Luận án tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:208

Thêm vào BST

Báo xấu

55
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl trên 90%: deacetyl chitin bằng NaOH 50% ở nhiệt độ phòng trong thời gian 120h và tỷ lệ dung dịch NaOH so với chitin 4/1. Chitosan sản xuất theo quy trình có độ deacetyl trên 93% và có chi phí nguyên vật liệu là 361.365 đ/kg

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------ VŨ THỊ HOAN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA - 2018
BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------ VŨ THỊ HOAN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 9540105 Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Trần Thị Luyến PGS. TS. Vũ Ngọc Bội KHÁNH HÒA - 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu được thực hiện từ kinh phí của Đề tài Cấp Nhà nước KC07.02/11-15:“Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm oligosaccharid (oligochitin và oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu thuỷ sản đánh bắt xa bờ” do PGS. TS. Vũ Ngọc Bội chủ trì và đã được Chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng trong Luận án. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nghiên cứu nào trước đó. Tác giả luận án
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án này, Trước hết, tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Lãnh đạo Khoa Sau đại học và Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm lòng biết ơn và niềm tự hào được học tập tại Trường trong những năm qua. Lòng biết ơn sâu sắc nhất xin được gửi tới GS. TS Trần Thị Luyến – nguyên Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Nha Trang và PGS. TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ, tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án này. Xin chân thành cám ơn PGS. TS. Vũ Ngọc Bội - Chủ nhiệm đề tài Cấp Nhà nước KC07.02/11-15: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm oligosaccharid (oligochitin và oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu thuỷ sản đánh bắt xa bờ” đã tạo điều kiện về kinh phí để Luận án hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đàm Sao Mai - Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh và các thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Xin chân thành cám ơn PGS. TS. Trang Sĩ Trung - Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang, PGS. TS. Nguyễn Anh Tuấn, TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo - Bộ môn Công nghệ Chế biến, TS. Nguyễn Thị Mỹ Hương - Trưởng Bộ môn Công nghệ Sau thu hoạch - Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang, PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và các thầy cô phản biện đã cho tôi lời khuyên quý báu để Luận án hoàn thành có chất lượng. Xin chân thành cám ơn các thầy cô giáo tại các phòng thí nghiệm - Trung tâm Thực hành Thí nghiệm và các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm -Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, động viên, cùng tôi chia sẻ khó khăn trong suốt thời gian thực hiện Luận án này.
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA: Phân tích phương sai (Analysis of variance) AOAC: Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống (Association of Official Analytical Chemists). BSA: Huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin) BHI: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật BHI (Brain Heart Infusion) COSY: Phổ tương quan giữa proton-proton (Correlation Spectroscopy) COS: Chitooligosaccharides CTS: Chitosan DA: Độ acetyl (Degree of Acetylation) DD: Độ deacetyl (Degree of Deacetylation) DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid GlcN: D-glucosamine GlcNAc: N-acetyl glucosamine GPC: Sắc ký gel thấm qua (Gel Permeation Chromatography) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HQKK: Hiệu quả khử khoáng HQKP: Hiệu quả khử protein HSQC: Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết (Heteronuclear Single Quantum Correlation) LMWC: Chitosan khối lượng phân tử thấp (Low Molecular Weight Chitosan) MHS: Phương trình Mark-Houwink-Sakurada MIC: Nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum Inhibitory Concentration) MRS: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật (de Man, Rogosa, Sharpe) Mw: Phân tử lượng trung bình khối lượng Mv: Phân tử lượng trung bình thể tích NAG: N- acetyl glucosamine NMR: Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) OD: Mật độ quang (Optical Density) Phổ IR: Quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
TCA: Trichloroacetic acid TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam X-ray: Tia X
MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................xii DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................xvii TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .......................................... xix MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 1.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẢN XUẤT CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN ..................... 3 1.1.1. Giới thiệu về chitin, chitosan và oligochitosan........................................................... 3 1.1.1.1. Chitin và chitosan .................................................................................................... 3 1.1.1.2. Oligochitosan ........................................................................................................... 5 1.1.2. Phương pháp sản xuất chitin và chitosan.................................................................... 6 1.1.3. Phương pháp sản xuất oligochitosan ........................................................................ 19 1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG OLIGOCHITOSAN .............................................. 30 1.3. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ BIẾN ĐỔI VÀ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN TÔM SAU THU HOẠCH.......................................................................................................................................... 32 1.3.1. Cơ sở lý thuyết về biến đổi của tôm sau thu hoạch .................................................. 32 1.3.2. Phương pháp bảo quản tôm sau thu hoạch ............................................................... 34 1.4. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT BỨC XẠ ............................................................................... 37 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 39 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ............................................................................................................ 39 2.1.1. Đầu vỏ tôm dùng sản xuất oligochitosan .................................................................. 39 2.1.2. Tôm bạc biển ............................................................................................................ 39 2.1.3. Enzyme protease ....................................................................................................... 39 2.1.4. Nguyên vật liệu để xác định độc chất học ................................................................ 39 2.1.5. Giống vi khuẩn ......................................................................................................... 40 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 40 2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................................. 40 2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa học ......................................................................... 46 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease ...................................................... 48 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn ........................................................................... 48 2.2.4.1. Phương pháp thu sinh khối vi khuẩn lactic........................................................... 48
2.2.4.2. Phương pháp phân tích vi sinh vật........................................................................ 49 2.2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan.................. 49 2.2.5. Phương pháp xác định độc chất học ......................................................................... 50 2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN ............ 51 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ...................................................................... 52 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................... 53 3.1. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CƠ BẢN CỦA PHẾ LIỆU ĐẦU VỎ TÔM ...... 53 3.2. NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ TẠP CHẤT Ở ĐẦU VỎ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TRONG SẢN XUẤT CHITIN .................... 53 3.2.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN TỪ ĐẦU VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME PROTEASE ..................................................................................................... 53 3.2.1.1. Nghiên cứu lựa chọn enzyme protease .................................................................. 53 3.2.1.2. Nghiên cứu khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm bằng NaOH loãng và khử khoáng bằng HCl loãng ................................................................................................................... 60 3.2.1.3. Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme khử protein..................................................................................................... 63 3.2.2. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN TỪ ĐẦU VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ CÁC TẠP CHẤT ................................ 65 3.2.2.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp ............................................................. 65 3.2.2.2. Nghiên cứu sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất ................................................ 