để nghiên cứu sự ổn định đặc tính sinh học qua 5 đời cấy chuyển. Kết quả nghiên cứu sự ổn định đặc tính sinh học lựa chọn được 03 chủng virus PRRS là KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02, KTY-PRRS- 03 để nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử và khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên lợn. Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch và tương đồng kháng nguyên của 3 chủng virus nghiên cứu thấy rằng lựa chọn chủng virus KTY-PRRS-01 là thích hợp nhất cho nghiên cứu tiếp để làm giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt PRRS. Chủng virus KTY-PRRS-01 có hiệu giá đạt 3,16x106TCID50/ml, có đặc điểm sinh trưởng ổn định trên môi trường tế bào MARC-145, sau 5 đời cấy chuyển đã ổn định về đặc tính sinh học và đặc tính sinh học phân tử của gen ORF5 và ORF7, có khả năng kích thích cơ thể lợn sản sinh kháng thể trung hòa cao. Giống gốc virus PRRS phục vụ sản xuất vacxin vô hoạt đạt chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết. Nhân được 3 lô giống, mỗi lô 1 lít bằng hệ thống Bioreactor, 100% các lô đạt giống tiêu chí vô trùng và thuần khiết. Cô đặc virus PRRS bằng hệ thống lọc tiếp tuyến thu được virus sau cô đặc đạt hiệu giá 4,0 x107 TCID50/ml phục vụ sản xuất vacxin. Virus vacxin được vô hoạt bằng formalin nồng độ 0,03% ủ trong thời gian 24 giờ và được trung hòa bằng L-glutamin 3%. Lựa chọn chất bổ trợ nhũ dầu (ISA740) bổ sung vào vacxin theo tỉ lệ 1:1. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm thành công 3 lô vacxin vô hoạt PRRS từ giống gốc KTY-PRRS-01. Mỗi liều vacxin chứa ít nhất 107TCID50 virus PRRS đã vô hoạt. Vacxin vô hoạt PRRS nghiên cứu sản xuất ra đạt các chỉ tiêu về vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực trong phòng thí nghiệm. xv
THESIS ABSTRACT PhD candidate: Pham Van Son Thesis title: Study on selected master seed virus and testing manufacture of inactivated vaccine for prevention of PRRS in pigs using virus strain isolated from pigs in Vietnam Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals Code: 9.64.01.02 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture Research Objectives PRRS virus strain isolated from infected pigs will have been selected as master virus seed for experimental manufacture of PPRS inactivated vaccine. Master virus seed was PRRS virus strain isolated from pigs in Vietnam that representative of existing virus in Vietnam with stable biological and molecular characteristic through many passages in culture reaching standard of purification and sterilization, having potential to stimulate immune system to produce antibodies against PRRS virus respectively and will have similar antigenicity to that of field virus isolates. Successful manufacture of PPRS inactivated vaccine from selected master virus seed will reach standard of sterilization, purification, safety and efficacy. Materials and Methods In order to perform the main content of the dissertation, we used the methods as follows: traditional methods for studying virus including cultures of viruses, determiation of virus titer in infected pigs in Vietnam. Determination of virus growth rules, virus neutralization test, biological molecules test in virus study including gene sequence, inducing immunity, methods for manufacture of inactivated vaccine in cells such as culture of cells on Bioreactor, inactivating virus, methods for testingPRRS inactivated vaccine includingsterilization, purìfication testing, and safety and efficacy testing. Main results and conclusions The study findingindicated that 57 suspicious PPRS infected cases were found, 33 cases positive with RT-PCR were diagnosed by using RT-PCR. Main clinical manifestation of PPRS infected Pigs included high fever, anorexiarash, diarrhea, blue ear, lesions in the lung, lymphadenitis with hemorrchage. Microscopic lesions mainly in xvi
