Luận án tiến sĩ Thú y: Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tỉnh Tuyên Quang

Chia sẻ: Trần Văn Gan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:159

Thêm vào BST

Báo xấu

68
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về tỷ lệ nhiễm, nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán và biện pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng hiệu quả trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang. Sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ chế tạo Kit chẩn đoán là hướng nghiên cứu công nghệ cao khẳng định việc làm chủ công nghệ, sản phẩm của công nghệ cao đã và đang được ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tại Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Thú y: Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tỉnh Tuyên Quang

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NCS. PHẠM THỊ TRANG 1 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG (TRYPANOSOMIASIS) Ở ĐÀN TRÂU TẠI TỈNH TUYÊN QUANG LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN - NĂM 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NCS. PHẠM THỊ TRANG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG (TRYPANOSOMIASIS) Ở ĐÀN TRÂU TẠI TỈNH TUYÊN QUANG Ngành: Ký sinh trùng và vi sinh vật học thú y Mã số: 9640104 LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Nguyễn Thị Kim Lan 2. PGS. TS. Phạm Công Hoạt THÁI NGUYÊN - NĂM 2017
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các kết quả nghiên cứu trong luận án này là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ một luận án nào khác. Mọi thông tin trích dẫn trong luận án đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành Luận án đều đã được cảm ơn. TÁC GIẢ Phạm Thị Trang
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Nguyễn Thị Kim Lan và PGS. TS. Phạm Công Hoạt - những Nhà khoa học đã hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện to lớn về cơ sở vật chất, nhân lực, vật lực của Ban Giám đốc, Ban Đào tạo - Đại học Thái Nguyên; Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi thú y, Bộ môn Bệnh động vật, Bộ môn Dược lý & Vệ sinh an toàn thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tập thể cán bộ giảng dạy, các học viên cao học Trần Nhật Thắng, Nguyễn Thị Thu Hiền, Hoàng Thị Hồng Hạnh và sinh viên các khóa 39, 40, 41, 42 Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên. Đặc biệt, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Phạm Thị Tâm cùng các cán bộ giảng viên, học viên và sinh viên Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở - Hà Nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian triển khai đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn Chi cục Thú y tỉnh Tuyên Quang, các Trạm Thú y và cán bộ, nhân dân địa phương của các huyện Yên Sơn, Sơn Dương, Hàm Yên và Chiêm Hóa - tỉnh Tuyên Quang đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi vô cùng biết ơn các thành viên trong gia đình và bạn bè đã luôn ở bên tôi, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận án. Thái nguyên, ngày tháng năm 2017 NGHIÊN CỨU SINH Phạm Thị Trang
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .........................................................................................................i MỤC LỤC .................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ...................................................................v DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ viii MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................1 2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................... 3 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................3 4. Những đóng góp mới của đề tài ...........................................................................3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................4 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài .................................................................................4 1.1.1. Bệnh tiên mao trùng ở động vật ............................................................................. 4 1.1.2. Kỹ thuật sinh học phân tử trong sản xuất kháng nguyên của tiên mao trùng T. evansi .......................................................................................................................... 12 1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .....................................................20 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước......................................................................... 20 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài ..................................................................... 24 1.3. Điều kiện tự nhiên, điều kiện kinh tế - xã hội của tỉnh Tuyên Quang ............35 1.3.1. Điều kiện tự nhiên ................................................................................................. 35 1.3.2. Điều kiện kinh tế - xã hội...................................................................................... 36 Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 38 2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu .....................................................38 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 38 2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 38 2.1.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................... 38 2.2. Nội dung nghiên cứu....................................................................................... 43 2.2.1. Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị................................................................................. 43