70 3.2.2.3. Nghiên cứu khử protein còn lại ở bán chế phẩm chitin bằng enzyme flavourzyme ... 80 3.2.2.4. Nghiên cứu khử khoáng còn lại ở chitin thô bằng HCl ......................................... 82 3.2.2.5. Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất ...................................... 84 3.2.2.6. Đánh giá chất lượng chitin sản xuất theo quy trình sử vi khuẩn lactic để khử proteinvà các tạp chất ......................................................................................................... 86 3.3. NGHIÊN CỨU DEACETYL CHITIN ĐỂ SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO ......................................................................................................... 88 3.3.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ NAOH THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH DEACETYL CHITIN. 88 3.3.2. XÁC ĐỊNH THỜI GIAN DEACETYL .............................................................................. 89 3.3.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO ............ 93
3.4. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM OLIGOCHITOSAN BẰNG KỸ THUẬT BỨC XẠ COBAN 60 .................................................................................................... 97 3.4.1. XÁC ĐỊNH ĐỘ HÒA TAN CỦA CHITOSAN TRONG DUNG DỊCH ACID ............... 97 3.4.2. XÁC ĐỊNH LIỀU XẠ THÍCH HỢP CHO VIỆC CẮT MẠCH CHITOSAN TẠO OLIGOCHITOSAN ....................................................................................................................... 99 3.4.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN OLIGOCHITOSAN SAU KHI CHIẾU XẠ ................................ 102 3.4.4. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ SỬ DỤNG BỨC XẠ GAMMA CO-60 .................................................................. 103 3.4.5. NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA OLIGOCHITOSAN SẢN XUẤT BẰNG CÁCH SỬ DỤNG BỨC XẠ ĐỂ PHÂN CẮT CHITOSAN ................................................................................................................................. 105 3.4.5.1. Đánh giá thành phần các phân đoạn của chế phẩm chiếu xạ chitosan ................ 105 3.4.5.2. Sử dụng phổ FTIR để đánh giá cấu trúc của sản phẩm sau chiếu xạ chitosan ............. 106 3.4.5.3. Xác định khối lượng phân tử và cấu trúc của oligochitosan................................ 109 3.4.6. NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA OLIGOCHITOSAN 114 3.4.6.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp MIC... 114 3.4.6.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch ...................................................................................................... 115 3.4.7. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH HOÀN THIỆN SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG BỨC XẠ GAMMA COBAN 60................................................. 116 3.4.8. THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CỦA OLIGOCHITOSAN TRÊN CHUỘT LANG THÍ NGHIỆM ........................................................................................................................... 117 3.5. SỬ DỤNG OLIGOCHITOSAN TRONG BẢO QUẢN TÔM BẠC NGUYÊN LIỆU ..... 125 3.5.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ OLIGOCHITOSAN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN TÔM ................................................................................................................................ 125 3.5.2. XÁC ĐỊNH CHẾ ĐỘ BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU BẰNG OLIGOCHITOSAN 129 3.5.2.1. Xác định thời gian nhúng tôm nguyên liệu bằng dung dịch oligochitosan ......... 129 3.5.2.2. Xác định chế độ bao gói thích hợp để bảo quản tôm bạc bằng oligochitosan ..... 134 3.5.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH BẢO QUẢN TÔM BẰNG OLIGOCHITOSAN .................... 140 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN.......................................................................... 142 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 145
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin và chitosan ........................................................4 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của oligochitosan ...............................................................6 Hình 1.3. Phương trình phản ứng deacetyl chitin..........................................................13 Hình 1.4. Quy trình sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp hóa học.................16 Hình 1.5. Sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp sinh học ...............................17 Hình 1.6. Một số phương pháp tạo oligochitosan từ chitosan .......................................20 Hình 1.7. Quy trình sản xuất oligochitosan theo phương pháp hóa học .......................22 Hình 1.8. Sơ đồ thủy phân chitin và chitosan bằng enzyme .........................................23 Hình 1.9. Quá trình biến đổi của chitosan khi chiếu xạ ................................................26 