Luận án Tiến sĩ Sinh học: Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:158

Thêm vào BST

Báo xấu

49
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm ly trích được enzyme XO từ sữa bò và xác định được các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO ly trích được; xác định được một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO; ly trích được một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược; đánh giá được tác dụng của thảo dược có hoạt tính ức chế enzyme XO lên nồng độ acid uric huyết thanh và hoạt tính enzyme XO gan chuột thực nghiệm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TỪ VĂN QUYỀN SÀNG LỌC CÁC THẢO DƯỢC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE ĐỂ GIẢM SỰ TẠO THÀNH ACID URIC LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH 62420201 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TỪ VĂN QUYỀN SÀNG LỌC CÁC THẢO DƯỢC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE ĐỂ GIẢM SỰ TẠO THÀNH ACID URIC LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH 62420201 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHÍNH PGS.TS. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG 2021
LỜI CẢM TẠ Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Đái Thị Xuân Trang, PGS.TS. Nguyễn Minh Chơn và PGS.TS. Nguyễn Trọng Tuân đã dành thời gian quý báu, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đức Độ, TS. Nguyễn Lộc Hiền, TS. Huỳnh Kỳ, PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Nga cùng Quý Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn, khuyến khích và động viên tôi. Xin cảm ơn tất cả các bạn và các em trong phòng thí nghiệm Sinh - Hóa, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học; phòng thí nghiệm Hóa Sinh; phòng thí nghiệm Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Kính gởi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Tự nhiên, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình đào tạo tiến sĩ. Cuối cùng, xin trân trọng biết ơn sâu sắc đến đồng nghiệp, gia đình và người thân đã dành cho tôi tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ để tôi có đủ nghị lực hoàn thành được luận án. Xin trân trọng cảm ơn tất cả. i
TÓM TẮT Giới thiệu: Tăng acid uric không chỉ là nguyên nhân gây ra bệnh gout, mà còn làm tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, sỏi thận, đái tháo đường và các hội chứng chuyển hóa. Acid uric được tạo ra do enzyme xanthine oxidase (XO) xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và oxy hoá xanthine thành acid uric. Việc tìm ra các thảo dược và các hợp chất có nguồn gốc từ thảo dược có tác dụng ức chế enzyme XO đồng thời không gây tác dụng phụ là vấn đề hết sức cần thiết. Mục tiêu: (1) Phân lập được enzyme XO từ nguồn sữa bò của địa phương; (2) đánh giá được khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết 8 thảo dược; (3) phân lập được một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược tiềm năng; (4) đánh giá ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm. Phương pháp thực hiện: Phân lập enzyme XO được thực hiện theo phương pháp kết tủa enzyme bằng ammonium sulfate. Khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết các thảo dược được khảo sát bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 290 nm khi có và không có mẫu thử. Phân lập các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược được thực hiện theo phương pháp chạy sắc ký cột hở. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm được thực hiện bằng phương pháp đưa cao chiết vào cơ thể chuột qua đường uống, sau đó đo nồng độ acid uric trong máu chuột. Chuột được làm tăng acid uric trong máu bằng phương pháp tiêm kali oxonate vào màng bụng. Kết quả cho thấy, enzyme XO được phân lập từ sữa bò có hàm lượng protein là 0,509 mg/mg enzyme thô, enzyme sau khi được phân lập có hoạt tính và hoạt tính riêng lần lượt là 0,2095 U/mg enzyme thô và 0,412 U/mg protein. Điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme XO đã phân lập được xác định ở pH 7,5; 25°C; 0,02 U/mL enzyme XO và 0,15 mM xanthine. Hiệu quả ức chế của allopurinol đối với hoạt tính của enzyme XO đã phân lập và enzyme thương mại là tương đương nhau. Cao ethanol nở ngày, húng chanh, dền gai ức chế enzyme XO yếu. Nồng độ ức chế 50% (IC50) enzyme XO của các cao ethanol cây sương sáo, râu mèo, kinh giới, nở ngày đất và cỏ xước lần lượt là 222±2,65; 143±4,04; 138±1,73; 42,5±2,99 và 17,5±0,1 µg/mL. Chất đối chứng allopurinol có IC50 là 9,24±0,275 µg/mL. Năm hợp chất sạch đã được phân lập từ cao ethanol cỏ xước. Trong đó, hai hợp chất không có hoạt tính ức chế enzyme XO. Ba hợp chất còn lại đã được định danh là quercetin, quercitrin và hesperetin có tác dụng ức chế enzyme XO với IC50 lần lượt là ii
