Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể, đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và một số khu vực ở Châu Á

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:187

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Sinh học "Nghiên cứu hệ gen ty thể, đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và một số khu vực ở Châu Á" với mục tiêu là: “Thu được toàn bộ hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và châu Á, phân tích đặc điểm gen và hệ gen phục vụ nghiên cứu dịch tễ học phân tử và ứng dụng trong chẩn đoán phân loại”.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể, đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và một số khu vực ở Châu Á

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thị Khuê NGHIÊN CỨU HỆ GEN TY THỂ, ĐƠN VỊ MÃ HÓA RIBOSOME CỦA SÁN LÁ PHỔI HỌ PARAGONIMIDAE TẠI VIỆT NAM VÀ MỘT SỐ KHU VỰC Ở CHÂU Á LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thị Khuê NGHIÊN CỨU HỆ GEN TY THỂ, ĐƠN VỊ MÃ HÓA RIBOSOME CỦA SÁN LÁ PHỔI HỌ PARAGONIMIDAE TẠI VIỆT NAM VÀ MỘT SỐ KHU VỰC Ở CHÂU Á Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã sỗ: 9 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Lê Thanh Hòa 2. TS. Đoàn Thị Thanh Hương Hà Nội – 2022
i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - GS.TS. Lê Thanh Hoà, nguyên Trưởng Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy rất tâm huyết đã tận tình trực tiếp hướng dẫn, định hướng nghiên cứu, đã tạo điều kiện tối đa và truyền dạy kiến thức, kinh nghiệm, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. - TS. Đoàn Thị Thanh Hương, Trưởng phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người thầy, người chị đã tận tình chỉ dạy và đồng hướng dẫn khoa học tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các đồng nghiệp Phòng Miễn dịch học và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận án của mình. Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu. - Ban Giám đốc, Khoa Công nghệ sinh học, Phòng Quản lý Đào tạo - Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. - Cám ơn sự hỗ trợ kinh phí của Quỹ Phát triển Khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 108.02-2017.09 và 108.02-2020.07 do GS.TS Lê Thanh Hòa chủ nhiệm. - TS. Đặng Tất Thế, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; GS.TS. Takeshi Agatsuma, Trường Đại học Kochi, Nhật Bản; GS.TS. David Blair; GS.TS. Nguyễn Văn Đề, Trường Đại học Y Hà Nội và PGS.TS. Phạm Ngọc Doanh, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã giúp đỡ hợp tác trao đổi thu mẫu, thí nghiệm nghiên cứu hình thái học cho nghiên cứu này và các giúp đỡ khác
ii trong công bố và hoàn thành luận án. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc, giúp đỡ cũng như chia sẻ những khó khăn cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn chồng và các con của tôi đã luôn khuyến khích và truyền nhiệt huyết cho tôi thêm sức mạnh để giúp tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu của mình. Hà Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2022 Tác giả Nguyễn Thị Khuê
iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2022 Tác giả Nguyễn Thị Khuê
iv MỤC LỤC Tr Lời cảm ơn .............................................................................................................. i Lời cam đoan ........................................................................................................... iii Mục lục ................................................................................................................... iv Danh mục các chữ viết tắt ....................................................................................... viii Danh mục các bảng ................................................................................................. xi Danh mục các hình .................................................................................................. xiii MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3 1.1 Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae ....................... 3 1.1.1 Phân loại sán lá phổi họ Paragonimidae ................................................ 3 1.1.2 Phân bố địa lý sán lá phổi họ Paragonimidae ...................................... . 