iv 2.2.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang ............................................................. 44 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................45 2.3.1. Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị ..................................................................... 45 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh ....................................... 51 2.4. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................64 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...................................65 3.1. Tình hình nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả ......................................................... 65 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang ................. 65 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo lứa tuổi trâu tại tỉnh Tuyên Quang ................ 67 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt ................................................. 71 3.1.4. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa vụ .................................................. 72 3.1.5. Kết quả xác định loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang .................................................................................................................. 75 3.1.6. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang .................................................................................................................. 80 3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang......................................................83 3.2.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của T. evansi ................................................................................................ 83 3.2.2. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi .................. 95 3.2.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ................................................................................................................ 108 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................131 1. Kết luận ............................................................................................................131 2. Đề nghị .............................................................................................................132 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................133 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ................148
v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ADN: Acide Deoxyribo Nucleic bp: base pair CATT: Card Agglutination Test for Trypanosomiasis CBB: Coomassie Brilliant Blue DMSO: Di Methyl Sulfoxide EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetic acid IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside ISG: Invanant Surface Glycoprotein kb: kilobase kDa: kiloDalton LB: Luria Bertani OD: Optical Density PBS: Phosphat Buffered Saline PCA: Plate Count Agar PCR: Polymerase Chain Reaction PMSF: Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride PVDF: Poly Vinylidene Di Fluoride RT - PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SDS: Sodium Dodecyl Sulfat SDS - PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis spp.: Species pluralis TEA: Tris - axit acetic - EDTA TMB: Tetra Methyl Benzidine VAT: Variable Antigen Type VSG: Variant Surface Glycoprotein
vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần gel Tricine - SDS ...................................................................41 Bảng 2.2. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .....................................................42 Bảng 2.3. Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR...........................................48 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 .....................................................................................54 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng Klewnov cắt đầu bằng sản phẩm PCR ................54 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng lai tạo vector tái tổ hợp ..........................................55 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR với cặp mồi F1.2 và R1.2 ..........................................57 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector biểu hiện ..........58 Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang ........65 Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo tuổi trâu .................................................68 Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt .......................................71 Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa trong năm ............................ 72 Bảng 3.5. Danh sách chuỗi gen 18S của Trypanosoma evansi sử dụng so sánh và phân tích trong nghiên cứu ....................................................................78 Bảng 3.6. Kết quả áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp ........80 Bảng 3.7. Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện rộng .............82 Bảng 3.8. Bảng tổng hợp kết quả so sánh trình tự xác định với các trình tự trên NCBI .......92 Bảng 3.9. Kết quả xác định mật độ hạt latex và nồng độ kháng nguyên để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex ...........................................................111 Bảng 3.10. Kết quả xác định nhiệt độ và thời gian để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex......................................................................................112 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của chất nhuộm màu đến khả năng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể....................................................................................113 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ và chất ức chế phân giải protein đến kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 ...................................................................115 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ và chất ổn định protein đến kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 ................................................................................117