14,6; 37,7 và 103,2 µg/mL. Hợp chất quercitrin ức chế enzyme XO theo kiểu hỗn hợp. Cao ethanol cỏ xước không có tác dụng làm thay đổi nồng độ acid uric trong máu chuột bình thường, làm giảm đáng kể nồng độ acid uric trong máu chuột bệnh (186±2,1; 129,4±15,2 và 128,7±31,9 µmol/L) và làm giảm hoạt tính enzyme XO trong gan chuột tăng acid uric (2,62±0,084; 1,79±0,127 và 1,87±0,075 mM acid uric /phút/g protein) tương ứng với các liều 150; 300 và 450 mg/kg. Nồng độ acid uric trong máu và hoạt tính enzyme XO trong gan chuột bình thường lần lượt là 127,3±38,4 µmol/L và 3,11±0,033 mM acid uric/phút/g protein. Allopurinol có tác dụng làm hạ acid uric trong máu trên cả chuột bình thường và trên chuột bị tăng acid uric. Kết luận: Từ các kết quả đạt được cho thấy, cao ethanol cỏ xước có tác dụng ức chế enzyme XO và làm nồng độ acid uric trong máu chuột bị tăng acid uric xuống mức bình thường. Cần có định hướng sử dụng cây cỏ xước trong phòng trị tăng acid uric trong máu. Từ khóa: acid uric, cỏ xước, quercitrin, xanthine oxidase iii
ABSTRACT Introduction: The elevation of uric acid levels might be the main cause of not only gout but also cardiovascular diseases, kidney stones, diabetes and metabolic disorder. The formation of uric acid is often associated with the oxidation process catalyzed by xanthine oxidase enzyme (XO) in which hypoxanthine can be oxidized to xanthine and then uric acid. The research and exploration of herbs and plant-related substances that perform a potential in inhibiting XO enzyme without causing any negative impacts are critical. The purpose of this study is to (1) extract XO enzyme from local cow’s milk; (2) evaluate XO enzyme inhibitory efficiency of extracts from 8 types of herbs; (3) extract a number of substances that are able to inhibit XO enzyme from potential herbs; (4) evaluate the effects of the extracts from potential herbs on serum-uric acid concentration of experimental mice. Methods: The extraction of XO enzyme was conducted followed by method using ammonium sulfate in order to precipitate enzyme. The inhibitory effect XO of the herbal was determined by spectroscopy at 290 nm. The mixture reaction without sample was used as a blank control. The extraction of substances functionalizing in the XO enzyme inhibition from herbs was performed using a column chromatography. The investigation of impacts of extracts from potential herbs in serum-uric acid concentration was performed by giving mice extracts, and then measuring uric acid concentration in rat blood. Rats had increased uric acid in the blood by injecting potassiumoxonate into the peritoneum. Results: XO enzyme extracted from cow’s milk contains 0.509 mg/mg of raw enzyme. The extracted enzyme activity and specific activity were calculated to be 0.2095 U/mg and 0.412 U/mg protein, respectively. The optimal conditions for the activity of XO enzyme were determined at pH 7.5; 0.02 U/mL enzyme and 0.15 mM xanthine. The inhibitory efficiency of allopurinol versus the activity of the extracted XO enzyme and commercial enzyme was approximate. The ethanol extracts of Gomphrena globosa, Plectranthus amboinicus, Amaranthus spinosus showed a low efficiency in the inhibition of XO enzyme. The half maximal inhibitory concentration (IC50) XO enzyme of ethanol extracts in terms of Mesona chinensis, Orthosiphon stamineus, Elsholtzia ciliata, Gomphrena celosiodes and Achyranthes aspera” were 222±2.65; 143±4.04; 138±1.73; 42.5±2.99 và 17.5 µg/mL, respectively. The positive control allopurinol has the IC50 value of 9.24 µg/mL. Five compounds from ethanol extract of Achyranthes aspera were isolated. Among iv
them, two compounds did not exhibit an XO enzyme inhibitory activity. Three other compounds have been identified as quercetin, quercitrin and hesperetin indicated an effective activity in XO enzyme inhibition in which IC50 values are 14.6; 37.7 and 103.2 µg/mL, respectively. Quercitrin compound inhibited XO enzyme according to mixed type. Achyranthes aspera ethanol-extract did not cause a change in serum-uric acid concentration in normal mouse but significantly reduced the serum-uric acid concentration in mouse model for hyperuricemia (186±2.1; 129.4±15.2 và 128.7±31.9 µmol/L) and XO enzyme activity in increased-uric acid mouse liver corresponding to 150; 300 and 450 mg/kg treatments. The uric acid concentration in blood and XO enzyme activity in normal mouse liver were 127.3±38.4 µmol/L and 3.11±0.033 mM acid uric /min/g protein, respectively. The result illustrated that allopurinol had an effect on releasing serum-uric acid level in terms of either normal mouse or increased-uric acid mouse. In conclusion, Achyranthes aspera ethanol extract efficiently induced an inhibition on XO enzyme and reduced the serum-uric acid concentration in increased-uric acid mouse to a normal threshold. The use of Achyranthes aspera in preventing increased uric acid level in blood should be further investigated. Keywords: Achyranthes aspera, uric acid, quercitrin, xanthine oxidase v
MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ......................................................................................... i TÓM TẮT ............................................................................................. ii ABSTRACT ......................................................................................... iv CAM KẾT KẾT QUẢ .......................................................................... vi MỤC LỤC ........................................................................................... vii DANH SÁCH BẢNG .............................................................................x DANH SÁCH HÌNH ............................................................................ xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................. xiii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .....................................................................1 1.1 Lý do chọn đề tài...................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ............................................................. 1 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................. 1 1.2.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................. 2 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 2 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu ............................................................... 2 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu................................................................... 2 1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 2 1.4.1 Thời gian nghiên cứu ................................................................ 2 1.4.2 Địa điểm nghiên cứu ................................................................. 3 1.5 Những đóng góp mới của đề tài ............................................................... 3 1.6 Ý nghĩa của luận án.................................................................................. 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................4 2.1 Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của enzyme ........................... 4 2.2 Enzyme xanthine oxidase (E.C 1.17.3.2) ................................................. 8 2.2.1 Cấu trúc .................................................................................... 8 2.2.2 Cơ chế hoạt động .................................................................... 11 2.2.3 Thông số động học của enzyme xanthine oxidase ................... 12 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme xanthine oxidase ............................................................................................... 12 2.2.5 Phân lập enzyme xanthine oxidase .......................................... 14 2.3 Xanthine oxidase trong bệnh lý .............................................................. 14 2.3.1 Tăng acid uric máu và gout ..................................................... 14 2.3.2 Tăng acid uric máu và bệnh tim mạch, bệnh thận .................... 15 2.4 Các phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase . 15 2.4.1 Các phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase in vitro ................................................................................... 15 2.4.1.1 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế xanthine oxidase in vitro bằng phương pháp quang phổ ....................................................... 15 2.4.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang . 17 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất ức chế đến nồng độ acid uric trong cơ thể động vật ............................................................ 17 2.5 Các nghiên cứu xác định một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase................................................................................................ 18 2.5.1 Các nghiên cứu thảo dược ức chế enzyme xanthine oxidase trên thế giới ............................................................................................... 18 vii
2.5.2 Các nghiên cứu thảo dược ức chế enzyme xanthine oxidase ở Việt Nam.. 29 2.6 Tổng quan các nguyên liệu trong nghiên cứu......................................... 31 2.6.1 Húng chanh ............................................................................. 31 2.6.2 Kinh giới ................................................................................. 32 2.6.3 Cây râu mèo ............................................................................ 32 2.6.4 Cây sương sáo ......................................................................... 33 2.6.5 Dền gai ................................................................................... 34 2.6.6 Nở ngày .................................................................................. 