5 1.1.3 Đặc điểm sinh học sán lá phổi họ Paragonimidae ................................ 7 1.1.4 Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae trên thế giới ........ 13 1.1.5 Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae ở Việt Nam .......... 18 1.2 Giới thiệu ty thể, ribosome của ty thể và hệ gen ty thể ...................... 21 1.2.1 Giới thiệu ty thể, nguồn gốc, cấu tạo và chức năng................................. 21 1.2.2 Cấu trúc và sắp xếp gen ở hệ gen ty thể .................................................. 23 1.2.3 Mitoribosome của ty thể và thành phần cấu tạo ..................................... 26 1.2.4 Đặc điểm gen học hệ gen ty thể ............................................................... 26 1.3 Cấu trúc đơn vị mã hóa ribosome của hệ gen nhân .......................... 31 1.3.1 Cấu trúc ribosome của tế bào................................................................. 31 1.3.2 Đơn vị mã hóa ribosome của hệ gen nhân tế bào................................... 32 1.3.3 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử của đơn vị mã hóa ribosome...... 36 1.4 Sự cần thiết nghiên cứu đặc điểm gen hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi Paragonimus ……………………….... 38 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯƠNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 Đối tượng, mục tiêu, nội dung và địa điểm nghiên cứu ..................... 41 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………………... 41 2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................ 41 2.1.3 Nội dung nghiên cứu ………………………………………..………………... 41 2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................... 44 2.2. Vật liệu nghiên cứu ………………………………………………….. 44 2.2.1 Nguồn vật liệu là mẫu sán lá phổi nghiên cứu ........................................ 44
v 2.2.2 Vật liệu khuôn DNA và các loại mồi sử dụng ....................................... 45 2.2.3 Hóa chất, sinh phẩm, dụng cụ ........................................................... 45 2.2.4 Trang thiết bị ........................................................................................... 46 2.3 Phương pháp nghiên cứu gen và hệ gen ty thể (mtDNA) ………... 46 2.3.1 Phương pháp xác định cấu trúc và sắp xếp gen ở hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và P. ohirai …………………………. 47 2.3.2 Phương pháp phân tích đặc điểm gen RNA ribosome ty thể (MRG)….. 48 2.3.3 Phương pháp phân tích đặc điểm gen RNA vận chuyển ty thể (tRNA) .. 48 2.3.4 Phương pháp phân tích vùng không mã hóa ở hệ gen ty thể …………... 49 2.3.5 Phân tích phương thức sử dụng nucleotide và tính toán giá trị độ lệch (skew/skewness) trong hệ gen ty thể ………………………………………. 49 2.3.6 Phương pháp tính khoảng cách di truyền giữa các loài sán lá phổi dựa trên chuỗi nucleotide của hệ gen ty thể ……………………………………. 50 2.3.7 Phương pháp phân tích đặc điểm gen mã hóa protein và sự “thiên vị” sử dụng bộ mã ………………………………………………………………… 51 2.3.8 Phương pháp phân tích phả hệ dựa trên chỉ thị cộng hợp toàn bộ 12 PCG của mtDNA …………………………………………………………….. 52 2.4 Phương pháp nghiên cứu gen học đơn vị mã hóa ribosome (rTU) ..... 53 2.4.1 Phương pháp xác định cấu trúc và sắp xếp gen ở đơn vị mã hóa ribosome của Paragonimus heterotremus và sán lá phổi châu Á ……… 53 2.4.2 Phương pháp xác định độ dài, đặc điểm gen/vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome …………………………………………………………….. 54 2.4.3 Phương pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai gen 18S và 28S rRNA của Paragonimus heterotremus và P. ohirai …………………….. 54 2.4.4 Phương pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai vùng giao gen (ITS-1 và ITS-2) của Paragonimus heterotremus và sán lá phổi châu Á ……. 55 2.4.5 Phương pháp phân tích phương thức sử dụng nucleotide và giá trị độ lệch (“skew”) trong đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á ….. 56 2.4.6 Phương pháp phân tích tương đồng nucleotide của gen 18S+28S rRNA và phần mã hóa ribosome (rTU*) của sán lá phổi họ Paragonimidae …. 56 2.4.7 Phương pháp xác lập phả hệ dựa trên phân tích chuỗi gen 28S rRNA toàn phần (~3,8 kb) ……………………....................................................... 56 2.4.8Phương pháp xác lập phả hệ dựa trên phân tích cộng hợp chuỗi gen 18S+28S rRNA toàn phần (~5,8 kb)…………………….............................. 57 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ………………………………………... 59 3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể của sán lá phổi châu Á
