Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:195

Thêm vào BST

Báo xấu

43
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ cho định hướng phát triển vaccine thế hệ mới.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium

i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ AGROBACTERIUM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC i
ii HÀ NỘI – 2018 ii
iii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ AGROBACTERIUM Chuyên ngành: Hoá sinh học Mã số: 94 20 116 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học 2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ sinh học iii
iv HÀ NỘI – 2018 iv
v LỜI CẢM ƠN Luận án được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương. Với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài thuộc nhiệm vụ nghiên cứu thường xuyên của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học. Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của tập thể cán bộ hướng dẫn, các thầy cô giáo, các nhà khoa học, các anh chị em đồng nghiệp và quý cơ quan, phòng ban. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng của Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy, PGS.TS. Chu Hoàng Hà và TS. Nguyễn Trung Nam đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Lê Trần Bình, PGS.TS. Phạm Bích Ngọc, PGS.TS. Đinh Duy Kháng, PGS.TS. Tô Long Thành, TS. Nguyễn Tường Vân, ThS. Hồ Thị Thương và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen đã luôn giúp đỡ, chia sẻ những kiến thức quý báu và tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp, Ban Lãnh đạo, cùng toàn thể cán bộ của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để cho tôi yên tâm học tập và thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 v
vi Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Hằng vi
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Trung Nam và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần kết quả còn lại của luận án chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Minh Hằng i
ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 1 Chương 1 6 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................................. 6 Chương 2 43 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................. 43 Chương 3 61 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................................................... 61 Chương 4 108 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 108 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 132 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................. 132 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH .......................................................... 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 140 ii
iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AS Acetosyringone aa Amino acid (axit amin) 2b CMV Cucumber mosaic virus (CMV) 2b protein (Protein 2b của virus khảm dưa chuột) bp Base pair (Cặp base) BSA Bovine serum albumin CaMV Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ) Cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid ER Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất) ELISA Enzyme linked immunosorbent assay ELP Elastinlike polypeptide et al And coworkers (và các cộng sự) Fc Fragment crystallizable GFP Green fluorescent protein (Protein huỳnh quang xanh) GP5 Glycoprotein 5 GP5ecto Ectodomain of glycoprotein (Vùng ngoại bào của protein GP5) HCPro Helper component protease (Protein hỗ trợ) HPPRRSV Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp thể độc lực cao) HRP Horseradish peroxidase IPMA Immunoperoxidase monolayer assay (Xét nghiệm miễn dịch đơn lớp cộng hợp enzyme peroxidase) IgG Immunoglobulin G kb Kilobase kDa Kilodalton LB LuriaBertani (Môi trường nuôi khuẩn LuriaBertani) iii