34 2.6.7 Nở ngày đất............................................................................. 35 2.6.8 Cỏ xước .................................................................................. 36 2.7 Các kỹ thuật ly trích cao chiết ................................................................ 37 2.7.1 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng ........................................................ 37 2.7.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (rắn – lỏng) ..................................... 38 2.8 Các phương pháp phổ nghiệm xác định công thức phân tử các hợp chất 38 2.8.1 Phổ hồng ngoại (IR) ................................................................ 38 2.8.2 Phổ tử ngoại – Khả kiến (UV-VIS) ......................................... 39 2.8.3 Phổ khối lượng (MS) .............................................................. 39 2.8.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ....................................... 39 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………………..45 3.1 Phương tiện nghiên cứu ......................................................................... 41 3.1.1 Nguyên liệu............................................................................. 41 3.1.2 Hóa chất.................................................................................. 41 3.2 Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 41 3.2.1 Chuẩn bị nguồn enzyme xanthine oxidase ............................... 42 3.2.1.1 Phân lập enzyme xanthine oxidase từ sữa bò .......................... 43 3.2.1.2 Xác định hàm lượng protein hòa tan trong hỗn hợp enzyme XO trích được theo phương pháp Folin-Lowry ........................................... 45 3.2.1.3 Xác định sự hiện diện của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập bằng phương pháp điện di SDS-PAGE .................................. 46 3.2.1.4 Xác định hoạt tính của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập... 47 3.2.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên enzyme xanthine oxidase trích được ................................................................................... 48 3.2.1.6 Khảo sát nồng độ xanthine và xanthine oxidase phù hợp cho phản ứng.................................................................................................. 48 3.2.1.7 So sánh hoạt tính của enzyme xanthine oxidase được phân lập từ sữa bò và enzyme xanthine oxidase thương mại .............................. 49 3.2.2 Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của 8 loại thảo dược ............................................................................................ 50 3.2.2.1 Phương pháp trích cao bằng dung môi ethanol 70% ............... 50 3.2.2.2 Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của cao tổng ethanol được chiết từ 8 loại thảo dược .......................................... 51 3.2.2.3 IC50 và cách xác định................................................................. 52 3.2.3 Phân lập hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase53 3.2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của các cao phân đoạn được chiết từ thảo dược tiềm năng .... 53 3.2.3.2 Thí nghiệm 2: Phân lập các chất từ cao phân đoạn ethyl acetate .. 54 viii
3.2.3.3 Cách xác định kiểu ức chế ........................................................ 56 3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm ............................................... 57 3.2.4.1 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric trong máu chuột bình thường ................................................. 57 3.2.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric trong máu chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate58 3.2.4.3 Đánh giá ảnh hưởng của cao ethanol cỏ xước đến hoạt tính enzyme xanthine oxidase gan chuột thí nghiệm ................................... 59 3.3 Phương pháp xử lí thống kê ................................................................... 61 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................62 4.1 Chuẩn bị nguồn enzyme xanthine oxidase ............................................. 62 4.1.1 Phân lập enzyme xanthine oxidase từ sữa bò ........................... 62 4.1.2 Hàm lượng protein hòa tan trong hỗn hợp protein thô ............. 62 4.1.3 Xác định sự hiện diện của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.......................................... 63 4.1.4 Xác định hoạt tính của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập .. 64 4.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên xanthine oxidase trích được ................................................................................................... 64 4.1.6 Khảo sát nồng độ xanthine và xanthine oxidase phù hợp cho phản ứng ..................................................................................................... 