vi Paragonimus heterotremus và P. ohirai họ Paragonimidae ……….. 59 3.1.1 Cấu trúc và sắp xếp hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus (mẫu Việt Nam) và P. ohirai (mẫu Nhật Bản) ……………... 59 3.1.2 Phân tích đặc điểm và cấu trúc gen RNA ribosome của ty thể (MRG)….. 65 3.1.3 Phân tích đặc điểm và cấu trúc gen RNA vận chuyển ty thể (tRNA)…….. 67 3.1.4 Phân tích vùng không mã hóa (NCR) ở hệ gen ty thể của P. heterotremus và P. ohirai ……………………………………………………... 69 3.1.5 Phương thức sử dụng nucleotide và giá trị “độ lệch” (skew) trong hệ gen ty thể của P. heterotremus, P. ohirai và sán lá phổi khác ……........ 70 3.1.6 Phân tích đặc điểm gen mã hóa protein và sự “thiên vị” sử dụng bộ mã ở hệ gen ty thể của P. heterotremus, P. ohirai và sán lá phổi châu Á …... 72 3.1.7 Khoảng cách di truyền giữa P. heterotremus và các loài sán lá phổi châu Á dựa trên chuỗi nucleotide phần mã hóa của hệ gen ty thể ……. 76 3.1.8 Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu amino acid cộng hợp của 12 PCG ………………………………....................... 77 3.2. Kết quả nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae ………………………………………………………... 81 3.2.1 Cấu trúc và sắp xếp gen ở đơn vị mã hóa ribosome của các loài sán lá phổi Paragonimus châu Á (P. heterotremus, P. ohirai, P. iloktsuenensis, P. miyazakii và P. westermani) ………………………............................ 81 3.2.2 Độ dài gen rRNA và vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome của các loài sán lá phổi Paragonimus châu Á ……………………………………… 83 3.2.3 Đặc điểm cấu trúc gen rRNA (18S và 28S rRNA) của loài P. heterotremus và P. ohirai ……………………………………………………. 87 3.2.4 Đặc điểm cấu trúc vùng giao gen (ITS-1 và ITS-2) của loài P. heterotremus và P. ohirai ……………………………………………………. 89 3.2.5 Kết quả phân tích phương thức sử dụng nucleotide và giá trị “độ lệch” (skew) ở đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á ……………… 92 3.2.6 Kết quả phân tích tương đồng nucleotide của các gen rRNA và phần mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae …………………… 94 3.2.7 Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu đơn gen 28S rRNA toàn phần ……………………………………………………... 95 3.2.8Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu cộng hợp gen 18S+28S rRNA toàn phần ………………………………………… 98 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ……………………………………………………...... 101 4.1 Về nghiên cứu gen/hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus
vii heterotremus và Paragonimus ohirai ……………………………….... 103 4.1.1 Về thu nhận dữ liệu gen/hệ gen ty thể của Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai ……………………………………………………..... 103 4.1.2 Về đặc điểm cấu trúc của gen và hệ gen ty thể sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai……………………... 106 4.1.3 Về đặc điểm thành phần gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai……………………………………… 109 4.1.4 Về ứng dụng mtDNA trong nghiên cứu phân loại và phả hệ tiến hóa của sán lá phổi châu Á ………………………………………………………. 112 4.1.5 Về xây dựng cơ sở dữ liệu mtDNA của họ Paragonimidae .................... 114 4.2. Về nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á …... 118 4.2.1 Về thu nhận dữ liệu gen/vùng giao gen của đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á ………………………………………………………. 118 4.2.2 Về đặc điểm cấu trúc của gen rRNA và vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á …………………………………………… 120 4.2.3 Về đặc điểm thành phần gen của đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á ……………………………………………………………………. 122 4.2.4 Về ứng dụng đơn vị mã hóa ribosome trong nghiên cứu phân tích phả hệ 123 4.2.5 Về xây dựng cơ sở dữ liệu đơn vị mã hóa ribosome của họ Paragonimidae ........................................................................................ 124 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 127 DANH SÁCH CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ................................................... 129 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 130 PHỤ LỤC ................................................................................................................
viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung Giải nghĩa ATP Adenosine triphosphate Phân tử mang năng lượng bp Base pair Cặp bazơ DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic ĐVLSN Zoonosis/zoonoses Động vật lây sang người et al. Và những người khác ETS External Transcribed Spacer Vùng ngoại gen “hairpin”/stem Secondary structure Cấu trúc nhánh “kẹp tóc” HTH Morphology Hình thái học Non-transcribed intergenic IGS Vùng bản lề spacer Integrated Taxonomic Hệ thống thông tin phân loại tích ITIS Information System hợp ITS Internal Transcribed Spacer Vùng giao gen Kb (= Kbp) Kilo base pair Đơn vị đo (= 1.000 cặp bazơ) KCDT Genetic distance Khoảng cách di truyền KST Parasite Ký sinh trùng LNR Long non-coding region Vùng không mã hóa dài “loop” Secondary structure Cấu trúc “vòm” LsrDNA Large subunit rDNA Tiểu đơn vị lớn DNA ribosome LPCR Long- Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp dài LRU Long repeat unit Cấu trúc lặp dài MFE Mimum free energy Năng lượng kết nối tối thiểu
ix MRG Mitoribosomal gene Gen RNA ribosome ty thể mRNA Messenger RNA RNA thông tin mtDNA Mitochondrial genome Hệ gen ty thể mtDNA* Coding mitochondrial genome Phần mã hóa của mtDNA mt-LSU Large mitoribosomal unit Tiểu đơn vị lớn ribosome ty thể mtRP/MRP Mitoribosomal protein Protein ribosome ty thể mt-SSU Small mitoribosomal unit Tiểu đơn vị nhỏ ribosome ty thể NOR Nucleolar organizing region Vùng thắt thứ cấp National Center for Trung tâm Thông tin CNSH NCBI Biotechnology Information Quốc gia (Hoa Kỳ) NCR/NR Non-coding region Vùng không mã hóa NGS Next-generation sequencing Giải trình tự thế hệ mới nDNA Nuclear genome Hệ gen nhân OXPHOS Oxidative phosphorylation Quá trình ôxy hoá-khử phosphoryl hóa PCG Protein coding gene Gen mã hóa protein PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp SHPT Molecular biology Sinh học phân tử SLP Sán lá phổi SNR Short non-coding region Vùng không mã hóa ngắn ssrDNA Small subunit rDNA Tiểu đơn đơn vị nhỏ DNA ribosome rDNA Ribosomal DNA DNA ribosome RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA Gen RNA ribosome rTU Ribosomal transcription unit Đơn vị mã hóa ribosome
x Coding ribosomal transcription rTU* Phần mã hóa rTU unit SRU Short repeat unit Cấu trúc lặp ngắn tRNA/trn Transfer RNA Gen RNA vận chuyển TRU/TR/RU Tandem repeat unit Đơn vị cấu trúc lặp liền kề VCTG Intermediate host Vật chủ trung gian VCC Definitve host Vật chủ chính
xi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân bố các loài sán lá phổi ở các nước châu Á …………………... 5 Bảng 1.2 Phân bố các loài sán lá phổi ghi nhận gây nhiễm trên người ở châu Á …………………………………………………………………… 6 Bảng 1.3 Các gen trong mtDNA động vật (gồm 13 PCG, 2 MRG và 22 tRNA vận chuyển ………………………………………………….. 23 Bảng 2.1 Danh sách các loài và các chủng sán lá phổi châu Á Paragonimus spp. làm đối tượng chính thực hiện giải trình tự và nghiên cứu hệ gen ty thể (mtDNA) và đơn vị mã hóa ribosome (rTU) của nghiên cứu này …………………………………………………………….. 44 Bảng 3.1 Vị trí của gen và các đặc điểm gen trong mtDNA của loài SLP Paragonimus heterotremus chủng LC, Việt Nam (15.772 bp; KY952166) ……………………………………………………....... 60 Bảng 3.2 Vị trí của gen và các đặc điểm gen trong mtDNA hoàn chỉnh của loài sán lá phổi Paragonimus ohirai (Nhật Bản/14.818 bp/GenBank: KX756277) …………………………………………. 63 Bảng 3.3 Tỷ lệ (%) thành phần nucleotide A, T, G, C và giá trị độ lệch (skew/skewness) AT và GC của các gen PCG, MRG và phần mã hóa (cox3-nad5) của mtDNA ở 9 chủng/4 loài sán lá phổi trong họ Paragonimidae ……………………………………………………... 