Hình 1.10. Sơ đồ cơ chế bắt hydro của gốc tự do hydroxyl ..........................................26 Hình 1.11. Sự suy giảm khối lượng phân tử của chitosan được chiếu xạ tia gamma Co- 60 theo liều xạ................................................................................................................27 Hình 1.12. Cơ chế hình thành biến đen của tôm ...........................................................33 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ...........................................................................41 Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm khử protein và tạp chất ở đầu vỏ tôm bằng enzyme protease .42 Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm khử protein bằng lên men vi khuẩn lactic .........................43 Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm so sánh khả năng khử protein............................................43 Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm deacetyl chitin để thu nhận chitosan .................................44 Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp sử dụng bức xạ Co -60 ................................................................................................................45 Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm bảo quản tôm nguyên liệu .................................................45 Hình 2.8. Quy trình hoạt hóa vi khuẩn lactic ................................................................ 48 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm bằng phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme......................................................................................................63 Hình 3.2. Bán chế phẩm chitin sau khi khử protein bằng enzyme flavourzyme ..........65 Hình 3.3. Sản phẩm chitin sản xuất bằng phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme ....65 Hình 3.4. Sự thay đổi độ đục của dịch nuôi cấy vi khuẩn theo thời gian......................66 Hình 3.5. Dịch vi khuẩn L. plantarum sau 28 h nuôi cấy .............................................66 xii
Hình 3.6. Khuẩn lạc vi khuẩn L. plantarum mọc trên đĩa thạch ...................................66 Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch sinh khối vi khuẩn đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm .....................................................................................................................67 Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm .....68 Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH môi trường đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm .........69 Hình 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 bổ sung đến hiệu quả khử khoáng và protein đầu vỏ tôm .................................................................71 Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu quả khử khoáng và protein đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431........................................................72 Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường tới hiệu quả khử khoáng và protein đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 .............................................................73 Hình 3.13. Ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường bổ sung đến hiệu quả khử khoáng và protein đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431........................................................75 Hình 3.14. Đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và tỷ lệ dịch vi khuẩn đến hiệu quả khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum .......................................78 Hình 3.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và tỷ lệ dịch vi khuẩn đến hiệu quả khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum...........................................................................................78 Hình 3.16. Đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và thời gian lên men đến hiệu quả khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum ..........................................79 Hình 3.17. Ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và thời gian lên men đến hiệu quả khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum...........................................................................................79 Hình 3.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme flavourzyme bổ sung đến hàm lượng protein còn lại ở chitin thô .........................................................................................................81 Hình 3.19. Ảnh hưởng của thời gian khử protein bằng enzyme flavourzyme đến hàm lượng protein còn lại ở chitin thô ..................................................................................82 Hình 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hàm lượng khoáng còn lại ở chế phẩm chitin ......83 Hình 3.21. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử khoáng còn lại ở chitin thô bằng HCl ...84 Hình 3.22. Quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất .................................85 Hình 3.23. Chitin sản xuất theo quy trình khử protein chỉ bằng enzyme flavourzyme ...87 xiii
