Luận án Tiến sĩ Sinh học: Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng Lilium có khả năng chịu nóng

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:149

Thêm vào BST

Báo xấu

101
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là sử dụng các phương pháp công nghệ sinh học bao gồm công nghệ nuôi cấy mô tế bào và công nghệ gen vào việc đánh giá và chọn tạo các dòng hoa Lilium spp. có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ cao.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng Lilium có khả năng chịu nóng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÙI THỊ THU HƯƠNG ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN VÀ TẠO DÒNG LILIUM CÓ KHẢ NĂNG CHỊU NÓNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Bùi Thị Thu Hương ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN VÀ TẠO DÒNG LILIUM CÓ KHẢ NĂNG CHỊU NÓNG Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 62 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Lê Trần Bình Viện Công nghệ sinh học 2. PGS.TS. Trịnh Khắc Quang Viện Nghiên cứu Rau quả Hà Nội, 2015
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 1 tháng 8 năm 2015 Tác giả Bùi Thị Thu Hương i
Lời cám ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình và PGS.TS. Trịnh Khắc Quang đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ Sinh học cùng lãnh đạo, cán bộ nghiên cứu của phòng Công nghệ Tế bào thực vật và phòng Công nghệ ADN ứng dụng của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam và bộ môn Công nghệ sinh học, viện Nghiên cứu Rau Quả đã tạo điều kiện cho tôi được tiến hành đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, lãnh đạo và cán bộ thuộc bộ môn Thực vật, khoa Nông học, bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày 1 tháng 8 năm 2015 Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thu Hương ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU STT Ký hiệu Chữ viết tắt 1 A. rhizogenes Agrobacterium rhizogenes 2 A. rubi Agrobacterium rubi 3 A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens 4 ADN Acid Deoxirionucleic 5 AS Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) 6 BA 6-benzyl adenine 7 Bp Base pair 8 CaMV Cailiflower Mosaic Virus 9 Car Carbenicillin 10 Cefo Cefotaxime 11 Chloram Chloramphenicol 12 CodA Choline oxidase 13 CS Cộng sự 14 CT Công thức 15 ĐC Đối chứng 16 E. coli Escherichia coli 17 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid 18 Et al Đồng tác giả 19 EtBr Ethidium Bromid 20 GB Glycine betaine 21 Genta Gentamycine 22 GFP Green Fluorescent Protein 23 GUS β-1,4-Glucuronidase 24 Hpt Hygromycine Phosphotransferase 25 HSF Heat shock factor 26 HSPs Heat shock proteins 27 Hygr Hygromycine resistant iii
STT Ký hiệu Chữ viết tắt 28 ISSR Inter Simple Sequence Repeat 29 Kana Kanamycine 30 LB Luria Bertani 31 M Thang Marker chuẩn 32 MAS Marker assisted selection 33 MDA Malondialdehyde 34 Mm Millimolar 35 MS Murashige and Skoog, 1962 36 MT-sHSP Mitochondrial small Heat shock protein 37 MUG 4-methyl-umBelliferyl-β-D-glucoronide 38 µl micro litte 39 µM Micromolar 40 NptII Neomycin Phosphotransferase II 41 PCR Polymerase Chain Reaction 42 Pic Picloram 43 QTL Quantitative trait loci 44 RAPD Random Amplified Polymorphic AND 45 Rifa Rifamycine POD Peroxidase 46 SOD Superoxide dismutase 47 T-ADN Transfer-ADN 48 TAE Tris-acetate-EDTA 49 Ti-plasmid Tumor inducing Plasmid 50 TP Transit Peptide 51 Vir Virulence 52 WT Dòng không chuyển gen 53 X – Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucoronide 54 α-NAA 1- Naphthaleneacetic acid iv