71 Bảng 3.4 Số lượng bộ mã (codon) và tỷ lệ sử dụng bộ mã để kiến tạo các gen PCG trong mtDNA của các loài SLP P. heterotremus (Việt Nam và Trung Quốc), P. ohirai (Nhật Bản) và 4 chủng của loài P. westermani thuộc họ Paragonimidae ………………………............ 74 Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền tính toán theo tỷ lệ sai khác (%) sử dụng nucleotide của hệ gen ty thể (mtDNA*) giữa 9 chủng/4 loài Paragonimus heterotremus, P. ohirai, P. westermani và P. kellicotti thuộc họ Paragonimidae (phân bộ Troglotremata) ……… 77 Bảng 3.6 Vị trí gen và vùng giao gen của rTU của loài sán lá phổi Paragonimus heterotremus, chủng LC, Việt Nam (Phet-LC-VN)
xii (7.661 bp, ITS1-7,7 TRU) ................................................................. 84 Bảng 3.7 Vị trí gen và vùng giao gen của rTU của loài sán lá phổi Paragonimus ohirai, chủng Kino, Nhật Bản (Pohi-Kino-JP) (7.422 bp, ITS1-5,7 TRU) ………………………………………………… 84 Bảng 3.8 Vị trí gen và vùng giao gen của rTU của loài sán lá phổi Paragonimus iloktsuenensis, chủng Amami, Nhật Bản (Pilo- Amami-JP) (7.543 bp; ITS1-6,7 TRU) ……………………………. 85 Bảng 3.9 Vị trí gen và vùng giao gen của của rTU của loài sán lá phổi Paragonimus miyazakii, chủng OkuST1 (Nhật Bản) (Pmiy- OkuST1-JP) (6.932 bp; 0 TRU) ........................................................ 85 Bảng 3.10 Vị trí gen và vùng giao gen của rTU của loài sán lá phổi Paragonimus westermani, chủng Megha(2n), (Pwes-Megha(2n)- IN) (Ấn Độ) (8.616 bp; ITS1-15,7 TRU) ......................................... 86 Bảng 3.11 Vị trí gen và vùng giao gen của của rTU của loài sán lá phổi Paragonimus westermani, chủng Bogil(3n), (Pwes-Bogil(3n)-KR) (Hàn Quốc) (7.292 bp; ITS1-4,7 TRU) ............................................ 86 Bảng 3.12 Tỷ lệ sử dụng thành phần nucleotide A, T, G, C và giá trị độ lệch (skew/skewness) của từng gen 18S và 28S rRNA và cộng hợp hai gen 18S+28S rRNA và phần mã hóa rTU* của 6 chủng/5 loài sán lá phổi châu Á trong họ Paragonimidae ............................................ 93 Bảng 3.13 Mức độ tương đồng nucleotide (%) của cộng hợp hai gen 18S rRNA+28S rRNA và toàn bộ phần mã hóa đơn vị mã hóa ribosome (rTU*) của 9 chủng/7 loài loài sán lá phổi họ Paragonimidae ……. 94
xiii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Sắp xếp dòng phân loại của họ Paragonimidae và các giống trong họ này theo Hệ thống thông tin phân loại tích hợp (ITIS) ………... 4 Hình 1.2 Các dạnh trưởng thành của sán lá phổi Paragonimus .……………. 7 Hình 1.3 Sán lá phổi giống Paragonimus thu thập tại Việt Nam …................ 8 Hình 1.4 Metacercariae và sán lá phổi của giống Paragonimus: (1) thu thập từ cua suối đá tại Việt Nam; và (2) của Paragonimus ohirai từ cua Chiromantes dehaani (Nhật Bản) ..................................................... 10 Hình 1.5 Chu kỳ phát triển của sán lá phổi họ Paragonimidae ……………... 11 Hình 1.6 Phân bố bệnh paragonimiasis trên thế giới ……………………….. 14 Hình 1.7 Phân bố Paragonimus spp. ở Việt Nam/phía Bắc Việt Nam ……... 19 Hình 1.8 Cấu tạo ty thể ……………………………………………................ 21 Hình 1.9 Minh họa cấu tạo tế bào và vị trí của mtDNA trong tế bào …......... 24 Hình 1.10 Sao chép ở mtDNA tạo ra các phiên bản đa gen (polysistronic transcript) và phân cắt thành các sản phẩm độc lập …………......... 24 Hình 1.11 Mô hình cấu trúc dạng vòng tròn và sắp xếp gen ở mtDNA của người ………………………………………………………………. 25 Hình 1.12 Cấu trúc điển hình của RNA ribosome của mtDNA, tRNA của hệ gen nhân và sắp xếp các cánh tay ở cấu trúc bậc hai ……………... 