Tóm tắt Luận án tiến sĩ Thú y: Khảo sát xoắn khuẩn Leptospira và Leptospirosis trên chó ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

70
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm khảo sát sự lưu hành của xoắn khuẩn Leptospira trên chó và chuột. Nghiên cứu những biến đổi bệnh lý Leptospirosis trên chó. Nghiên cứu hiệu quả điều trị bệnh Leptospirosis trên chó.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Thú y: Khảo sát xoắn khuẩn Leptospira và Leptospirosis trên chó ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI Mã ngành: 62 64 01 02 NGUYỄN THỊ BÉ MƯỜI KHẢO SÁT XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA VÀ LEPTOSPIROSIS TRÊN CHÓ Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Cần Thơ-2019
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. HỒ THỊ VIỆT THU Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại:…………………………………., Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc …. giờ …. ngày …… tháng …..năm ………. Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Bệnh xoắn khuẩn là bệnh truyền nhiễm chung cho nhiều loài gia súc và người gây ra bởi một số loài xoắn khuẩn gây bệnh (pathogenic Leptospira species). Bệnh xảy ra phổ biến khắp thế giới, nhất là những vùng nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho sự tồn tại của xoắn khuẩn ở môi trường bên ngoài (Evangelista and Coburn, 2010). Xoắn khuẩn gây bệnh tồn tại trong ống thận và bài thải qua nước tiểu làm vấy nhiễm môi trường (Adler and Moctezuma, 2010) và trong tự nhiên chuột cống là nguồn tàng trữ xoắn khuẩn và là nguồn truyền lây bệnh cho chó, con người và các loài động vật khác (Syke et al., 2011). Ở Việt Nam trong thời gian qua có nhiều nghiên cứu về tình hình nhiễm Leptospira trên các loài động vật và kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm Leptospira khá biến động, phụ thuộc vào động vật khảo sát, thời gian và địa điểm khảo sát (Vũ Đình Hưng, 1995; Nguyễn Thị Ngân, 2000; Lê Huỳnh Thanh Phương, 200; Hoàng Mạnh Lâm, 2002 và Hoàng Kim Loan, 2013). Tuy nhiên nghiên cứu về bệnh này trên chó rất ít, đặc biệt là khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chưa có nghiên cứu nào về Leptospira và bệnh Leptospirosis trên chó. Do đó đề tài nghiên cứu “Khảo sát xoắn khuẩn Leptospira và Leptospirosis trên chó ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài - Khảo sát sự lưu hành của xoắn khuẩn Leptospira trên chó và chuột. - Nghiên cứu những biến đổi bệnh lý Leptospirosis trên chó. - Nghiên cứu hiệu quả điều trị bệnh Leptospirosis trên chó. 1.3 Những đóng góp mới của luận án Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện 2 loài Leptospira interrogans và Leptospira fainei hiện diện trên chó chưa tiêm phòng bệnh Leptospirosis ở một số tỉnh ĐBSCL. 1.4 Ý nghĩa khoa học của luận án Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về tình hình dịch tễ bệnh Leptospirosis trên chó, là cơ sở khoa học cho việc xây dựng qui trình phòng và trị bệnh trên chó, hạn chế bệnh trên người và các loài động vật khác. 1
Chương III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung 1: Xác định tình hình nhiễm xoắn khuẩn Leptospira trên chó và chuột. 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Khảo sát sự lưu hành Leptospia được thực hiện trên chó khỏe và chó bệnh, 4 tháng tuổi trở lên chưa tiêm phòng Leptospirosis, từ các hộ chăn nuôi ở 4 tỉnh (Cần Thơ, Vĩnh Long, An Giang và Cà Mau) và 3 phòng khám thú y (bao gồm chó khỏe và chó bệnh) trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Khảo sát sự lưu hành Leptospira trên chuột từ những chuột bẫy được ở các hộ nuôi chó được lấy mẫu khảo sát. 3.1.2 Phương pháp thực hiện a. Phương pháp lấy mẫu Mẫu huyết thanh chó: điều tra huyết thanh học cắt ngang được thực hiện trên 1.433 mẫu huyết thanh (HT) của chó khỏe và chó bệnh chưa tiêm phòng bệnh Leptospirosis theo giống, lứa tuổi, giới tính và phương thức nuôi ở 4 tỉnh thuộc ĐBSCL. Cỡ mẫu: cỡ mẫu ước lượng cần phải lấy dựa theo công thức dịch tễ của Fosgate (2009) cho mỗi tỉnh khảo sát. Bảng 3.1 Số lượng (SL) mẫu HT chó 2 2 P(1-P).Z 0,2(1-0,2). 1,96 Địa điểm SL (con) n= = = 245 Cần Thơ 650 d2 0,052 Vĩnh Long 256 Như vậy cỡ mẫu cần phải lấy ở mỗi tỉnh là An Giang 263 245 mẫu HT chó trở lên và được thể hiện Cà Mau 264 qua Bảng 3.1. Tổng 1.433 Mẫu huyết thanh chuột: điều tra huyết thanh học cắt ngang và phân tích các mẫu huyết thanh chuột tại 4 tỉnh của ĐBSCL. Cỡ mẫu: cỡ mẫu ước lượng cần phải lấy dựa theo công thức: 2