MỤC LỤC Trang Lời cam đoan .............................................................................................................. i Lời cám ơn .................................................................................................................ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ........................................... iii MỤC LỤC .................................................................................................................. v DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. viii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... x MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 3 1.1. Tổng quan về cây lily ..................................................................................... 3 1.1.1. Giới thiệu chung về lily.................................................................................... 3 1.1.2. Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật học cây lily ................................... 3 1.1.3. Lịch sử phát hiện và tình hình hiện tại của ngành trồng hoa lily ..................... 4 1.1.4. Điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho cây lily và khả năng chịu nóng của cây lily .............................................................................................................. 5 1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật ................................................... 6 1.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật........................................................ 6 1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến cây lily......................................................... 8 1.2.3. Biện pháp tăng cường tính chịu nhiệt ở thực vật và lily .................................. 9 1.3. Glycine betaine và kỹ thuật làm tăng cường khả năng chịu nóng ở thực vật .......................................................................................................... 15 1.3.1. Giới thiệu chung về glycine betaine .............................................................. 15 1.3.2. Chuyển gen codA tăng cường khả năng chống chịu cho cây trồng ............... 16 1.4. Thành tựu tạo giống lily mới bằng công nghệ tế bào và công nghệ gen......................................................................................................... 17 1.4.1. Công nghệ tế bào trong tạo giống lily ............................................................ 17 1.4.2. Tình hình ứng dụng công nghệ gen trong tạo giống lily................................ 18 v
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21 2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 21 2.1.1. Thực vật........................................................................................................... 21 2.1.2. Các chủng vi khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng ............................................ 22 2.1.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................ 24 2.1.4. Máy móc và thiết bị......................................................................................... 25 2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 25 2.2.1. Các phương pháp sử dụng trong đánh giá vật liệu nghiên cứu ...................... 25 2.2.2. Phương pháp tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng bằng lai tạo và cứu phôi .......................................................................................................... 27 2.2.3. Phương pháp tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng bằng kỹ thuật gen ......................................................................................................... 30 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu.............................................................................. 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................. 37 3.1. Đánh giá tập đoàn các giống lily nghiên cứu ............................................. 37 3.1.1. Đánh giá quan hệ di truyền các giống lily nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử ............................................................................................................ 37 3.1.2. Đánh giá khả năng tái sinh in vitro của một số giống lily nghiên cứu ...... 39 3.1.3. Ngưỡng chịu nóng in vitro của một số giống lily nghiên cứu ....................... 41 3.2. Tạo dòng lily có khả năng chịu nóng bằng lai tạo và cứu phôi................ 44 3.2.1. Kiểm tra chất lượng hạt phấn của một số giống hoa lily nghiên cứu ............ 