28 Hình 1.13 Một số cấu trúc bậc hai của tRNA bị khuyết thiếu ở ký sinh trùng 29 Hình 1.14 Phân cắt các gen rRNA, sắp đặt trong ribosome và cấu trúc đơn vị ribosome của tế bào nhân sơ (prokaryote) và tế bào nhân thật (eukaryote) ………………………………………………………… 31 Hình 1.15 Minh họa cấu tạo tế bào và chromosome chứa đơn vị mã hóa ribosome và cấu trúc của một đơn vị rTU ………………………… 33 Hình 1.16 Cấu trúc bậc hai mô phỏng của gen 18S rRNA của ribosome tế bào và của gen 12S rRNA của ribosome ty thể …………………… 35 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí nghiên cứu và các bước thực hiện 2 nội dung chính: i) Nghiên cứu hệ gen ty thể (mtDNA); ii) Nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome (rTU)…………………………………………………….. 43
xiv Hình 3.1 Sơ đồ mtDNA của SLP P. heterotremus (chủng LC, Việt Nam) …. 62 Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc dạng vòng tròn của mtDNA của sán lá phổi P. ohirai (chủng Kino, Nhật Bản) ……………………………………. 64 Hình 3.3 Mô hình cấu trúc bậc hai của hai gen mã hóa ribosome (MRG) của hệ gen ty thể sán lá phổi P. heterotremus và P. ohirai ……………. 66 Hình 3.4 Mô hình cấu trúc bậc hai suy diễn dự đoán của 22 tRNA trong mtDNA của sán lá phổi P. heterotremus Việt Nam, được sắp xếp theo thứ tự bảng chữ cái của các amino acid mà chúng vận chuyển 67 Hình 3.5 Mô hình cấu trúc bậc hai suy diễn dự đoán của 22 tRNA trong mtDNA của P. ohirai, được sắp xếp theo thứ tự bảng chữ cái của các amino acid mà chúng vận chuyển .............................................. 68 Hình 3.6 Cây phả hệ xác định mối quan hệ loài của sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên phân tích dữ liệu amino acid cộng hợp của 12 PCG ............................................................................................. 79 Hình 3.7 Trật tự sắp xếp gen của phần mã hóa (coding region) của rTU của 6 chủng/5 loài sán lá phổi châu Á ………………………………… 82 Hình 3.8 Mô hình cấu trúc bậc hai của chuỗi gen 18S rRNA của sán lá phổi P. heterotremus và P. ohirai ……….................................................. 88 Hình 3.9 Mô hình cấu trúc bậc hai của chuỗi gen 28S rRNA của sán lá phổi P. heterotremus và P. ohirai ……………………………………… 89 Hình 3.10 Mô hình cấu trúc bậc hai của chuỗi nucleotide vùng giao gen ITS- 1 của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai …………................................................................................ 90 Hình 3.11 Mô hình cấu trúc bậc hai của chuỗi nucleotide vùng giao gen ITS- 2 của sán lá phổi châu Á ………………………………………… 91 Hình 3.12 Cây phả hệ xác định mối quan hệ loài và phả hệ của sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên phân tích chuỗi gen 28S rRNA toàn phần 96 Hình 3.13 Cây phả hệ xác định mối quan hệ loài và phả hệ của sán lá phổi họ Paragonimidae/phân bộ Troglotremata dựa trên phân tích cộng hợp chuỗi gen 18S+28S rRNA toàn phần ………............................ 99
1 MỞ ĐẦU Bệnh sán lá phổi (paragonimiasis) do các loài Paragonimus spp. thuộc họ Paragonimidae gây ra, một trong những bệnh đang tái xuất ở nhiều quốc gia tại châu Á, châu Phi và châu Mỹ, đặc biệt trong cộng đồng dân cư nghèo vùng núi cao, vùng sâu, vùng xa. Có khoảng 23 triệu người mắc bệnh, 292 triệu ở nguy cơ nhiễm. Ở châu Á, sán lá phổi (SLP) phân bố từ Nhật Bản, Hàn Quốc, dọc theo Bắc và Đông-Nam Trung Quốc, vùng Tây-Bắc và miền Trung Việt Nam, Philippin, Thái Lan, Myanmar, Bangladesh, Ấn Độ và Sri Lanka, rất đa dạng về loài, về di truyền và tạo nên các phức hệ (complex) khá phức tạp. Do có sự đa dạng di truyền chủng loài trong các phức hệ rất cao và khó phân biệt hình thái học (HTH) của một số dạng sinh trưởng