65 4.1.7 So sánh hoạt tính của enzyme xanthine oxidase được phân lập từ sữa bò và enzyme xanthine oxidase thương mại.................................. 66 4.2 Khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của 8 loại thảo dược ........... 67 4.2.1 Kết quả trích cao bằng dung môi ethanol 70% ........................ 67 4.2.2 Khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của cao tổng ethanol được chiết từ 8 loại thảo dược............................................................. 67 4.3 Phân lập hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase từ cao ethanol cỏ xước ................................................................................................. 74 4.3.1 Kết quả phân lập các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase từ cao ethanol cỏ xước ............................................. 74 4.3.2 Kiểu ức chế của hợp chất CXQ05 (quercitrin) ......................... 83 4.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm ........................................................................... 84 4.4.1 Ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric trong máu chuột bình thường .............................................................. 84 4.4.2 Ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric trong máu chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate. ............. 86 4.4.3 Ảnh hưởng của cao ethanol Cỏ xước đến hoạt tính enzyme xanthine oxidase gan chuột thí nghiệm ............................................... 89 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................91 5.1 Kết luận .................................................................................................. 91 5.2 Đề xuất ................................................................................................... 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................1 PHỤ LỤC .............................................................................................13 ix
DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Tổng hợp một số thảo dược trên thế giới có khả năng ức chế enzyme XO ................................................................................................ 20 Bảng 2.2: Sự ức chế XO bởi các loại flavonoid ................................. 22 Bảng 2.3: Khả năng ức chế enzyme XO của các flavonoid được phân lập từ hoa của Chrysanthemum sinense ........................................................... 25 Bảng 2.4: Các hợp chất ức chế enzyme XO phân lập được từ thảo dược... 27 Bảng 2.5: Một số thảo dược ở Việt Nam có khả năng ức chế enzyme XO.. 30 Bảng 2.6: Thành phần trong cây nở ngày đất (Sharma et al., 2011) .... 36 Bảng 3.1: Bảng xây dựng đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry . 46 Bảng 3.2: Bố trí hỗn hợp phản ứng trong từng giếng .......................... 52 Bảng 4.1: Hiệu quả ức chế enzyme XO của AP ................................. 67 Bảng 4.2: Kết quả sấy các mẫu ở 60°C và trích cao ethanol ............... 67 Bảng 4.3: Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây nở ngày, húng chanh và dền gai ................................................................................ 68 Bảng 4.4: Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây sương sáo, râu mèo và kinh giới ................................................................................... 69 Bảng 4.5: Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây nở ngày đất và cây cỏ xước ........................................................................................... 71 Bảng 4.6: Giá trị IC50 của các thảo dược khảo sát .............................. 73 Bảng 4.7: Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết cỏ xước và của AP74 Bảng 4.8 Giá trị IC50 của các hợp chất ............................................... 76 Bảng 4.9: So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CXQ02 với phổ 1H-NMR và 13C-NMR của quercetin ................................................... 77 Bảng 4.10: So sánh dữ liệu phổ của CXQ03 và hesperetin ................. 79 Bảng 4.11: So sánh dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất CXQ05 với quercitrin ................................................................................................... 82 Bảng 4.12: Độ hấp thu tia UV (290 nm) của dung dịch xanthine ........ 83 Bảng 4.13: Ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric trong máu chuột bình thường ............................................................... 85 Bảng 4.14: Ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric trong máu chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate ............... 87 Bảng 4.15: Ảnh hưởng của cao ethanol cỏ xước đến hoạt tính enzyme XO gan chuột thí nghiệm ........................................................................... 89 x
DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Kiểu ức chế cạnh tranh ......................................................... 4 Hình 2.2: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế cạnh tranh. ............ 5 Hình 2.3: Kiểu ức chế kháng cạnh tranh............................................... 6 Hình 2.4: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế kháng cạnh tranh .. 6 Hình 2.5: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế hỗn hợp ................ 7 Hình 2.6: Kiểu ức chế không cạnh tranh .............................................. 8 Hình 2.7: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế không cạnh tranh .. 8 Hình 2.8: (A) Cấu trúc tổng thể của enzyme XO được phân lập từ sữa bò; (B) Sự sắp xếp và khoảng cách giữa những trung tâm hoạt động oxy hóa–khử của một đơn phân ......................................................................................... 9 Hình 2.9: Cấu trúc của một cụm [2Fe-2S] .......................................... 10 Hình 2.10: Các thành phần trong tâm hoạt động của enzyme XO được phân lập từ sữa bò ...................................................................................... 11 Hình 2.11: Cơ chế của xúc tác tạo thành acid uric của XO ............... 12 Hình 2.12: Cấu trúc phân tử acid caffeic (A), vinyl caffeate (B) và apigenin (C) .............................................................................................. 21 Hình 2.13: Cấu trúc phân tử của quercetine (A) và kaempferol (B) .... 21 Hình 2.14: Cấu trúc phân tử của cinnamaldehyde .............................. 23 Hình 2.15: Cấu trúc phân tử của hydroxychavicol ............................. 24 Hình 2.16: Cấu trúc phân tử của nudibaccatumin A (1), nudibaccatumin B (2) và neotaiwanensol B (3) .................................................................... 24 Hình 2.17: Cấu trúc phân tử của tetrahydroxymentoflavone ............... 24 Hình 2.18: Cấu trúc phân tử của các flavonoid được phân lập từ hoa của Chrysanthemum sinense ............................................................................ 25 Hình 2.19: Cấu trúc phân tử của riparsaponin .................................... 26 Hình 2.20: Cấu trúc phân tử của acid rosmarinic (A) và methyl rosmarinate (B) .......................................................................................... 26 Hình 2.21: Cây húng chanh ................................................................ 31 Hình 2.22: Cây kinh giới .................................................................... 32 Hình 2.23: Cây râu mèo ..................................................................... 32 Hình 2.24: cây sương sáo ................................................................... 33 Hình 2.25: Cây dền gai ...................................................................... 34 Hình 2.26: Cây nở ngày ..................................................................... 34 Hình 2.27: Cây nở ngày đất................................................................ 35 Hình 2.28: Cây cỏ xước ..................................................................... 36 xi
Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu chung của toàn luận án ...…….…………42 Hình 3.2: Sữa bò dùng để phân lập enzyme XO ................................. 43 Hình 3.3: Thẩm tích ........................................................................... 44 Hình 3.4: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập enzyme XO ..................... 45 Hình 3.5: Quá trình chiết lỏng-lỏng các cao phân đoạn ...................... 53 Hình 3.6: Sơ đồ tóm tắt quá trình điều chế cao các phân đoạn cây cỏ xước. .......................................................................................................... 54 Hình 3.7: Sắc ký cột phân đoạn ethyl acetate ..................................... 55 Hình 3.8: Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate. ............................................ 59 Hình 4.1: Enzyme xanthine oxidase được phân lập từ sữa bò Hình 4.2: Sự phụ thuộc của độ hấp thu quang phổ vào nồng độ dung dịch protein chuẩn .............................................................................................. 63 Hình 4.3: Kết quả điện di SDS-PAGE của enzyme XO được phân lập từ sữa bò và enzyme thương mại. ................................................................... 63 Hình 4.4: Hoạt tính của enzyme XO ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau ........................................................................................................... 64 Hình 4.5: Đường chuẩn acid uric ....................................................... 65 Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ xanthine và enzyme XO đến hiệu suất phản ứng hình thành acid uric......................................... 66 Hình 4.7: Đồ thị tuyến tính khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây cỏ xước, nở ngày đất, râu mèo, kinh giới và sương sáo ........................ 