44 3.2.2. Lai tạo và cứu phôi ......................................................................................... 45 3.2.3. Bước đầu xác định con lai bằng chỉ thị phân tử ............................................. 48 3.4.4. Khả năng chịu nhiệt cao của mô vảy củ của các dòng lily lai được tạo ra ............................................................................................................... 53 3.3. Tạo dòng lily có khả năng chịu nóng bằng công nghệ gen ....................... 55 3.3.1. Thiết kế vector chuyển gen chứa gen codA mã hóa choline oxydase ............ 55 3.3.2. Tối ưu hóa qui trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily bằng A. tumefaciens................................................................................................. 62 vi
3.3.3. Chuyển gen codA mã hóa choline oxydase vào lily....................................... 71 3.3.4. Khả năng chịu nóng các dòng lily chuyển gen .............................................. 73 3.3.5. Khả năng tích lũy glycine betaine ở một số dòng lily chuyển gen codA ....... 77 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................ 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 91 1. Kết luận ................................................................................................................ 91 2. Đề nghị .................................................................................................................. 92 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ ................. 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 95 SUMMARY ........................................................................................................... 112 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 115 vii
DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1. Danh sách tên và ký hiệu giống lily (Lilium spp.) sử dụng.................21 Bảng 2.2. Các cặp mồi đặc hiệu cho 2 gen TP-codA-cmyc và codA-cmyc ........23 Bảng 2.3. Tên và trình tự các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu ..................23 Bảng 2.4. Tên và trình tự các mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu ....................23 Bảng 2.5. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn .............................................................24 Bảng 2.6. Môi trường nuôi cấy và chọn lọc cây lily chuyển gen ........................24 Bảng 3.1. Hệ số tương đồng di truyền giữa 13 giống lily nghiên cứu ................37 Bảng 3.2. Sự phát sinh hình thái và cảm ứng tạo củ từ lát cắt vảy củ các giống lily sau 4 tuần nuôi cấy..............................................................40 Bảng 3.3. Tỷ lệ hữu dục và tỷ lệ nảy mầm của hạt phấn các giống lily nghiên cứu ...........................................................................................44 Bảng 3.4. Tỷ lệ tạo quả sau thụ phấn của các tổ hợp lai .....................................46 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA tới tỷ lệ nảy mầm và tạo củ in vitro từ hạt lai được tách ra từ lát cắt quả non .......................................................47 Bảng 3.6. Khả năng sống sót và khả năng tái sinh củ của lát cắt vảy củ 3 dòng lily lai và các dòng bố mẹ sau xử lý nhiệt (37oC ± 1oC, 13 ngày) ....................................................................................................54 Bảng 3.7. Tên và trình tự đoạn mồi nhân đoạn promoter HSP18.2 của A. thaliana.............................................................................................57 Bảng 3.8. Kết quả chuyển gen codA vào thuốc lá nhờ A. tumefaciens ...............60 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của Cefotaxime đến sự tái sinh củ của lát cắt vảy củ đã biến nạp ......................................................................................64 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hygromycine đến khả năng sống của củ lily in vitro .................................................................................................65 Bảng 3.11. Khả năng chuyển gen của các chủng A. tumefaciens vào lát cắt vảy củ lily ............................................................................................66 viii