Hình 3.24. Chitin sản xuất theo quy trình khử protein và tạp chất bằng vi khuẩn lactic ........87 Hình 3.25. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến độ deacetyl của chitosan ....................88 Hình 3.26. Ảnh hưởng của thời gian xử lý NaOH đến độ deacetyl của chitosan .........89 Hình 3.27. Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH 50% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường............................................................................90 Hình 3.28. Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH 45% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường............................................................................90 Hình 3.29. Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH 40% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường............................................................................91 Hình 3.30. Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH 35% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường............................................................................91 Hình 3.31. Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH 30% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường............................................................................92 Hình 3.32. Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin trong 120 giờ bằng NaOH ở các nồng độ: a: NaOH 50%; b: NaOH 45%; c: NaOH 40%; d: NaOH 35%; e: NaOH 30% .......................................................................................................92 Hình 3.33. Phổ 1H-NMR chế phẩm chitosan thu được khi xử lý bằng NaOH nồng độ 50% trong 120 giờ .........................................................................................................93 Hình 3.34. Quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl trên 90% từ đầu vỏ tôm ..........94 Hình 3.35. Ảnh hưởng của các acid và nồng độ acid đến khả năng hòa tan của chitosan .......97 Hình 3.36. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến khả năng hòa tan của chitosan trong dung dịch CH3COOH 1% ..............................................................................................98 Hình 3.37. Ảnh hưởng của liều xạ đến độ nhớt của dung dịch chế phẩm sau chiếu xạ (chitosan dạng vẩy) ........................................................................................................99 Hình 3.38. Ảnh hưởng của liều xạ đến độ nhớt dung dịch chế phẩm sau chiếu xạ (chitosan dạng dung dịch) .............................................................................................99 Hình 3.39. Ảnh hưởng của liều xạ đến khối lượng phân tử chế phẩm sau chiếu xạ (chitosan dạng vẩy) ......................................................................................................100 Hình 3.40. Ảnh hưởng của liều xạ đến khối lượng phân tử chế phẩm sau chiếu xạ (chitosan dạng dung dịch) ...........................................................................................100 xiv
Hình 3.41. Hình ảnh về các phân đoạn oligochitosan với liều chiếu 50 kGy .............103 Hình 3.42. Quy trình sản xuất oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Coban-60...104 Hình 3.43. Phổ FTIR của chitosan ..............................................................................106 Hình 3.44. Phổ FTIR của oligochitosan phân đoạn 1 .................................................107 Hình 3.45. Phổ FTIR của oligochitosan phân đoạn 3 .................................................107 Hình 3.46. Phổ 1H-NMR chế phẩm oligochitosan phân đoạn 2..................................111 Hình 3.47. Phổ 13C-NMR ............................................................................................112 Hình 3.48. Phổ HSQC .................................................................................................112 Hình 3.49. Phổ COSY .................................................................................................113 Hình 3.50. Cấu trúc hóa học của oligochitosan ...........................................................113 Hình 3.51. Một số hình ảnh về khả năng ức chế vi khuẩn của oligochitosan .............116 Hình 3.52. Quy trình sản xuất oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Coban-60...117 Hình 3.53. Trọng lượng tươi trung bình của gan, lách, thận (chuột lang nhóm I) ......123 Hình 3.54. Trọng lượng tươi trung bình của gan, lách, thận (chuột lang nhóm II) ....123 Hình 3.55. Hình ảnh vi thể của gan, lách, thận chuột lang uống oligochitosan ..........124 Hình 3.56. Hình ảnh dạ dày chuột đối chứng (Bên ngoài bình thường, bên trong bình thường) ....124 Hình 3.57. Hình ảnh dạ dày chuột uống oligochitosan (Bên ngoài bình thường, bên trong bình thường) ................................................................................................................124 Hình 3.58. Ảnh hưởng của nồng độ oligochitosan đến chất lượng cảm quan của tôm .........126 Hình 3.59. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch oligochitosan đến hàm lượng NH3 trong tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh ............................................................127 Hình 3.60. Sự biến đổi hoạt tính chống oxy hóa tổng của tôm nguyên liệu được xử lý bằng oligochitosan ở các nồng độ, sau 6 ngày bảo quản.............................................128 Hình 3.61. Sự biến đổi pH của tôm được xử lý bằng oligochitosan ở các nồng độ, sau 6 ngày bảo quản ..............................................................................................................129 Hình 3.62. Ảnh hưởng của thời gian nhúng đến chất lượng cảm quan tôm bảo quản bằng oligochitosan 1% .........................................................................................................130 Hình 3.63. Ảnh hưởng của thời gian nhúng oligochitosan đến sự biến đổi hàm lượng NH3 của tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản ở 0-4oC.........................................131 xv
Hình 3.64. Ảnh hưởng của thời gian nhúng oligochitosan đến sự biến đổi hoạt tính chống oxy hóa của tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản ở 0 – 4oC ................................133 Hình 3.65. Ảnh hưởng của thời gian nhúng oligochitosan đến sự biến đổi pH của tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản ở 0 – 4oC............................................................134 Hình 3.66. Ảnh hưởng của chế độ bao gói đến các tổng điểm cảm quan chung của tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh ....................................................................135 Hình 3.67. Ảnh hưởng của chế độ bao gói đến sự biến đổi hàm lượng NH3 của tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh ....................................................................136 Hình 3.68. Ảnh hưởng của chế độ bao gói đến sự biến đổi hoạt tính chống oxy hóa của tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh ............................................................137 Hình 3.69. Ảnh hưởng chế độ bao gói đến sự biến đổi pH của tôm theo thời gian bảo quản ở 0 – 4oC .............................................................................................................138 Hình 3.70. Sự thay đổi tổng số vi sinh vật hiếu khí trên tôm sau 6 ngày bảo quản nếu bảo quản có và không có oligochitosan bề mặt ...........................................................140 Hình 3.71. Sơ đồ quy trình bảo quản tôm nguyên liệu bằng oligochitosan ................141 xvi
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Hàm lượng chitin và canxi carbonat trong một số loại tôm............................3 Bảng 1.2. Điều kiện khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguồn phế liệu tôm ..7 Bảng 1.3. Các điều kiện để khử khoáng trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm ..10 Bảng 1.4. Điều kiện tẩy màu chitin từ phế liệu tôm thẻ ................................................12 Bảng 1.5. Điều kiện deacetyl thường dùng đối với chitin từ phế liệu tôm ..................14 Bảng 2.1. Thiết kế nghiên cứu độc tính của oligochitosan ...........................................50 Bảng 2.2. Các tiêu chí đánh giá kết quả trong nghiên cứu độc tính ..............................51 Bảng 3.1. Thành phần hoá học cơ bản của phế liệu tôm thẻ .........................................53 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của enzyme và tỷ lệ enzyme đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm ..54 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của enzyme và pH đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm thẻ chân trắng 56 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của enzyme và nhiệt độ đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm .57 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của enzyme và thời gian đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm 59 Bảng 3.6. Chất lượng của chitinsản xuất theo quy trình sử dụng enzyme protease để khử protein ...60 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH và thời gian xử lý đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm .............................................................................................................61 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ acid HCl và thời gian xử lý đến hàm lượng khoáng còn lại ở đầu vỏ tôm ......................................................................................................62 Bảng 3.9. Chất lượng cơ bản của chitin thu được theo quy trình kết hợp sử dụng enzyme flavourzyme ...................................................................................................................64 Bảng 3.10. Quy hoạch thực nghiệm 3 yếu tố theo mô hình Box - Behnken .................75 Bảng 