the lung included swelling of lymph nodes in the lung. 100% of smear of the lung showed hemorrchage, infiltrated with inflamed cells. Alveoli were filled with exudate. 33 PRRS virus strains from PRRS infected pigs in Vietnam were isolated. These strains were capable of causing cellular lesions 48h - 60h after infection and the cells were completely destroyed from 84h - 108h after infection. The titer of strains isolated was from 1.44 x 102 to 3.16 x 106. Determination of the replication of virus strains on culture medium showed the highest viral titer at 72h post-infection. Through the investigation and screening of their biological characteristic, 10 typical PRRSV strains were selected in order to study stability of their biological characteristics through 5 passges to cell cultures. As the results of the study on the stability of biological characteristics, 3 PRRSV strains were selected including KTY-PRRS-01, KTY-PRRS- 02, KTY-PRRS-03 to study molecular biology and ability of Immune response of pigs From the results of testing immune respond and antigenic similarity of the 3 virus strains studied. It was found that KTY-PRRS 01 was the most appropriate for further study that can be used as master virus seed for manufacture of PRRS inactivated vaccine. KTY PRRS virus strain 01 had high titer reaching 3.16x106/ml that had stable growth on Marc 145 cell line medium. After 5 passages to cell cultures, their biological and molecular characteristics were stable, which were capable of stimulating pig to produce high neutralizing antibodies. PRRS master seed used for inactivated vaccines achieved criteria of sterility and purity. It was propagated in 3 batches of PRRS Master seed by using Bioreactor system. Each batch contained 1 liter of PRRS virus, 100% of Master seed batches met criteria of sterility and purity. PRRS virus was concentrated by using tangential filtration system. After being concentrated, the virus titer reached 4.0 x 107/ml that was used for vaccine production. Vaccines were inactivated by using 0.03% formalin, incubated for 24 hours and neutralized with 3% L-glutamine. Oil emulsion as vaccine adjuvant (ISA740) was added to viral vaccine at ratio 1:1 appropriate for manufacture of PRRS inactivated vaccine. Study on manufacture of 3 batches of PRRS inactivated vaccine from KTY- PRRS-01 isolated from PRRS high virulent virus strain in Vietnam used as master seed was sucessful. Each vaccine dose contained at least 107TCID50 inactivated PRRSV virus. Inactivated PRRS vaccine produced met criteria of sterility, purity, safety and efficacy in the laboratory. xvii
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) hay bệnh tai xanh được đặc trưng bởi những rối loạn sinh sản của lợn nái và những vấn đề về đường hô hấp ở lợn con và lợn trưởng thành (Meulenberg et al., 1993). Bệnh gây ra bởi virus PRRS, thuộc bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Cavanagh, 1997). Virus PRRS được nhóm thành hai kiểu gen, châu Âu (type 1) và Bắc Mỹ (type 2), các dấu hiệu lâm sàng của nhiễm trùng đều giống nhau, nhưng các chủng phân lập lại khác nhau về độc lực ở động vật nhiễm bệnh (Halbur et al., 1995b) và khác nhau về đặc tính kháng nguyên, di truyền (Meng, 2000; Nelsen et al., 1999; Nelson et al., 1993). Dịch PRRS xuất hiện ở hầu hết các khu vực chăn nuôi lợn quy mô lớn trên khắp thế giới. Tổn thất hàng năm cho ngành chăn nuôi lợn ở Hoa Kỳ do PRRSV gây ra ước tính khoảng 664 triệu USD (Holtkamp et al., 2013). Đối với lợn nái, bệnh gây hậu quả nghiêm trọng như: lợn con sơ sinh yếu ớt, giảm số con sơ sinh sống sót/ổ, tình trạng bệnh âm ỉ, rối loạn sinh sản, động dục kéo dài, chậm động dục trở lại. Đối với đực giống, số lượng tinh dịch giảm, chất lượng tinh dịch kém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con (Pejsak et al., 1997). Kháng thể kháng PRRSV lần đầu tiên được phát hiện ở Việt Nam năm 1997 trên một đàn lợn nhập từ Mỹ. Từ năm 2007 đến nay, PRRS liên tục xảy ra và bùng phát ở rộng khắp các tỉnh thành trong cả nước gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi. Tình hình PRRS ngày càng phức tạp đòi hỏi sự chủ động trong phòng chống dịch, trong đó phương pháp phòng PRRS hiệu quả nhất là sử dụng vacxin. Tuy nhiên chính sự đa dạng di truyền và thay đổi kháng nguyên của các chủng PRRSV là một trở ngại lớn trong việc phát triển một loại vacxin có hiệu quả để kiểm soát PRRS. Các vacxin sống đã được sử dụng phổ biến để kiểm soát PRRS vì chúng có khả năng bảo vệ tốt hơn so với vacxin đã vô hoạt hoặc các vacxin tái tổ hợp (Charerntantanakul, 2012; Hu and Zhang, 2014; Kim et al., 2011; Zuckermann et al., 2007). Nhưng ngày càng có nhiều quan ngại về sự an toàn của việc sử dụng vacxin sống vì sự hồi phục nhanh chóng độc lực của PRRSV trong quá trình sao chép ở lợn (Hu and Zhang, 2014; Mengeling et al., 2003; Pejsak et al., 1997). Vacxin vô hoạt có ưu điểm lớn nhất là an toàn do 1