71 Hình 4.8: Khả năng ức chế enzyme XO của 8 loại cao chiết .............. 73 Hình 4.9: Sơ đồ tóm tắt quá trình phân lập chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ cao ethanol cỏ xước ............................................................ 75 Hình 4.10: Hợp chất CXQ02 (quercetin) ............................................ 77 Hình 4.11: Hợp chất CXQ03 (hesperetin) .......................................... 80 Hình 4.12: Công thức phân tử hợp chất CXQ05 (quercitrin) .............. 81 Hình 4.13: Đồ thị biểu diễn 1/V0 theo 1/[S] với các nồng độ khác nhau của hợp chất CXQ05 (quercitrin)................................................................ 84 xii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AP: allopurinol BSA: bovine serum albumin CMC-Na: natri carboxymetyl cellulose CPK: Corey – Pauling – Koltun DEAE: Diethylaminoethyl EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid IC50: Inhibition concentration of 50% NT: Nghiệm thức PMSF: Phenylmethylsulfonyl fluoride SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis XO: xanthine oxidase xiii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Lý do chọn đề tài Enzyme xanthine oxidase (XO) là một phức hợp metallo-flavoenzyme xúc tác hai bước cuối trong quá trình phân giải purine, cụ thể là biến đổi hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành acid uric (Hille, 2006). Nồng độ acid uric trong máu cao là nguyên nhân dẫn đến một số bệnh. Bệnh gout (Thống phong) là biểu hiện lâm sàng của tình trạng tăng acid uric máu, với sự tạo thành các tinh thể acid uric, đặc biệt là ở các khớp (Smalley et al., 2000; Kasper et al., 2015). Bên cạnh đó, tăng acid uric trong máu thường kèm theo tăng nguy cơ mắc các bệnh như tim mạch, sỏi thận, đái tháo đường và các hội chứng chuyển hóa khác (Nakanishi et al., 1999). Ngoài ra, hoạt động của enzyme XO cũng là nguyên nhân dẫn tới sự tạo ra nhiều gốc tự do có hại cho cơ thể (Cotelle, 2001; Van et al., 2002). Những bệnh có liên quan đến tăng acid uric trong máu đang khá phổ biến và có chiều hướng gia tăng trên thế giới (Li et al., 2017; Naz et al., 2021). Ức chế enzyme XO là mục tiêu căn bản trong việc điều trị tăng acid uric trong máu (Terkeltaub, 2003; Pacher et al., 2006). Các thảo dược, các hợp chất từ tự nhiên có hoạt tính ức chế enzyme XO ngày càng được quan tâm vì tính an toàn và hiệu quả trong việc phòng trị tăng acid uric trong máu. Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã được thực hiện nhằm mục đích tìm kiếm các thảo dược, các hợp chất thiên nhiên có khả năng ức chế enzyme XO (Agustin et al., 2013; Thiombiano et al., 2014; Xu et al., 2014). Ở Việt Nam cũng có một số nghiên cứu tìm kiếm những thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO (Nguyen et al., 2004; Hoàng thị Thanh Thảo và ctv, 2013). Tuy nhiên, Việt Nam có nguồn thảo dược dồi dào (Đỗ Tất Lợi, 2014). Nhiều thảo dược có tiềm năng vẫn chưa được khảo sát về khả năng ức chế enzyme XO. Vì vậy, đề tài “Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric” được thực hiện nhằm xác định thêm một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO. 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu Đề tài được thực hiện nhằm đạt được các mục tiêu sau: - Phân lập được enzyme XO từ sữa bò và xác định được các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO phân lập được. - Xác định được một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO. 1
- Phân lập và xác định được cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược. - Đánh giá được tác dụng của thảo dược có hoạt tính ức chế enzyme XO lên nồng độ acid uric trong máu và hoạt tính enzyme XO gan chuột thực nghiệm. 1.2.2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện với 4 nội dung chính như sau: (1) Nội dung 1: Chuẩn bị nguồn enzyme XO từ sữa bò. (2) Nội dung 2: Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO in vitro của 8 loại thảo dược. (3) Nội dung 3: Phân lập một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược. (4) Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm. 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là enzyme XO; 8 loại thảo dược bao gồm: Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.), kinh giới (Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyl.), cây râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.), cây sương sáo (Mesona chinensis Benth.), dền gai (Amaranthus spinosus L.), nở ngày (Gomphrena globosa L.), nở ngày đất (Gomphrena celosiodes Mart.) và cỏ xước (Achyranthes aspera L.); động vật được sử dụng trong nghiên cứu là chuột nhắt trắng Mus musculus var. Albino. 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu phương pháp phân lập enzyme XO từ nguồn sữa bò ở trường Đại học Cần Thơ, xác định các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO như pH, nhiệt độ, nồng độ xanthine và nồng độ enzyme XO; khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol 8 loại thảo dược; phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược tiềm năng; khảo sát ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm. 1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 1.4.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 03 năm 2016 đến tháng 11 năm 2018 2