3.11. Bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với biến ảo của quá trình lên men khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B431 .........................................76 Bảng 3.12. Quy hoạch thực nghiệm với biến thật của quá trình lên men khử protein đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum ..............................................................................77 Bảng 3.13. Tiên đoán một số thí nghiệm tối ưu cho quá trình lên men ........................79 Bảng 3.14. Kết quả tối ưu theo tiên đoán và kết quả thực nghiệm kiểm chứng số liệu tối ưu hóa ............................................................................................................................80 Bảng 3.15. So sánh chất lượng chitin sản xuất theo các quy trình đã nghiên cứu và quy xvii
trình tham khảo ..............................................................................................................86 Bảng 3.16. So sánh đánh giá chất lượng chitosan sản xuất theo quy trình đã đề xuất và quy trình tham khảo .......................................................................................................96 Bảng 3.17. Kết quả tách phân đoạn chế phẩm oligochitosan sau chiếu xạ .................102 Bảng 3.18. Kết quả tách phân đoạn chế phẩm chitosan sau chiếu xạ .........................105 Bảng 3.19. Đặc trưng nhóm chức của các mẫu chitin, chitosan và phân đoạn oligochitosan ................................................................................................................108 Bảng 3.20. Kết quả xác định phổ sắc ký gel thấm qua (GPC) chế phẩm chitosan chiếu xạ với liều xạ khác nhau ..............................................................................................109 Bảng 3.21. Kết quả xác định nồng độ pha loãng thấp nhất ức chế vi khuẩn phát triển.... 114 Bảng 3.22. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn trên đĩa thạch ............................115 Bảng 3.23. Trọng lượng trung bình của chuột lang nhóm I (đánh giá độc tính cấp) ..118 Bảng 3.24. Trọng lượng trung bình của chuột lang nhóm II (giai đoạn hồi phục) .....118 Bảng 3.25. Kết quả sinh hóa nước tiểu của chuột lang nhóm I ...................................119 Bảng 3.26. Kết quả sinh hóa nước tiểu của chuột lang nhóm II .................................120 Bảng 3.27. Kết quả sinh hóa huyết học của chuột lang nhóm I ..................................121 Bảng 3.28. Kết quả sinh hóa huyết học của chuột lang nhóm II .................................122 xviii
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: ThS. Vũ Thị Hoan Khóa: 2011 Người hướng dẫn: GS. TS. Trần Thị Luyến PGS. TS. Vũ Ngọc Bội Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Luận án đã thu được một số kết quả mới bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng oligichitosan: 1) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học sử dụng phối hợp giữa vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC- B 431 lên men khử protein, khoáng chất của đầu vỏ tôm thẻ và enzyme flavourzyme khử protein còn lại ở vỏ đầu tôm: vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 nuôi hoạt hóa trong 28 giờ và thu dịch sinh khối có mật độ tế bào 2.109 cfu/ml, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1, tỷ lệ rỉ đường bổ sung 11,15% (w/w), tỷ lệ dịch vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 bổ sung 11,20% (v/w), lên men ở nhiệt độ phòng, trong thời gian 6,19 ngày với pH ban đầu là 7,0; Sử dụng enzyme flavourzyme khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm thẻ chân trắng sau lên men với tỷ lệ enzyme sử dụng 0,06%, nhiệt độ thủy phân 50oC ở pH 7,5, trong thời gian 8h. Sử dụng acid HCl 3% khử khoáng còn lại ở chitin thô với tỷ lệ dung dịch acid/chitin thô: 2/1. Quá trình khử khoáng còn lại thực hiện ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10h. Chitin sản xuất có chi phí nguyên vật liệu là 111.000 đồng/kg. Quy trình sản xuất này giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng nên giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi trường. Mặt khác sản phẩm phụ: protein, astaxanthin,.. tách ra từ quá trình lên men đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B431 hoàn toàn có thể sử dụng làm thức ăn chăn nuôi. Do vậy, quy trình sản xuất này vừa có ý nghĩa khoa học và vừa có xix