iv LV Lelystad virus M Matrix/ Membrance protein MES 2(N Morpholino)ethanesulfonic acid mg Milligram MLV Modifiedlive virus (Virus sống đã làm biến đổi = virus nhược độc) mITC Membranebased Inverse transition cycling (Chu trình chuyển pha nghịch đảo qua màng) nptII Gene mã hoá Neomycin phosphotransferase (Gen kháng kanamycin) Nos Nopaline synthase terminator nsp Nonstructural protein OD Optical density (Mật độ quang) ORF Open reading frame (Khung đọc mở) PBS Phosphatebuffered saline PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Fc Stabilizing domain "Fragment of crystallizable chain of IgG" (Vùng hằng định của kháng thể IgG) PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn) RNA Ribonucleic acid ScFv Single chain variable fragment SDSPAGE Sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis TSP Total soluble protein (Protein tổng hợp) 35S Ter 35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã) VLP Viruslike particle WT Wild type (Cây không chuyển gen) DANH MỤC BẢNG iv
v Bảng 1.1 Tình hình dịch PRRS giai đoạn 2015 – 2016 ………………... 8 Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu gen gp5opt, gp5ecto 4 m và m ……………………………………………………….. 4 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng ghép nối gen m, gp5opt với vector 4 pRTRA 35SHistagCmyc100xELP ……………………….. 7 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gp5ecto với gen m và 4 với vector pRTRA 35SHistagCmyc100xEL ……………… 7 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối các cassette gen với vector 4 pCB301 ………………………………………………………. 8 Bảng 3.1 So sánh mức độ biểu hiện tạm thời gen mã hoá các kháng nguyên tái tổ hợp (MELP, GP5ELP, GP5ectoMELP) trong lá thuốc lá N. benthamiana 8 …………………………………... 2 Bảng 3.2 Hiệu suất thu hồi và mức độ tinh sạch của các protein M 9 ELP, GP5ELP, GP5ectoMELP …………………………….. 1 v
vi DANH MỤC CÁC HÌNH vi
Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của virus PRRS …………………………. 9 Hình 1.2 Ảnh hiển vi điện tử của các h viiạt Arterivirus …………………. 9 Hình 1.3 Mô hình cấu trúc hạt virus PRRS và các khung đọc mở trên hệ gen PRRS ………………………………………………… 12 Hình 1.4 Đặc điểm của GP5 …………………………………................ 13 Hình 1.5 Cấu trúc Arterivirus …………………………………………. 14 Hình 1.6 Sơ đồ mô tả sự biểu hiện gen tạm thời sử dụng các vector pEAQ bằng phương pháp thẩm lọc A. tumefaciens …………. 34 Hình 1.7 Thẩm lọc nhờ A. tumefaciens vào lá N. benthamiana ……….. 34 Hình 1.8 Sơ đồ của chu kỳ chuyển pha nghịch đảo qua màng ………... 41 Hình 2.1 Chuyển gen tạm thời vào lá cây thuốc lá nhờ A. tumefaciens bằng phương pháp hút chân không ………………………….. 50 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột …………………. 55 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên lợn ……………………. 56 Hình 3.1 Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35SmHistagCmyc 100xELP ……………………………………………………... 61 Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc cassette gen m mã hoá protein M dung hợp ELP............................................................................................ 62 Hình 3.3 Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35SmHistag Cmyc100xELP ……………………………………………… 63 Hình 3.4 Phân tích sản phẩm ColonyPCR kiểm tra A. tumefaciens mang vector pCB301 35SmHistagCmyc100xELP ……….. 65 Hình 3.5 Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35Sgp5optHistag Cmyc100xELP ……………………………... 66 Hình 3.6 Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5opt mã hoá protein GP5 dung hợp ELP ……………………………………………………... 67 Hình 3.7 Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35Sgp5opt HistagCmyc100xELP ……………………………………… 68 Hình 3.8 Sản phẩm ColonyPCR kiểm tra A.tumefaciens mang vector pCB301 35Sgp5optHistagCmyc100xELP ……………….. 69 Hình 3.9 Thiết kế vector nhân dòng pRTRA 35Sgp5ectomHistag 70 Cmyc100xELP ………………..………… vii Hình 3.10 Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5ectom mã hoá protein
viii viii
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hội chứng rối loạn sinh s ản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hi ểm trên lợn do virus gây ra. Ở Việt Nam, b ệnh còn đượ c gọi là “Bệnh lợ n tai xanh” (theo ngôn ngữ đại chúng) do lợn mắc bệnh thường b ị xung huy ết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm, sau tím xanh. PRRS gây thiệt hại kinh tế rất lớn ở nh ững n ước có bệnh. PRRS đượ c phát hiện ở Mỹ vào năm 1987. Hàng năm nước Mỹ phải chịu những thiệt hại do b ệnh này ướ c tính khoảng 664 triệu USD cho vi ệc tiêu huỷ lợ n chêt, l ́ ợn ôm, chi phi chông dich va x ́ ́ ́ ̣ ̀ ử ly môi tr ́ ươ ̀ng. Ở Việt Nam, dich PRRS do virus th ̣ ể độc lực cao xuất hiện lần đầu tiên vào năm 2007. Từ đo đên nay, dich ́ ́ ̣ đã xuât hi ́ ện ở hâu hêt cac đia ph ̀ ́ ́ ̣ ươ ng ̉ ươ c. Theo th trong ca n ́ ống kê của Cục Thú y, từ cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016, đã xuất hiện 14 ổ dịch PRRS tại 8 huy ện c ủa 4 t ỉnh là Quảng Trị, Hậu Giang, Nghệ An và Hà Tĩnh, làm 3.433 con lợn mắc bệnh, trong đó có 1.242 con lợn b ị tiêu huỷ. PRRS đã anh hu ̉ ̛ở ng nặng nê t ̀ ới nganh chan nuoi l ̀ ̆ ̂ ợn trong nước. Bệnh vẫn xuất hi ện ở m ột s ố địa phươ ng và có tính chất 23 năm một lần. Điều này cũng cho thấy nguy c ơ xu ất hi ện tr ở l ại c ủa d ịch b ệnh này trong thời gian t ới. Hiện nay, các vaccine phòng PRRS chủ yếu là vaccine vô hoạt và nhược độc. Cac vaccine vô ho ́ ạt thươ ̀ng an toan nh ̀ ưng kh ả năng bao h ̉ ộ thâp. Cac ́ ́ vaccine nhượ c độc bao h ̉ ộ tốt hơn nhưng còn nhiều lo ngại về tính an toàn của các loaị vaccine này. Vaccine nhược độc có thể giam dân m ̉ ̀ ức bao h ̉ ộ do ̉ giam m ức tương đông v ̀ ới chung m ̉ ới (nếu có) va ban thân virus vaccine sau ̀ ̉ nhiêu lân truyên nhi ̀ ̀ ̀ ễm cũng co thê đ ́ ̉ ột biên tr ́ ở thanh c ̀ ươ ̀ng độc. Mặc dù vậy, phòng chống PRRS tại Việt Nam đã đạt hiệu quả cao. Hiện nay, d ịch ch ỉ xu ất hiện lẻ tẻ, trong những năm gần đây hầu như không có dịch, một phần là nhờ biện pháp chủ động tiêm phòng cho lợn.
2 Virus gây Hội chứng rối loạn sinh s ản và hô hấp ở lợn ở nướ c ta hiện nay đượ c xác định là thể độc lực cao và chưa có thuốc đặc trị. Việc phòng chống dịch chủ yếu vẫn là tiêm phòng vaccine kết hợp các biện pháp thú y (Tiêu độc khử trùng, vệ sinh truồng tr ại, cách ly và tiêu huỷ lợn bệnh ...). Để phòng chống virus th ể độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam cần phải có thêm vaccine phù hợp. Nhu cầu về các loại vaccine PRRS th ế h ệ m ới trong đó có vaccine tiểu đơn vị, an toàn và hiệu quả là vấn đề cấp thiết. Protein GP5 và M là những protein cấu trúc chính của virus PRRS (PRRSV) đượ c lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV. Các kháng thể kháng GP5 và M ở lợn là các kháng thể có khả năng trung hoà PRRSV. Sự kết hợp đoạn peptit miền ngoài của kháng nguyên GP5 (Ectodomain, GP5ecto) được cho là chứa các epitope trung hoà của GP5 với protein M với mong muốn sẽ tạo được protein tái tổ hợp heterodimer GP5ectoM có khả năng kích thích tạo đáp ứng miễn dịch mạnh và trở thành một trong những ứng viên tiềm năng làm nguyên liệu để phát triển sản xuất vaccine chống PRRSV. Kháng nguyên của virus PRRS có thể đượ c sản xuất trong hệ th ống thực vật nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS thông qua phươ ng pháp biểu hiện gen tạm thời. H ệ th ống bi ểu hi ện gen t ạm th ời ở th ực v ật bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium nhằm sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm như: Mức độ biểu hiện kháng nguyên cao, có thể sản xuất protein với số lượng l ớn, ph ương pháp thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá, cung cấp kháng nguyên cho mục đích sản xuất vaccine chống ch ủng virus m ới xu ất hi ện m ột cách nhanh chóng khi dịch bệnh xảy ra. Căn cứ vào các luận cứ khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án được thực hiện với đề tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong
3 cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium” với mục đích tạo cơ sở khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đang lưu hành ở Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ cho định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ cho định hướng phát triển vaccine thế hệ mới. Mục tiêu cụ thể Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize (gp5opt) và gp5ectom của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter CaMV 35S. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá 3 loại kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá và tinh sạch được kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mô lá thuốc lá. Đánh giá được tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM trên động vật thí nghiệm. 3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các gen m, gp5opt và gp5ectom mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp MELP, GP5ELP, GP5ectoMELP và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector tương ứng. Nội dung 2: Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen m, gp5opt và gp5ectom ở lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana. Biểu hiện tạm thời và tinh sạch các kháng nguyên tái tổ hợp.