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn tới hiệu quả chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily...........................................................................67 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen vào lily ..........................................................................................67 Bảng 3.14. Khả năng nhận các cấu trúc gen ở 3 giống lily nghiên cứu ................71 Bảng 3.15. Khả năng sống sót của các dòng lily chuyển gen in vitro sau xử lý nhiệt (37 oC ± 1oC, 13 ngày) ..........................................................74 Bảng 3.16. Khả năng sống sót của mô vảy củ in vitro của 8 dòng lily chuyển gen sau xử lý nhiệt (37 oC ± 1oC, 13 ngày)............................75 Bảng 3.17. Khả năng sống sót tạo củ in vitro của lát cắt vảy củ của một số dòng lily chuyển gen sau xử lý nhiệt (37 oC ± 1oC, 13 ngày) .............76 Bảng 3.18. Mối quan hệ sự tích lũy glycine betain trong lá và một số đặc điểm khác của một số dòng lily in vitro ..............................................77 ix
DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR 13 giống lily với mồi ISSR 8 (A), mồi ISSR 52 (B) ..................................................................................37 Hình 3.2. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa 13 giống lily .......38 Hình 3.3. Tỷ lệ sống sót của các giống khi nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC ± 1oC ......42 Hình 3.4. Tỷ lệ sống sót của các giống khi nuôi cấy ở nhiệt độ 42oC ± oC .......43 Hình 3.5. Sự tạo củ lily in vitro từ lát cắt vảy củ(A) và khả năng sống của củ lily in vitro trong điều kiện nhiệt độ cao(B) ...................................44 Hình 3.6. Hạt phấn bắt màu thuốc nhuộm (A) và hạt phấn nảy mầm (B) ..........45 Hình 3.7. Sự cứu phôi bằng phương pháp nuôi cấy lát cắt bầu nhụy (A); nuôi cấy phôi (B) .................................................................................47 Hình 3.8. Sản phẩm PCR với mồi RAPD của các cặp bố mẹ và dòng con lai .........................................................................................................49 Hình 3.9. Sản phẩm PCR với mồi ISSR 51(A) và ISSR 55(B) của tổ hợp Sor, Bel và 134 ....................................................................................50 Hình 3.10. Sản phẩm PCR với mồi ISSR 7 (a) và ISSR 55 (b) của tổ hợp Sor và L; L và F và các con lai ....................................................................51 Hình 3.11. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa con lai và dòng bố mẹ .........53 Hình 3.12. Ảnh điện di sản phẩm pBI121/35S-TP-codA-cmyc, pBI121/35S- codA-cmyc và pCAMBIA1301 sau khi cắt bởi enzym giới hạn HindIII, EcoRI (A) và sản phẩm tinh sạch các đoạn gen (B) ...............55 Hình 3.13. Sơ đồ vùng T- DNA của pCAMBIA1301 tái tổ hợp chứa gen codA được điều khiển bởi promoter 35S CAMV ...............................56 Hình 3.14. Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của các khuẩn lạc A. tumefaciens ..........................................................................................57 Hình 3.15. Kết quả nhân đoạn (A) và tinh sạch (B) promoter HSP18.2 ...............58 x