1.4.2 Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh-Hoá, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học; phòng thí nghiệm Sinh học; phòng thí nghiệm Hóa học thuộc Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ. 1.5 Những đóng góp mới của đề tài Đề tài đã có một số đóng góp mới như sau: - Phân lập được enzyme XO từ nguồn sữa bò địa phương có hoạt tính tương đương với hoạt tính của enzyme thương mại. Các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO đã được xác định. - Khảo sát được khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết 8 loại thảo dược ở đồng bằng sông Cửu Long. Cao chiết ethanol cỏ xước là một đối tượng mới đã được chứng minh có tác dụng ức chế enzyme XO và làm nồng độ acid uric trong máu chuột bị tăng acid uric xuống đạt mức bình thường. Đề tài đã phân lập được 3 hợp chất có khả năng ức chế enzyme XO từ cây cỏ xước. Trong đó, quercitrin có hoạt tính ức chế khá mạnh enzyme XO (IC50 = 37,7 µg/mL). 1.6 Ý nghĩa của luận án Luận án đã mang lại ý nghĩa về mặt khoa học là tạo được cơ sở khoa học về khả năng ức chế enzyme XO của 8 loại thảo dược bao gồm: Húng chanh, kinh giới, cây râu mèo, cây sương sáo, dền gai, nở ngày, nở ngày đất và cỏ xước. Luận án còn có một ý nghĩa đặc biệt là chứng minh được cao ethanol cỏ xước có hoạt tính ức chế enzyme XO mạnh và có tác dụng làm nồng độ acid uric trong máu chuột bị tăng acid uric giảm xuống đạt mức bình thường. Từ đó, luận án đã mang lại ý nghĩa về mặt thực tiễn là đã gợi ý hướng ứng dụng cây cỏ xước trong phòng trị tăng acid uric trong máu. 3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của enzyme Phương trình động học enzyme là phương trình Michaelis-Menten: V = Vmax [S]/(Km + [S]) V là vận tốc phản ứng, [S] là nồng độ cơ chất. Km là hằng số Michaelis-Menten đặc trưng cho mỗi enzyme. Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn. Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis-Menten là ở chỗ nó chính là giá trị của nồng độ cơ chất khi tốc độ phản ứng bằng nửa tốc độ tối đa (Vmax) (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2009). Phương trình Michaelis-Menten có dạng đường cong. Năm 1934, trên cơ sở của phương trình Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk đã nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng. 1 K 1 1 Phương trình Lineweaver-Burk:  m   có dạng: V0 Vmax [ S ] Vmax y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối với việc nghiên cứu ức chế enzyme. Chất ức chế là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzyme không còn khả năng xúc tác biến cơ chất thành sản phẩm. Nó có thể là chất ức chế thuận nghịch hay bất thuận nghịch. Ức chế thuận nghịch (reversible inhibition) có thể là cạnh tranh (competitive), không cạnh tranh (uncompetitive) hay hỗn hợp (mixed). Ức chế cạnh tranh (competitive) Chất ức chế cạnh tranh trực tiếp vào tâm hoạt động của enzyme được gọi là chất ức chế cạnh tranh. Những chất ức chế này thường có cấu trúc giống với cơ chất và làm giảm lượng enzyme tự do (Hình 2.1). Enzyme Cơ chất Chất ức chế Hình 2.1: Kiểu ức chế cạnh tranh E: enzyme; S: cơ chất; I: chất ức chế; P: sản phẩm 4
Phương trình Lineweaver- Burk khi có chất ức chế cạnh tranh: 1 K m 1 1    (1) V0 Vmax [ S ] Vmax [I ]   1 KI Với [I] là nồng độ của chất ức chế cạnh tranh. KI là hằng số thể hiện ái lực của chất ức chế và enzyme. Dựa vào phương trình (1) ta thấy: nếu nồng độ cơ chất lớn, nồng độ chất ức chế thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất ức chế. Đồ thị Lineweaver-Burk biểu thị sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất khi có chất ức chế cạnh tranh được trình bày trong Hình 2.2. Hình 2.2: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế cạnh tranh. Kiểu ức chế cạnh tranh làm cho giá trị Km tăng nhưng giá trị Vmax không thay đổi. Đồ thị Lineweaver-Burk cho thấy đường thẳng có nồng độ chất ức chế càng cao thì có độ xiên càng lớn. Các đường thẳng không có chất ức chế và có chất ức chế cắt trục tung ở một điểm là 1/Vmax. Phần lớn các chất ức chế cạnh tranh và cơ chất có sự tương đồng về mặt hóa học. Trường hợp đặc biệt của ức chế cạnh tranh là ức chế bằng sản phẩm. Trường hợp này xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzyme và choán vị trí hoạt động của phân tử enzyme. Ức chế không cạnh tranh (uncompetitive) Ức chế không cạnh tranh là kiểu ức chế mà chất ức chế bám trực tiếp vào phức hợp enzyme-cơ chất nhưng không bám vào enzyme tự do (Hình 2.3). 5