4 Nội dung 3: Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể của kháng nguyên M ELP, GP5ELP và GP5ectoMELP tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. 4. Đong gop m ́ ́ ới cua lu ̉ ận án Luận án đã tiến hành thực hiện nghiên cứu một cách tổng thể, từ việc thiết kế vector chuyển gen mang các gen mã hóa kháng nguyên của virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh, tối ưu các điều kiện biểu hiện gen tạm thời trong thực vật, biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. Luận án là công trình nghiên cứu thành công đầu tiên tại Việt Nam về việc thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện tạm thời các gen m/ gp5opt/ gp5ectom mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP của chủng virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc lá N. benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium. Kết quả của luận án cũng đã chứng minh được các kháng nguyên tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP có khả năng kích thích sinh kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS trên động vật thí nghiệm. Trong đó, kháng nguyên GP5ecto (vùng ngoại bào của GP5) dung hợp với kháng nguyên M (GP5ectoM ELP) kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu tốt hơn kháng nguyên MELP, GP5 ELP riêng lẻ. Kháng nguyên GP5ectoMELP và GP5ELP là hai ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV thể độc lực cao đang gây bệnh ở Việt Nam. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen mang gen m/gp5opt/gp5ectom mã hóa cho các kháng nguyên tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM của PRRSV dung hợp Elastin like polypeptide (ELP); biểu hiện tạm thời kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết quả đề tài luận án là bằng chứng khoa học về
5 tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS trong thực vật. Ý nghĩa thực tiễn Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/ gp5opt/ gp5ectom mã hóa các kháng nguyên tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP của chủng virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam và các chủng A. tumefaciens mang các vector này có thể được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS. Quy trình biểu hiện gen tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ A. tumefaciens với các điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng để sản xuất các kháng nguyên tái tổ hợp MELP, GP5ELP, GP5ectoMELP hoặc các protein tái tổ hợp khác. Kháng nguyên tái tổ hợp GP5ELP và GP5ectoMELP được tạo ra trong đề tài luận án là hai ứng viên tiềm năng cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam.
6 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 1.1.1. Sơ lược tình hình dịch bệnh Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRS) còn được gọi là Bệnh lợn tai xanh (theo ngôn ngữ đại chúng), lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987, với các biểu hiện bệnh ở cơ quan sinh sản và hô hấp. Lợn nái mắc hội chứng này bị sảy thai ở thai kỳ cuối, thai lưu, đẻ non, lợn con sinh ra yếu hoặc bị chết, tỷ lệ đẻ thấp, chậm động dục trở lại. Lợn con đang bú sữa hoặc lợn con đã cai sữa có biểu hiện rối loạn hô hấp nghiêm trọng. Sau đó, dịch PRRS đã lây lan nhanh sang nhiều quốc gia khác bao gồm: Canada (1988); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991) và ở Pháp (1992) (Rossow, 1998). Đến năm 1991, nguyên nhân gây bệnh “bí hiểm” được xác định là do một loại virus RNA gây ra. Ngay sau đó, virus này cũng đã được phân lập ở Mỹ (Collins et al., 1992), Canada (Dea et al., 1992a,1992b) và nhiều nước trên thế giới. Năm 1992, hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St. Paul, Minnesota đã thống nhất tên gọi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn PRRS và được tổ chức Thú y thế giới (OIE) công nhận. Từ đó, virus gây bệnh cũng được gọi là PRRSV. Tại Trung Quốc, PRRS xuất hiện từ những năm 1995, gây chết hàng loạt lợn bệnh. Năm 2006, PRRS lại bùng phát trong vòng ba tháng, làm trên 2 triệu lợn mắc bệnh, 400 nghìn con chết, ước tính tỷ lệ chết khoảng 20%. Bệnh có tốc độ lây lan nhanh, chỉ sau 3 5 ngày bệnh có thể lây ra toàn đàn, với biểu hiện sốt cao 40 420C, vì vậy năm 2006 bệnh này còn có tên là “bệnh sốt cao”. Năm 2007, dịch lại tiếp tục bùng phát, xảy ra ở 26/33 tỉnh với 257.000 con mắc, làm chết hơn 68.000 con, tiêu huỷ 175.000 con. Các chủng PRRSV thể độc lực thấp và thể độc lực cao thuộc dòng Bắc Mỹ đều đã được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của lợn mắc bệnh. Từ đó đến nay, bệnh vẫn diễn biến phức tạp. Ở Philippines,