Hình 3.16. Sản phẩm cắt vector pCAMBIA1301/35S-TP-codA-cmyc/35S- GUS-Nos, promoter HSP18.2 bằng enzyme giới hạn HindIII, XbaI (A) và sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu(B) .............59 Hình 3.17. Sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt gen codA trong cây thuốc lá ........61 Hình 3.18. Chồi thuốc lá in vitro chuyển gen codA-cmyc (A ) và TP- codAcmyc (B) khi được xử lý X-gluc..................................................61 Hình 3.19. Hình ảnh điện di protein ở các dòng thuốc lá chuyển gen codA .........61 Hình 3.20. Cây thuốc lá trước (A) và sau (B) xử lý nhiệt (37 oC ± 1 oC, 21 ngày) .........62 Hình 3.21. Sự tái sinh củ in vitro từ lát cắt vảy củ lily đã biến nạp sau 4 tuần nuôi cấy .......................................................................................64 Hình 3.22. Củ lily in vitro trong môi trường có hygromycine sau 4 tuần nuôi cấy ...............................................................................................64 Hình 3.23. Sự biểu hiện tạm thời gen GUS của lát cắt vảy củ sau biến nạp ........69 Hình 3.24. Sự biểu hiện gen GUS ở cây lily in vitro 8- 12 tuần tuổi ....................69 Hình 3.25. Các bước chuyển gen thông qua A. tumefaciens vào lát cắt vảy củ lily in vitro ......................................................................................69 Hình 3.26. Quy trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily thông qua vi khuẩn A. tumefaciens hiệu quả cao ................................................................70 Hình 3.27. Sự hình thành và phát triển củ lily in vitro của vảy củ được biến nạp tổ hợp gen đích (gồm gen kháng hygromycin, gen GUS và gen codA) ...............................................................................72 Hình 3.28. Cây lily in vitro được chuyển tổ hợp gen đích (gồm gen kháng hygromycine, gen GUS và gen codA) bắt màu với thuốc nhuộm X-gluc ..................................................................................................72 Hình 3.29. Ảnh điện di sản phẩm RT – PCR mẫu lily với mồi đặc hiệu gen codA (A) và gen TP-codA (B)..............................................................73 xi
1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, nhu cầu thưởng thức hoa và cây cảnh của con người ngày càng được chú trọng. Lily (tên khoa học là Lilium, thuộc họ Liliaceae) là một trong những loài hoa đẹp và có giá trị kinh tế cao. Hoa lily có kiểu dáng sang trọng, màu sắc quyến rũ, hoa thơm, lâu tàn, dễ thu hoạch, dễ bảo quản, dễ vận chuyển và được ưa chuộng ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, cây lily có phổ trồng hẹp, do có xuất xứ ở những vùng ôn đới có nhiệt độ thấp và độ ẩm cao. Bên cạnh đó, hiện nay khí hậu toàn cầu đang ngày càng biến đổi, nhiệt độ tăng lên ảnh hưởng đến nhiều loại cây trồng, làm giảm năng suất cũng như khả năng sinh trưởng và phát triển, thậm chí khiến cây chết là một thách thức lớn cho ngành trồng hoa này. Nước ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới, nên ở khu vực phía bắc chỉ mới bước đầu trồng thử nghiệm một số giống lily vụ đông. Hơn nữa, sự thay đổi khí hậu cùng sự nóng lên toàn cầu làm cho việc trồng cây hoa lily này vốn trước đây đã khó lại càng gặp nhiều trở ngại. Các cây hoa lily sinh trưởng, phát triển kém ở điều kiện nhiệt độ cao, thể hiện ở chất lượng cây kém, đặc biệt là hoa xấu, dẫn tới năng suất cũng như chất lượng cây hoa thấp. Chính vì vậy, việc cải tiến, tạo cây giống mới có năng suất và chất lượng cao, đặc biệt là có khả năng sinh trưởng, phát triển ở điều kiện nhiệt độ cao là nhiệm vụ cấp bách với các nhà nghiên cứu (Đặng Văn Đông, 2010). Với nhiều phương pháp hiện đại đang được áp dụng, nhiều giống cây trồng nói chung, cây hoa nói riêng hiện nay đang được phát triển một cách chủ động. Trong chọn tạo giống hoa lily, lai xa là một phương pháp truyền thống đang được kết hợp với một số kỹ thuật hiện đại có thể tạo giống mới đạt được nhiều mục đích khác nhau thông qua việc tái tổ hợp vật chất di truyền của các dòng bố mẹ (VanTuyl et al., 1991,2003; Chi, 2002). Bên cạnh đó, giống hoa lily cũng ngày càng được làm phong phú hơn nhờ tiến hành kỹ thuật chuyển gen. Gen codA mã hóa choline oxidase, tham gia sinh tổng hợp glycin betaine đã được chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng và được chứng minh là cây chuyển gen ít nhiều có khả năng