như trứng và ấu trùng nang (metacercariae), nên việc bổ sung phân loại loài và tiến hóa cần kết hợp thêm dữ liệu sinh học phân tử (SHPT). Điều này đòi hỏi có những áp dụng kỹ thuật và công nghệ chính xác, trong đó có việc tạo dựng và đối chiếu dữ liệu SHPT với HTH. Sán lá phổi thường ký sinh ở phổi tạo thành các ổ áp xe, giống như các hang lao, xét nghiệm cận lâm sàng bằng cách tìm trứng SLP trong đờm, phân hoặc trong dịch màng phổi và môt số phương pháp sinh học, miễn dịch học và SHPT khác. Người bệnh bị giãn phế quản, viêm phổi, đau ngực, ho ra máu, đờm sền sệt màu nâu đỏ. Sán lá phổi có thể gây tử vong do suy nhược cơ thể và những cơn ho ra máu. Một số trường hợp SLP trưởng thành có thể tự động di chuyển từ phổi đến nơi khác (ký sinh lạc chỗ), ở não, có khi ở tủy sống, cơ ngực, hoặc tổ chức dưới da, gan, lách, ổ bụng, tim, gây nên các triệu chứng tại chỗ và toàn thân phức tạp, vì vậy thường rất khó khăn trong chẩn đoán, thậm chí nguy hiểm đến tính mạng bệnh nhân. Chỉ thị phân tử (genetic marker), cũng như kèm theo là các công nghệ thao tác và công cụ phân tích đã góp phần to lớn trong nghiên cứu cơ bản và ứng dụng ở các lĩnh vực chẩn đoán, phân loại, phả hệ và tiến hóa, dịch tễ học phân tử và di truyền quần thể. Trình tự DNA và amino acid suy diễn (nếu có) của hệ gen ty thể (mitochondrial genome, mtDNA) và đơn vị mã hóa ribosome (ribosomal transcription unit, rTU) là nguồn cung cấp chỉ thị phân tử giá trị nhất. Nhu cầu ứng
2 dụng SHPT làm sáng tỏ điều kiện và vị trí phân loại, mối quan hệ về loài/giống/họ/liên họ và phân bộ là rất lớn, đặc biệt với các loài “đồng hình”, loài “đa hình”, các loài “chị em”, loài “lai” và các dạng phát triển của KST cùng hiện diện trong cùng vật chủ. Sự công nhận chính xác mỗi loài/giống/họ là cơ sở tin cậy cho các chương trình phòng chống và kiểm soát chặt chẽ bệnh KST trên thế giới. Cho đến nay, trình tự mtDNA toàn phần hoặc đa phần mới thu nhận được ở 80 đến 90 chủng (của 60–70 loài) sán lá (trematode) và được đăng ký trong cơ sở dữ liệu GOBASE (http://gobase.bcm.umontreal.ca/), hoặc trong Ngân hàng gen (GenBank: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Số lượng rTU toàn phần hoặc đa phần của các loài sán lá còn ít hơn rất nhiều. Dữ liệu mtDNA và rTU của lớp Sán lá còn rất thiếu, chưa bao phủ hoặc đại diện hết tất cả các giống, các họ, kể cả họ Paragonimidae, trong khi đó nhu cầu nghiên cứu đặc điểm gen học mtDNA và rTU, khai thác chỉ thị phân tử của sán lá phổi cho ứng dụng thực tế ở nhiều lĩnh vực là rất lớn. Do vậy, giải trình tự, phân tích và khai thác dữ liệu mtDNA và rTU của SLP họ Paragonimidae (phân bộ Troglotremata) nói riêng và của sán lá nói chung đang được đẩy mạnh. Cho đến khi đề tài này tiến hành, chỉ mới có một vài mtDNA gần/hoàn chỉnh được thu nhận và phân tích từ họ Paragonimidae. Nhu cầu nghiên cứu gen/hệ gen/vùng giao gen của mtDNA và rTU của các loài ở họ Paragonimidae, đặc biệt là các loài SLP châu Á là rất lớn, nhằm phục vụ nghiên cứu và ứng dụng trong chẩn đoán, giám định, dịch tễ học, phân bố, đa dạng sinh học và phòng chống. Xuất phát từ nhu cầu và yêu cầu thực tế nói trên, nhằm bổ sung dữ liệu mtDNA và rTU của một số loài SLP lưu hành tại Việt Nam và châu Á, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hệ gen ty thể, đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và một số khu vực ở châu Á”, với mục tiêu là: “Thu được toàn bộ hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và châu Á, phân tích đặc điểm gen và hệ gen phục vụ nghiên cứu dịch tễ học phân tử và ứng dụng trong chẩn đoán phân loại”.