vii Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ và chất diệt khuẩn đến kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 .........................................................................................118 Bảng 3.15. Xác định độ pha loãng kháng thể, thời gian và nhiệt độ phản ứng .......121 Bảng 3.16. Kết quả phản ứng sử dụng Kit CATT phát hiện kháng thể kháng ........125 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến độ nhạy của phản ứng khi sử dụng Kit CATT ..............................................................127 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến độ đặc hiệu của Kit CATT chế tạo .....................................................................................127 Bảng 3.19. So sánh kết quả chẩn đoán bệnh tiên mao trùng của Kit CATT với kỹ thuật ELISA và phương pháp tiêm truyền chuột .................................128 Bảng 3.20. So sánh hiệu quả sử dụng Kit CATT với kỹ thuật ELISA và phương pháp tiêm truyền chuột .............................................................................129
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của tiên mao trùng T. evansi .........................................................4 Hình 1.2. Phương thức truyền lây tiên mao trùng T. evansi .......................................5 Hình 1.3. Sơ đồ vector pCR 2.1 ................................................................................17 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi .................................................................................51 Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT từ kháng nguyên tái tổ hợp của T. evansi ............................................................................52 Hình 3.1. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang ............................................................................................66 Hình 3.2. Đồ thị biến động nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi .....................68 Hình 3.3. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt ..........................71 Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa trong năm ...............73 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen 18S của các mẫu Trypanosoma spp. trên thạch agarose 1% ......................................................................75 Hình 3.6. Hình ảnh chuyển nạp sản phẩm PCR của mẫu Tev-CH-VN; Tev- HY-VN; Tev-SD-VN và Tev-YS-VN vào tế bào E. coli chủng DH5α-T ....................................................................................................76 Hình 3.7. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt ADN plasmid tái tổ hợp mang gen 18S bằng enzyme EcoRI ..........................................................................77 Hình 3.8. Cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide chuỗi gen 18S rRNA của các mẫu Tev-CH-VN; Tev-HY-VN; Tev-SD-VN và Tev-YS-VN nghiên cứu với các mẫu Trypanosoma evansi đã được đăng ký trong Ngân hàng gen .........................................................................................79 Hình 3.9. Kết quả điện di ADN tổng số ....................................................................83 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu ADN tổng số ..........................84 Hình 3.11. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................85 Hình 3.12. Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp pJET1.2 - RoTAT 1.2 ...........................87
ix Hình 3.13. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn biến nạp trên môi trường LB có ampicillin, chất chỉ thị màu X-gal, chất cảm ứng IPTG ..........................88 Hình 3.14. Kết quả tách chiết ADN plasmid pJET1.2 - RoTAT 1.2 ........................89 Hình 3.15. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR .......................90 Hình 3.16. Kết quả kiểm tra pJET1.2 - RoTAT 1.2-1 bằng EcoRI và SalI ..............91 Hình 3.17. Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của đoạn gen đích RoTAT 1.2 ...............................................................................................92 Hình 3.18. Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt bằng hai enzyme EcoRI và SalI .......... 94 Hình 3.19. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2 vào tế bào vi khuẩn E. coli BL21 .............................................................................95 Hình 3.20. Kết quả tách chiết ADN plasmid pET22 - RoTAT 1.2...........................95 Hình 3.21. Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2 ..........96 Hình 3.22. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2.................97 Hình 3.23. Kết quả điện di Tricine-SDS PAGE các dòng plasmid tái tổ hợp ........99 Hình 3.24. Phản ứng western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein RoTAT 1.2 ........ 99 Hình 3.25. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 theo thời gian cảm ứng .......100 Hình 3.26. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nhiệt độ nuôi cấy .......101 Hình 3.27. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị OD khác nhau ..102 Hình 3.28. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị pH khác nhau .... 103 Hình 3.29. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ kháng sinh ampicillin bổ sung khác nhau .........................................................104 Hình 3.30. Kết quả khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG ở các nồng độ khác nhau ...105 Hình 3.31. Kết quả khảo sát thời gian cảm ứng ......................................................106 Hình 3.32. Kết quả khảo sát nhiệt độ cảm ứng ......................................................107 Hình 3.33. Quy trình sản xuất Kit CATT ..............................................................109 Hình 3.34. Đánh giá hiệu quả kết hợp kháng nguyên - kháng thể dựa trên thang điểm từ âm tính (-), nghi ngờ (+/-) và dương tính (1+) - (4+) ....110 Hình 3.35. Quy trình chẩn đoán bệnh tiên mao trùng bằng Kit CATT và phương pháp tiêm truyền chuột .............................................................129