2 chống chịu các điều kiện môi trường bất lợi. Ví dụ như cây Arabidopsis thaliana chuyển gen codA đã được tăng cường khả năng chịu nóng, lạnh và băng giá (Alia et al., 1998; Sakamoto et al., 2000), cây cải bẹ, bạch đàn, cà chua chuyển gen codA cũng tăng cường khả năng chịu mặn và oxy hóa (Prasad et al., 2000a; Ahma et al., 2008; Yu et al., 2009). Ở cây lily, việc chuyển một gen nhằm tăng cường khả năng chịu nóng chưa được thực hiện từ trước đến nay. Chính vì vậy, việc chuyển gen codA vào lily nhằm tăng cường khả năng chống chịu với những điều kiện bất lợi, đặc biệt là nhiệt độ cao là điều cần thiết. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng Lilium có khả năng chịu nóng” làm tiền đề cho việc tạo ra các giống hoa lily mới có khả năng chống lại các điều kiện bất thuận của môi trường. Đề tài được thực hiện với các nội dung gồm: (i) Đánh giá nguồn gen lily nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử và công nghệ nuôi cấy mô tế bào; (ii) Tạo dòng lily mới có khả năng chịu nhiệt bằng lai tạo và cứu phôi; (iii) Tạo dòng lily mới có khả năng chịu nhiệt bằng xây dựng và tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily thông qua A. tumefaciens; (iv) Chọn dòng lily in vitro có khả năng chịu nóng. Mục tiêu của đề tài là sử dụng các phương pháp công nghệ sinh học bao gồm công nghệ nuôi cấy mô tế bào và công nghệ gen vào việc đánh giá và chọn tạo các dòng hoa Lilium spp. có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ cao với mục tiêu cụ thể là (1) xây dựng được quy trình chuyển gen codA vào lát cát vảy củ lily, (2) ứng dụng kỹ thuật lai và nuôi cấy mô phôi tạo con lai chi lily và (3) đánh giá khả năng chịu nóng in vitro của các dòng lily thương mại, dòng lily chuyển gen và dòng con lai. Những kết quả của luận án góp phần bổ sung cơ sở lý luận và thực tiễn cho việc ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong tạo giống cây trồng mới nói chung và cây lily nói riêng có khả năng chống chịu điều kiện nhiệt độ cao.
3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây lily 1.1.1. Giới thiệu chung về lily Cây hoa lily (có nơi còn gọi là hoa loa kèn, huệ tây) có tên khoa học là Lilium spp thuộc Chi Lilium, Họ Loa Kèn (Liliaceae), Bộ Loa Kèn (Liliales), Lớp Thực vật Một lá mầm (Liliopsida) (Phạm Hoàng Hộ, 2000). Chi Lilium được phân thành 7 nhóm, đó là các nhóm có tên Liriotypus, Martagon, Pseudolirium, Archelirion, Sinomartagon, Leucolirion và Oxypetalum (Comber, 1994a). Phân loại của lily hiện nay được mở rộng thêm bởi việc lai tạo giữa các giống giữa nhóm lily quan trọng có màu sắc đẹp quyến rũ, hoa thơm, lâu tàn, kiểu dáng sang trọng, dễ thu hoạch, bảo quản và vận chuyển, có giá trị kinh tế cao, đang được ưa chuộng trên thế giới và ở Việt Nam (Đặng Văn Đông, 2010). 1.1.2. Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật học cây lily Cây hoa lily có nguồn gốc chủ yếu từ Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, California (Mỹ) và rải rác ở một số nơi khác. Loại cây này có mặt ở hầu hết các châu lục, với một khoảng phân bố rộng từ 10o đến 60o độ bắc của những vùng có khí hậu ôn đới và lạnh hoặc ở những vùng núi cao từ 1200m trở lên của các vùng nhiệt đới như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Việt Nam. Ước chừng khoảng 80 loài cơ bản, chúng xuất hiện ở châu Á với khoảng 50-60 loài, châu Mỹ có 20 loài, châu Âu là 12 loài. Ngoài ra, còn rất nhiều loài lai tạo giữa các loài trong tự nhiên như: Aarrelian, Backhause, Fista, Olipie được phân bố ở nhiều nơi (Trần Duy Quý và cs., 2004). Lily là cây một lá mầm, thân thảo lâu năm, phần dưới mặt đất gồm thân vảy, rễ. Phần trên mặt đất gồm lá, thân. Thân vảy là phần phình to của thân tạo thành. Trên đĩa thân vảy có vài chục vảy hợp lại. Lá lily mọc rải rác thành vòng, đầu lá hơi nhọn, không có cuống hoặc cuống ngắn. Quả lily là quả nang, có 3 góc và 3 nang,