ý nghĩa thực tiễn lớn trong bảo vệ môi trường đồng thời tạo ra sản phẩm chitin theo sản xuất theo phương pháp sinh học “xanh” và “sạch” hơn. 2) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl trên 90%: deacetyl chitin bằng NaOH 50% ở nhiệt độ phòng trong thời gian 120h và tỷ lệ dung dịch NaOH so với chitin 4/1. Chitosan sản xuất theo quy trình có độ deacetyl trên 93% và có chi phí nguyên vật liệu là 361.365 đ/kg. Đóng góp mới của kỹ thuật này ở chỗ quá trình deacetyl chitin thành chitosan được tiến hành ở nhiệt độ phòng mà không sử dụng nhiệt độ cao như các phương pháp khác. Vì thế về mặt công nghệ, quy trình sản xuất sẽ đơn giản và dễ thực hiện hơn. Do vậy, công nghệ này có thể dễ dàng triển khai trong thực tế sản xuất ở quy mô lớn - đây chính là điều các doanh nghiệp chế biến chitosan từ đầu vỏ tôm đang mong muốn. 3) Luận án đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng cách sử dụng bức xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng vẩy với cường độ 166kGy. Oligochitosan thu được sau khi chiếu xạ có 3 phân đoạn và có khả năng kháng 5 loại vi khuẩn: E. coli O157:H7, Salmonella typhimurium, S. aureus, B. subtilis và Listeria monocytogenes. Việc sản xuất oligochitosan theo kỹ thuật sử dụng bức xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng vẩy có ưu điểm là sản phẩm sau phân cắt không cần phải kết tủa bằng cồn, tinh sạch và sấy khô như các phương pháp phân cắt chitosan thành oligochitosan bằng enzyme và hóa học. Mặt khác, sản phẩm oligochitosan lại có khả năng kháng 5 loại vi khuẩn và dễ bảo quản, vận chuyển. Do vậy về mặt công nghệ, phương pháp này có tính khả thi cao và dễ dàng triển khai sản xuất đại trà chế phẩm oligochitosan. 4) Luận án đã xác định được cấu trúc phân tử của oligochitosan có 13 monomer. 5) Luận án đã tiến hành thử nghiệm độc tính của oligochitosan trên chuột thí nghiệm và phân tích máu, nước tiểu, giải phẫu, cắt lát quan sát vi thể gan thận, lách của chuột sử dụng oligochotosan cho thấy oligochitosan hoàn toàn an toàn và không gây độc cho chuột qua con đường tiêu hóa cũng như không có bất cứ một ảnh hưởng nào tới các nội quan của chuột. Đây là nghiên cứu đầu tiên tiến hành thử nghiệm oligochitosan trên chuột thí nghiệm. Việc thử nghiệm đã chứng minh rằng chế phẩm oligochitosan sản xuất theo kỹ thuật phân cắt chitosan bằng bức xạ gamma coban 60 hoàn toàn an toàn với chuột thí xx
nghiệm tức là an toàn với con người - đây chính là một hướng mới trong sản xuất và sử dụng oligochitosan cho lĩnh vực thực phẩm và dược học. 6) Luận án đã nghiên cứu và xây dựng quy trình bảo quản tôm bạc biển bằng cách nhúng chế phẩm oligochitosan với nồng độ 1% trong thời gian 1 phút. Tôm bạc nguyên liệu sau xử lý oligochitosan 1% có thể bảo quản 6 ngày trong điều kiện mát mà vẫn đạt tiêu chuẩn chất lượng dùng làm nguyên liệu chế biến. Nghiên cứu này cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng oligochitosan trong bảo quản thủy sản - nghiên cứu này nếu được triển khai trong thực tế sẽ góp hạn chế việc lạm dụng hóa chất trong bảo quản nguyên liệu thủy sản. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH GS. TS. Trần Thị Luyến PGS. TS. Vũ Ngọc Bội Vũ Thị Hoan xxi
MỞ ĐẦU Những năm qua, ngành thuỷ sản đã phát triển và vươn lên thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước. Chiến lược phát triển xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam phấn đấu đến năm 2020 đạt mức 10 tỷ USD, đưa Việt Nam trở thành một trong bốn cường quốc hàng đầu về xuất khẩu thuỷ sản. Theo định hướng này, chính phủ Việt Nam có chiến lược tăng cường đầu tư cho khai thác, bảo quản nguyên liệu thủy sản đánh bắt xa bờ vừa góp phần phát triển kinh tế biển vừa giữ vững chủ quyền biển đảo. Hiện nay việc bảo quản nhiều loại nguyên liệu thủy sản như cá, tôm, mực... sau thu hoạch còn nhiều hạn chế. Theo quy định HACCP, để đảm bảo chất lượng, nguyên liệu thủy sản cần được bảo quản bằng phương pháp ướp đá đủ để giữ nhiệt độ của nguyên liệu ≤ 4oC. Tuy vậy, người dân thường không có đủ dụng cụ, thiết bị và các điều kiện để bảo quản nguyên liệu thủy sản đúng cách nên thường có xu thế lạm dụng các loại kháng sinh và các loại phụ gia độc hại như hàn the, urea... trong bảo quản nguyên liệu thủy sản gây nên tình trạng nguyên liệu thủy sản chứa dư lượng các chất bảo quản và không bảo đảm yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm. Một trong các hướng bảo quản nguyên liệu thủy sản đang được các nhà nghiên cứu quan tâm là sử dụng các tác nhân sinh học có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại và có khả năng ức chế sự sinh trưởng phát triển của các vi sinh vật gây hư hỏng để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu thủy sản. Oligochitosan là tác nhân sinh học có nguồn gốc từ vỏ tôm, không độc hại và có khả năng kháng khuẩn. Oligochitosan đã được các nhà nghiên cứu nhất là các nhà nghiên cứu tại Trường Đại học Nha Trang quan tâm nghiên cứu sử dụng trong bảo quản các loại nguyên liệu thủy sản. Theo hướng nghiên cứu này, dưới sự tài trợ của đề tài cấp nhà nước KC07.02/11-15: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm oligosaccharide (oligochitin và oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu thuỷ sản đánh bắt xa bờ” và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn khoa học, tôi thực hiện luận án “Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch”. Mục tiêu của chung của luận án Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và ứng dụng để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu tôm bạc biển. Mục tiêu cụ thể - Sử dụng phương pháp sinh học phối hợp giữa vi khuẩn lactic và enzyme protease để khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm thẻ trong quá trình sản xuất chitin nhằm 1