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh tiên mao trùng là bệnh phổ biến ở nhiều loài gia súc như trâu, bò, dê, ngựa, hươu, lạc đà… Elshafie E. I. và cs. (2013) [54], Kocher A. và cs. (2015) [66], Tehseen S. và cs. (2015) [116] cho biết, bệnh do Trypanosoma evansi (T. evansi) - ký sinh trùng đường máu, thuộc giới động vật nguyên sinh Protozoa, lớp trùng roi Flagellata, giống Trypanosoma gây nên. Bệnh thấy ở hầu hết các nước châu Phi, Nam Mỹ và châu Á. Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy phổ biến ở khắp các vùng, miền. Alves F. M. và cs. (2011) [35] cho biết, bệnh tiên mao trùng do đơn bào T. evansi gây ra, nếu chẩn đoán và điều trị không kịp thời gia súc có thể chết, gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi. Chính vì vậy, yêu cầu cấp thiết hiện nay là phải tìm ra một phương pháp chẩn đoán bệnh nhanh, độ chính xác cao, chi phí thấp, dễ dàng áp dụng trên phạm vi rộng để có thể điều trị kịp thời, giảm tỷ lệ chết do bệnh gây ra. Hiện nay, nước ta đã sử dụng nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng như phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, phương pháp tập trung tiên mao trùng, phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm, chẩn đoán huyết thanh học, chẩn đoán sinh học phân tử. Trong đó, phương pháp soi tươi và phương pháp nhuộm tiêu bản máu khô thường khó phát hiện tiên mao trùng; phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng cho kết quả chính xác, song cần nhiều thời gian mới có kết quả; phương pháp sinh học phân tử có độ chính xác cao nhưng cần có trang thiết bị hiện đại mới thực hiện được; phương pháp chẩn đoán huyết thanh học được đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh và có khả năng chẩn đoán với số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn. Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học bệnh tiên mao trùng được thực hiện dựa trên nguyên tắc dùng các phản ứng huyết thanh học đặc hiệu để phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên tiên mao trùng. Tuy vậy, kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng lại rất đa dạng với nhiều epitope biến đổi khác nhau. Việc lựa chọn một epitope kháng nguyên có tính ổn định và tính đặc hiệu với nhiều serotype của
2 tiên mao trùng là công việc cần thiết để đảm bảo phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và đặc hiệu cao. Theo nghiên cứu của Vương Thị Lan Phương (2004) [28], Abou El Naga T. và cs. (2012) [33], kháng nguyên RoTAT 1.2 có mặt ở hầu hết các VAT (Variable Antigen Type - kháng nguyên biến đổi) của T. evansi. Urakawa T. và cs. (2001) [121], Phạm Thị Tâm và cs. (2013) [29] cho biết, Kit chẩn đoán chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn. Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2015) [18] cho biết, kháng nguyên này được chế tạo bằng công nghệ gen cho khả năng phát hiện đặc hiệu tiên mao trùng đạt trên 98%. Tuyên Quang là một tỉnh miền núi phía Bắc có địa hình đồi núi, khí hậu nhiệt đới gió mùa, thời tiết nóng ẩm, thích hợp cho ruồi trâu, mòng - vật môi giới phát triển, hút máu và truyền bệnh tiên mao trùng từ trâu, bò bệnh sang trâu, bò khỏe. Đây là một trong những tỉnh nằm trong vùng dịch tự nhiên, trâu, bò thường mắc ở thể mạn tính, có biểu hiện lâm sàng không rõ rệt nên rất khó phát hiện và phòng chống bệnh. Hàng năm, trâu, bò bị ốm và chết khá nhiều trong vụ Đông - Xuân, khi thời tiết giá lạnh và thức ăn khan hiếm. Cơ sở hạ tầng phục vụ công tác chẩn đoán và điều trị bệnh cho đàn gia súc tại địa phương vẫn còn nhiều hạn chế, dẫn tới hệ quả là bệnh tiên mao trùng trở nên phổ biến hơn, nghiêm trọng hơn và gây thiệt hại lớn hơn. Những phân tích ở trên đã cho thấy, mức độ phổ biến cũng như những tác hại do bệnh tiên mao trùng gây ra trên đàn gia súc nói chung và đàn trâu nói riêng ở nước ta, đặc biệt là ở các tỉnh trung du miền núi, trong đó, có tỉnh Tuyên Quang. Vì vậy, việc nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm, chế tạo kit chẩn đoán và xác định phác đồ điều trị hiệu quả bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang là hết sức cần thiết. Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết của thực tiễn, để có cơ sở khoa học xây dựng quy trình chẩn đoán, quy trình phòng trị bệnh tiên mao trùng hiệu quả cho đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang, chúng tôi đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang".
3 2. Mục tiêu của đề tài - Xác định được tỷ lệ nhiễm, định danh loài tiên mao trùng gây bệnh và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang. - Chế tạo được Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về tỷ lệ nhiễm, nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán và biện pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng hiệu quả trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang. Sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ chế tạo Kit chẩn đoán là hướng nghiên cứu công nghệ cao khẳng định việc làm chủ công nghệ, sản phẩm của công nghệ cao đã và đang được ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tại Việt Nam. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Chế tạo được Kit từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của loài T. evansi phục vụ công tác chẩn đoán bệnh nhanh và kịp thời, áp dụng phác đồ điều trị bệnh hiệu quả, từ đó góp phần nâng cao số lượng và chất lượng đàn trâu, cải thiện đời sống cho người chăn nuôi. 4. Những đóng góp mới của đề tài Chế tạo được các bộ Kit từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của loài T. evansi, Kit có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể áp dụng chẩn đoán nhanh bệnh tiên mao trùng ở các địa phương.