4 mỗi nang có nhiều hạt (400-500), độ lớn trọng lượng hạt tùy theo giống. Trong điều kiện khô và lạnh, hạt có thể bảo quản được 3 năm. Hoa lily có hình dạng hoa rất phong phú và hấp dẫn. Một số loài hoa có dạng hình phễu như L. longifloum, L. candidum; có loài có dạng hình chén như L. wallichianum với những cánh hoa nhỏ hẹp; có loài lại có dạng hình chuông như L. cannadense; hình nõ điếu L. auratum. Hoa lily có màu sắc cũng rất phong phú: như là màu trắng của L. longiflorum; màu đỏ L. candidum; ngoài ra còn có các màu khác là vàng, hồng, tím... Hoa lily có mùi hương thơm ngát (ví dụ L. auratum) nhưng cũng có loài mùi khó chịu (như ở L. matargon). Hoa dạng lưỡng tính, có 6 cánh; 6 nhị (bao gồm bao phấn và chỉ nhị); một nhụy (bao gồm đầu nhụy, vòi nhụy và bầu nhụy); vòi nhụy dài; đầu nhụy hình cầu chẻ ba (Đặng Văn Đông & Đinh Thế Lộc, 2004). 1.1.3. Lịch sử phát hiện và tình hình hiện tại của ngành trồng hoa lily Loài lily hoang dại L. candidum là giống được mô tả lần đầu tiên là tổ tiên của các gốc hoa lily phát triển tới ngày nay. Đến giữa thế kỷ 13, ít nhất có 3 loại hoang dại được ghi chép lại. Loại thứ nhất là lily hoa trắng dùng làm thuốc được gọi là loại hoang dược (L. brownii), loại thứ hai là Quyển Đan (L. lancifolium), loại thứ ba là Sơn Đan (L. pumilum). Năm 1765, Trung Quốc đã xây dựng một số vùng trồng lily chủ yếu để ăn và làm thuốc. Vài chục năm trở lại đây lại xuất hiện một số giống cây lily hoang dại được trồng chủ yếu ở trong vườn thực vật các tỉnh Tô Châu, Cam Túc, Tứ Xuyên, Vân Nam. Cuối thế kỷ 16 các nhà thực vật học người Anh đã phát hiện và đặt tên cho các giống cây lily. Đầu thế kỷ 17, cây lily được di thực từ Châu Âu đến Mỹ. Sang thế kỷ 18, các giống lily của Trung Quốc được di thực sang Châu Âu và lily được coi là cây hoa quan trọng của Châu Âu, Châu Mỹ. Vào cuối thế kỷ 19, bệnh virus lây lan mạnh ở lily đến nỗi mà người ta tưởng chừng cây lily sẽ bị hủy diệt. Tuy nhiên, đến đầu thế kỷ 20, khi người ta phát hiện ra giống lily thơm (L.regane) ở Trung Quốc giống này được nhập vào Châu Âu và chúng đã được dùng vào việc lai tạo giống mới để tạo ra các giống có tính thích ứng rộng, cây lily lại được phát triển mạnh mẽ. Sau đại chiến thế giới thứ 2, các nước Châu Âu có cao trào tạo giống lily. Rất nhiều giống lily hoang dại của Trung Quốc
5 đã được sử dụng làm giống bố mẹ và người ta đã tạo ra nhiều giống mới có giá trị đến ngày nay (Võ Văn Chi & Dương Đức Tiến, 1978). Ở Việt Nam, các nhà khoa học mới phát hiện thấy 2 loài cây là L. brownii F.E. Brown var. colchesteri Wilson mọc hoang dại ở Bắc Giang, Thái Nguyên, Cao Bằng, Lạng Sơn, có vẩy củ thân dùng làm thuốc và loài Lilium poilanei Gagnep có ở Sapa, Hoàng Liên Sơn (Trần Duy Quý và CS, 2004). Ngày nay, do nhu cầu tiêu dùng hoa lily trên thế giới ngày càng tăng nên hoa lily ngày càng được trồng phổ biến hơn. Diện tích trồng hoa lily được mở rộng ở những vùng có điều kiện thuận lợi như khí hậu phù hợp, trình độ sản xuất tiên tiến và chi phí sản xuất rẻ. Tuy nhiên, sản xuất củ giống lily trên thế giới tập trung ở một số nước, trong đó Hà Lan có diện tích sản xuất lớn nhất với khoảng trên 4000 ha, theo sau là Pháp (khoảng 400ha); Chile (khoảng 200ha ); Mỹ (khoảng 200ha); Nhật Bản (khoảng 200ha) và New Zealand (khoảng 100ha). Ở Việt Nam, lily cũng là một trong những loại hoa cắt cành có giá trị kinh tế cao nhất. Trước năm 2000, lily được trồng chủ yếu ở Đà Lạt. Ngày nay, Lilium longiflorum (loa kèn) được trồng nhiều nơi với diện tích khoảng 3 ha, còn diện tích sản xuất lily lai nhập nội đang dần tăng lên (khoảng 10 ha). Nhu cầu tiêu dùng nội địa mỗi năm vào khoảng 20 triệu cành lily, trong khi chúng ta mới chỉ đáp ứng 12 triệu cành, lượng còn lại chúng ta phải nhập khẩu từ các nước khác (chủ yếu từ Trung Quốc, Hà Lan, Đài Loan). Đây là một thách thức cho các nhà trồng lily ở Việt Nam nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước và một phần cho xuất khẩu. Tuy nhiên, để mở rộng diện tích trồng trọt trong nước là một khó khăn lớn, do Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới. Như vậy, muốn thực hiện việc này cần phải tiến hành chọn tạo giống mới thích hợp (Đặng Văn Đông và CS, 2010). 1.1.4. Điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho cây lily và khả năng chịu nóng của cây lily Lily là cây ưa ánh sáng với cường độ ánh sáng yếu. Thời gian chiếu sáng thích hợp cho thời kỳ sinh trưởng là 10 giờ/ngày; ở thời kỳ ra hoa, chất lượng hoa tăng khi thời gian chiếu sáng 11 giờ/ngày (với nhiệt độ trung bình 18oC). Lily