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae 1.1.1. Phân loại sán lá phổi họ Paragonimidae Giống Paragonimus, họ Paragonimidae, thuộc phân bộ Troglotremata (Platyhelminthes: Trematoda), bao gồm nhiều loài SLP có vai trò dịch tễ quan trọng tạo nên vòng lây nhiễm và bệnh lý đặc trưng ở người và động vật [1]. Cho đến gần đây, xác định phân bộ (suborder) và họ (family) của sán lá phổi mới có được sự nhất trí dùng tên phân bộ là Troglotremata đang được thống nhất hiện nay thay vì tên phân bộ là Xiphidiata trước đây. Tương tự, trước đây Paragonimus chỉ là một giống trong họ Troglotrematidae, nay được tách riêng khỏi họ này trở thành một họ Paragonimidae độc lập (http://ddbj.nig.ac.jp/tx_search/27871?depth=4) [2, 3]. Phân bộ Troglotremata chính thức hiện nay gồm các họ Collyriclidae, họ Nanophyetidae, họ Troglotrematidae và họ Paragonimidae. Giống Paragonimus (trước đây) và nay là họ Paragonimidae bao gồm các loài: Paragonimus africanus; P. caliensis; P. compactus; P. ecuadoriensis; P. heterotremus; P. hueitugensis; P. iloktsuenensis; P. kellicotti; P. mexicanus; P. miyazakii; P. ohirai; P. pulmonalis; P. peruvianus; P. sadoensis; P. skrjabini; P. uterobilateralis và P. westermani. Phân bộ Troglotremata có đến 93 đăng ký loài tại cơ sở dữ liệu UniProt, trong đó ngoài loài chủ yếu, còn có một số loài đồng danh (synonym) và một số loài chưa được phân định cấp loài một cách chính xác (https://www.uniprot.org/taxonomy/116925). Phân loại SLP gặp phải một số khó khăn do có sự đa dạng rất cao các chủng của cùng một loài trong một phức hệ, giữa các quần thể và cả về hình thái ấu trùng metacercaria, về di truyền, sinh học và khả năng gây bệnh [1, 4]. Phân tích SHPT đã khẳng định một số loài là đồng danh, ví dụ, P. iloktsuenensis và P. sadoensis là đồng danh của loài P. ohirai; loài P. hokuoensis và P. microrchis là đồng danh của P. proliferus và P. harinasutai. Một số loài trở thành phân loài, như P. miyazakii được xếp là phân loài P. skrjabini miyazakii, nhưng chưa chính thức. Theo Tóm tắt phân loại có trong Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia ở Mỹ (NCBI) thì hệ thống phân loại của họ Paragonimidae và các giống
4 của chúng (NCBI: Taxonomy: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/) được sắp xếp phân cấp theo Dòng phân loại (lineage), như sau: Tóm tắt Dòng phân loại (lineage): cellular organisms; Eukaryota; Opisthokonta; Metazoa; Eumetazoa; Bilateria; Protostomia; Spiralia; Lophotrochozoa; Platyhelminthes; Trematoda; Digenea; Plagiorchiida; Troglotremata; Paragonimidae; (Paragonimus) (Hình 1.1). Hình 1.1. Sắp xếp dòng phân loại của họ Paragonimidae và các giống trong họ này theo Hệ thống thông tin phân loại tích hợp (ITIS). Nguồn: (https://www.itis.gov/). Phân Bộ Troglotremata Schell, 1980 bao gồm họ Collyriclidae Ward, 1917, họ Nanophyetidae (Dollfus, 1939), họ Paragonimidae Dollfus, 1939 và họ Troglotrematidae, Odhner, 1914; trong đó họ Paragonimidae gồm các loài chủ yếu gây bệnh sán lá phổi (paragonimiasis) do các loài Paragonimus spp. gây nên [1, 3, 5]. Theo Hệ thống thông tin phân loại tích hợp (ITIS, Integrated Taxonomic Information System)/ https://www.itis.gov/), cấp bậc phân loại, vị trí các loài và các giống trong họ Paragonimidae, cũng như sắp xếp của họ Paragonimidae với các họ khác trong ngành Sán dẹt được phân cấp như sau: Giới (Kingdom): Động vật (Animalia) Phân Giới: Bilateria Hạ Giới (Infrakingdom): Protostomia Trên Ngành (Superphylum): Platyzoa Ngành Phylum): Sán dẹt (Platyhelminthes Minot, 1876) Dưới Ngành (Subphylum): Neodermata Ehlers, 1985 Lớp (Class): Sán lá (Trematoda, Rudolphi, 1808) Dưới Lớp (Subclass): Digenea, Carus, 1863 Bộ (Order): Plagiorchiida La Rue, 1957