4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài 1.1.1. Bệnh tiên mao trùng ở động vật 1.1.1.1. Căn bệnh Bệnh tiên mao trùng - Trypanosomiasis - là bệnh do ký sinh trùng đơn bào Protozoa, lớp trùng roi Flagellata gây ra. Có nhiều loài thuộc giống Trypanosoma như: Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma simiae… có khả năng gây bệnh cho người và động vật (Kumar A. và cs., 1991 [69]). Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng do loài đơn bào Trypanosoma evansi (T. evansi) gây ra. Tiên mao trùng T. evansi có hình thoi, dài 18 - 34 m. Giữa thân tiên mao trùng có một nhân, phía cuối cơ thể có một roi, roi này chạy dọc theo thân và tạo thành nhiều màng rung động, cuối cùng roi lơ lửng ở phần đầu và thành roi tự do (Nguyễn Thị Kim Lan, 2011 [12]). Kinetoplast Màng rung Nhân Roi tự do Hình 1.1. Cấu trúc của tiên mao trùng T. evansi (Nguồn: Desquesnes M., 2004 [48])
5 1.1.1.2. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và thú hoang, thấy phổ biến hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo, sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch..., không ký sinh ở người (Phạm Sỹ Lăng và cs., 2008 [22], Hasan M. U. và cs., 2006 [63], Youssif F. và cs., 2008 [128]). Sự lây truyền bệnh tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khỏe là nhờ các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu (thuộc họ Tabanidae). Sự lây truyền này chỉ mang tính chất cơ học. Như vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng quan trọng. Đây là một trong những cơ sở khoa học để xây dựng biện pháp phòng và tránh lây lan bệnh tiên mao trùng hiệu quả (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012 [13]; Baldacchino F. và cs., 2014 [36]). Hình 1.2. Phƣơng thức truyền lây tiên mao trùng T. evansi (Nguồn: Desquesnes M. và cs., 2004 [48]) 1.1.1.3. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu. Ở châu Phi, T. evansi hiện diện tại tất cả các quốc gia có lạc đà, từ Senegal (15° Bắc)
6 đến Kenya (xích đạo), trên vành đai Glossina. T. evansi được tìm thấy không chỉ ở Mauritania, Morocco, Algeria, Tunisia, Libya, Ai Cập, Sudan, Eritrea và Ethiopia, mà còn ở khu vực phía bắc của Mali, Burkina Faso, Niger, Nigeria, Chad, Somalia, Kenya. Ngày nay, phân bố địa lý của bệnh liên tục từ khu vực phía bắc của châu Phi, qua Trung Đông đến khu vực Đông Nam Á. Bệnh phổ biến ở trâu, bò và ngựa các nước nhiệt đới ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ (Haridy F. M. và cs., 2011 [62], Sumbria D. và cs., 2014 [110]). Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng đã được phát hiện thấy phổ biến ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau như miền núi, trung du, đồng bằng và ven biển (Phạm Sỹ Lăng và cs., 2008 [22]). Mùa phát bệnh có liên quan chặt chẽ với mùa côn trùng hoạt động, thường vào khoảng từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm (Phan Địch Lân và cs., 2002 [23]). 1.1.1.4. Đặc điểm gây bệnh của T. evansi Khi ruồi, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào gia súc, tiên mao trùng xâm nhập vào da, tạo nên các vết viêm trên mặt da. Độc tố của tiên mao trùng tác động tới bộ máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy. Hội chứng tiêu chảy thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh. Khi sống trong huyết tương vật chủ, tiên mao trùng sử dụng protein huyết tương, làm giảm áp lực keo trong máu, nước sẽ từ máu thẩm thấu qua thành mạch quản vào gian bào của tổ chức gây hiện tượng thủy thũng. Ngoài ra, khi tiên mao trùng sinh sản nhiều trong máu có thể làm tắc các mạch máu nhỏ và các mao mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ thũng chất keo vàng dưới da. Sau khi xâm nhập vào máu ký chủ, tiên mao trùng sinh sản theo cấp số nhân. Số lượng tiên mao trùng nhiều thì lượng độc tố cũng tăng lên, tác động vào trung khu điều hòa nhiệt làm cho con vật sốt. Khi động vật sốt cao là lúc trong máu có nhiều tiên mao trùng phát triển. Theo Phạm Sỹ Lăng và cs. (2008) [22], trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như: sốt cao và gián đoạn, có biểu hiện rối loạn thần kinh, thủy thũng dưới da, gầy yếu, suy nhược, thiếu máu, viêm kết mạc và giác mạc mắt. Một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng màu vàng, sau