6 thích hợp không khí ẩm ướt với độ ẩm trung bình là 80% - 85%. Thời kỳ đầu cây cần nhiều nước để duy trì độ ẩm trong củ; thời kỳ ra hoa nhu cầu nước giảm đi (vì nhiều nước củ dễ bị thối, rụng nụ). Lily sinh trưởng tốt ở nơi đất nhiều mùn, đất thịt nhẹ, thoát nước tốt. Lily rất mẫn cảm với muối, đất nhiều muối cây không hút được nước đặc biệt thời kỳ phân hóa hoa và ra hoa. Nói chung, hàm lượng muối trong đất không được cao quá 1,5 mg/cm3. Lily cần dinh dưỡng cao nhất là 3 tuần đầu sau khi nảy mầm. Tuy nhiên, thời gian này cây cũng con dễ bị ngộ độc do muối, vì vậy để tránh bị ngộ độc muối trước khi trồng 6 tuần cần phải phân tích đất. Nhiệt độ thích hợp cho lily sinh trưởng ban ngày 20oC - 25oC, ban đêm 13oC - 17oC. Ở điều kiện môi trường dưới 5oC và trên 28oC sự sinh trưởng của cây bị ảnh hưởng xấu. Nhiệt độ thích hợp nhất của cây lily trong thời gian đầu dao động trong khoảng 12oC - 13oC cho 1/3 chu kỳ sinh trưởng của cây hoặc ít nhất là cho đến khi các bộ phận rễ đã trưởng thành. Nói chung, hầu hết các giống lily, đặc biệt các giống mọc hoang dại hay đang được trồng chủ yếu ở vùng có vĩ độ cao (ví dụ Hà Lan) ưa khí hậu mát và ẩm nên có tính chịu rét tốt, chịu nóng kém (Đặng Văn Đông & Đinh Thế Lộc, 2004). Chính vì vậy, hiện nay khu vực trồng hoa lily ở nước ta chỉ mới tập trung ở miền Bắc vào mùa đông hay một số vùng núi cao như Đà Lạt, Lâm Đồng. Để phát triển ngành trồng hoa này ở Việt nam, các nhà khoa học đang phải tiến hành nghiên cứu cải tiến, thay đổi điều kiện trồng trọt hay chọn tạo giống mới có khả năng chống chịu với điều kiện khí hậu, tự nhiên khắc nghiệt. 1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật 1.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của cây. Nhiệt độ môi trường xung quanh cao là một mối đe dọa nghiêm trọng đối với thực vật và cây trồng trên toàn thế giới. Nhiệt độ cao gián đoạn hoặc liên tục là nguyên nhân gây ra một loạt thay đổi về hình thái giải phẫu, sinh lý và sinh hóa; ảnh hưởng đến sự sinh
7 trưởng và phát triển của thực vật dẫn đến suy giảm sản lượng và thậm chí có thể gây chết (Hall, 2001). 1.2.1.1. Thay đổi trong hình thái, giải phẫu Nhiệt độ cao tác động vào giai đoạn đầu của sự hình thành lá ở Zygophyllum qatarense, làm lá đa hình và có xu hướng giảm sự bốc hơi nước (Sayed, 1996). Nhiệt độ cao làm ảnh hưởng nghiêm trọng về sự tăng trưởng cành non, chiều dài lóng và dẫn đến sự chết sớm của cây (Hall, 1992). Ở cà chua, hiệu ứng đáng chú ý nhất của nhiệt độ cao trong quá trình sinh sản là vòi nhụy kéo dài vượt ra ngoài bao phấn hình nón làm ngăn chặn tự thụ phấn (Hall, 1992). Ở cấp độ giải phẫu, chúng có chung một xu hướng là giảm kích thước tế bào, đóng lỗ khí khổng để giảm mất nước, tăng mật độ lỗ khí và mạch xylem thường lớn hơn của cả rễ và thân (Anon et al., 2004). Ở cây nho, khi nhiệt độ cao, cấu trúc màng thylakoid thay đổi như là sự mất mát các cột Grana hoặc các cột này sưng phồng; các không bào to; các cristae bị gián đoạn và ty thể trở thành rỗng (Zhang et al., 2005). Nhiệt độ cao tăng tốc chuyển động của các phân tử qua màng do đó nới lỏng các liên kết hóa học trong các phân tử của màng sinh học, biến tính protein hoặc tăng các axit béo không bão hòa, làm cho màng sinh học bị lỏng hóa (Savchenko et al., 2002). 1.2.1.2. Những thay đổi về sinh lý a. Cân bằng về nước bị phá vỡ Trạng thái nước của thực vật có những biến đổi quan trọng nhất theo sự thay đổi nhiệt độ của môi trường xung quanh (Mazorra et al., 2002). Nói chung, các thực vật có xu hướng duy trì trạng thái nước ổn định, kể cả khi độ ẩm cao. Tuy nhiên, nhiệt độ cao làm hỏng thiên hướng này khi nước chỉ có hạn (Machado & Paulsen, 2001). Trên đồng ruộng, stress nhiệt thường kết hợp với sự giảm lượng nước trong tế bào (Morales et al., 2003; Simoes-Araujo et al., 2003; Tsukaguchi et al., 2003; Anon et al., 2004; Wahid & Close, 2007). b. Sự thay đổi trong quang hợp Quang phản ứng trong thylakoid và chuyển hóa cacbon trong stroma của lục lạp đã được nghiên cứu khi thực vật tiếp xúc nhiệt độ cao (Wise et al., 2004). Tỷ lệ