7 chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy. Các đợt ỉa chảy tiếp theo những cơn sốt cách quãng. Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân sau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được. Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và nhai lại cho đến khi sắp chết. Triệu chứng viêm giác mạc và kết mạc mắt thấy ở hầu hết trâu, bò mắc bệnh: mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng, đỏ ngầu. Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng như cùi nhãn kéo che kín giác mạc. Con vật mắc bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có những biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão, xoang bao tim tích nước vàng; phổi sung huyết và tụ máu từng đám; gan sưng to, nhạt màu; lách sưng, mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực và xoang bụng tích dịch màu vàng nhạt. 1.1.1.5. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tương đối khó khăn vì căn bệnh có khi có ở mạch máu ngoại vi, có khi không. Do đó, cần phải chẩn đoán bằng nhiều phương pháp khác nhau: * Phương pháp chẩn đoán lâm sàng Biểu hiện lâm sàng của bệnh tiên mao trùng không phải lúc nào cũng phát hiện được. Chính vì vậy, việc chẩn đoán qua triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò có độ chính xác không cao. Vì vậy, ngoài chẩn đoán qua các triệu chứng lâm sàng, cần phải tiến hành các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để có kết quả chẩn đoán chính xác. * Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm Việc phát hiện tiên mao trùng được thực hiện trên các mẫu máu, có thể xét nghiệm các mẫu máu này bằng hình thức soi tươi, cố định, nhuộm giemsa và một số phương pháp huyết thanh học khác (Desquesnes M., 2004) [48]. Cụ thể như sau: - Phương pháp phát hiện tiên mao trùng Để phát hiện tiên mao trùng, có thể áp dụng phương pháp soi tươi máu (Direct smear); phương pháp nhuộm giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky); phương pháp tập trung tiên mao trùng.
8 - Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. Ở phương pháp này, người ta tiêm truyền máu của động vật cần chẩn đoán cho động vật thí nghiệm (thường dùng chuột nhắt trắng). Sau đó, hàng ngày kiểm tra máu của động vật đã được tiêm truyền để phát hiện tiên mao trùng. Nếu trong máu động vật này có tiên mao trùng thì kết luận động vật cần chẩn đoán bị nhiễm bệnh và ngược lại. Theo Lê Ngọc Mỹ (1994) [26], phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là phương pháp chẩn đoán chính xác, nhưng nhược điểm của phương pháp này là khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng mẫu nhiều trong khoảng thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng được. - Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học Khi tiên mao trùng ký sinh, cơ thể vật chủ sản sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại tiên mao trùng. Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ: Phản ứng ngưng kết trên bản nhựa (CATT/T. evansi: Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể trong máu động vật nhiễm bệnh. Phương pháp CATT có ưu điểm cho kết quả nhanh chóng, dễ thực hiện, đặc biệt có thể áp dụng trong điều kiện thực địa thiếu các dụng cụ chẩn đoán chuyên biệt. Nguyên lý của phương pháp: kháng nguyên tiên mao trùng đã được nhuộm màu sẽ kết hợp với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nhiễm bệnh, tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh, đó là phản ứng dương tính. Nếu động vật không nhiễm bệnh, trong máu không có kháng thể đặc hiệu, phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể không xảy ra và không có các đám kết tủa, đó là phản ứng âm tính.
9 Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slide Agglutination Test) Phương pháp ngưng kết trên phiến kính là phản ứng giữa kháng nguyên tiên mao trùng sống có sẵn, với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nghi nhiễm. Phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành và có thể áp dụng trên diện rộng. Tuy nhiên phải thường xuyên lưu giữ giống tiên mao trùng để có tiên mao trùng sống thực hiện phản ứng này. Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test) Phương pháp LATEX được dùng để phát hiện kháng thể có trong huyết thanh của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng. Nguyên lý: Đây là phản ứng dùng kháng nguyên gắn hạt latex, khi gặp kháng thể đặc hiệu, kháng nguyên và kháng thể sẽ kết hợp với nhau thành đám lớn mà mắt thường có thể quan sát được. Khi cho kháng nguyên trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, phản ứng ngưng kết sẽ xảy ra. Kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn như những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng. Nhờ có hạt latex gắn vào kháng nguyên, hiện tượng ngưng kết này trở nên dễ dàng quan sát hơn. Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test) Trong nhiều trường hợp, để phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể, cần phải sử dụng một số kỹ thuật miễn dịch mới nhìn thấy được. Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT dùng kháng kháng thể đã được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên cần chẩn đoán. Trong phương pháp này có ba thành phần tham gia là kháng nguyên cần chẩn đoán, kháng thể đặc hiệu và kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Do đó, phương pháp này còn được gọi là phương pháp hai lớp. Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại được ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. Phương pháp này đang được sử dụng rộng