Bảng 3.2 Phân bố mẫu huyết thanh chuột P(1-P). Z2 0,071(1-0,071). 1,962 Địa điểm SL n= = = 101 (con) d2 0,052 Cần Thơ 195 Vĩnh Long 140 An Giang 185 Như vậy cỡ mẫu cần phải lấy ở mỗi tỉnh là Cà Mau 127 101 mẫu huyết thanh chuột trở lên và được thể hiện qua Bảng 3.2 Tổng 647 Tổng số 647 chuột, trong đó chuột cống (Rattus norvegicus) là 285 con, chuột xạ (Suncus murinus) 152 con và chuột nhắt (Mus musculus) 210 con. b. Phương pháp xét nghiệm Phản ứng MAT (Microscopic Agglutination Test) được sử dụng để phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng Leptospira trên chó và chuột với 18 nhóm huyết thanh do Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh cung cấp (theo qui trình của WHO, 2003). Phản ứng được kết luận dương tính khi hiệu giá ngưng kết ≥ 1: 200 đối với mẫu huyết thanh chó và ≥ 1: 20 mẫu huyết thanh chuột. c. Chỉ tiêu khảo sát - Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó và chuột theo các địa điểm khảo sát. - Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó và chuột. - Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó và chuột. - Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó theo theo giống, độ tuổi, giới tính và phương thức nuôi chó. - Hệ số tương quan (R2) giữa tỷ lệ dương tính các serogroup Leptospira trên chuột và chó, phương trình hồi qui tuyến tính y=a+bx. 3.2 Nội dung 2: Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu Việc phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu được thực hiện trên cùng 63 chó đã khảo sát các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu từ 111 chó có MAT ≥ 1: 400. 3.3.1 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu bằng kỹ thuật PCR Phương pháp thực hiện: nước tiểu được lấy giữa dòng bằng ống thông qua niệu đạo hoặc thu trực tiếp lúc thú đi tiểu với lượng nước tiểu cần lấy 6-20 ml, chia làm 3 phần để phân tích. - Phần 1: lấy 6 ml nước tiểu chưa ly tâm để phân tích các chỉ tiêu sinh lý nước tiểu. 3
- Phần 2: lấy 3 ml nước tiểu sau ly tâm để ly trích DNA. - Phần 3: lấy 3 ml nước tiểu sau khi ly tâm để nuôi cấy trên môi trường Ellinghausen-McCullough-Johnson (EMJH). Thực hiện phản ứng PCR Sáu mươi ba mẫu nước tiểu chó được sử dụng để ly trích DNA dùng cho phản ứng PCR và trên cơ sở khuếch đại gene 16S rRNA. Bảng 3.3 Trình tự nucleotide cặp mồi dùng khuếch đại vùng gene 16S rRNA Gene Mồi tổng Trình tự nucleotide bp M-27F 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’ 1500 16S M-1492R 5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT bp T-3’ Mồi tổng dựa theo nghiên cứu của Weisburg et al. (1991). Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích/1phản Nồng độ/1 phản ứng ứng 2X Master Mix 25X 1X Primer M-27F (10 µM) 2 µL 0,4 µM Primer M-1492R (10 µM) 2 µL 0,4 µM DNA tách chiết 1-2 µL 50-100 ng Bi.H20 Đủ 50 µL Bảng 3.5 Quy trình nhiệt trong phản ứng PCR Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ 95oC 5 phút 1 95oC 30 giây 55oC 30 giây 30 o 72 C 1 phút 45 giây 72oC 5 phút 1 3.3.2 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ mẫu nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy xoắn khuẩn - Leptospira được nuôi cấy theo qui trình của WHO (2003) trên môi trường EMJH, được quan sát dưới KHV nền đen và được định danh đến mức loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự. - Kỹ thuật PCR được thực hiện như mục 3.3.1 4
Giải trình tự đoạn gene 16S rRNA của xoắn khuẩn Leptospira - Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và được giải trình tự nucleotide tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). - Mẫu được giải trình tự gene 16S rRNA tự động trên máy ABI 3130 Sequencer, sử dụng cặp mồi 27F và 1492R. - Nếu mức độ đồng nhất của trình tự nucleotide trong đoạn gene 16S rRNA đạt ≥ 95% thì có thể xác định tới chi (genus) và ≥ 99% thì có thể xác định tới loài (species) (dựa theo mô tả mức độ tương đồng của La Scola et al., 2006). - Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên các trình tự nucleotide bằng cách sử dụng phần mềm MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016). Tra cứu kết quả trên BLAST SEARCH và so sánh các vi khuẩn sẵn có từ GenBank, cơ sở dữ liệu trên NCBI để xác định các loài phân lập được và hai loài xoắn khuẩn Leptospira tham chiếu được dùng để so sánh trong phân tích phát sinh loài: >Icterohaemorrhagiae NR_116542.1 Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae strain RGA 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. >Hurstbridge NR_043049.1 Leptospira fainei serovar hurstbridge strain BUT 6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. 3.3 Nội dung 3: Khảo sát những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis trên chó - Những biến đổi bệnh lý ở chó bệnh được khảo sát dựa trên chỉ số sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trên 13 chó dương tính với Leptospira bằng PCR và có MAT≥ 1: 400. a. Xét nghiệm máu Các chỉ tiêu sinh lý máu được khảo sát bằng máy huyết học (Cell Dyn 3200, Mỹ) bao gồm: bạch cầu, neutrophile%, lymphocytes%, hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, tiểu cầu và các chỉ tiêu sinh hóa máu được khảo sát bằng máy phân tích sinh hóa máu (AU604, Nhật): ure, creatinin, AST, ALT và bilirubin và so sánh với tiêu chuẩn của The Merck (2010). b. Xét nghiệm nước tiểu - Các chỉ tiêu sinh lý nước tiểu được khảo sát bằng máy phân tích nước tiểu (U120, Mỹ) bao gồm: hồng cầu, bạch cầu, protein và bilirubin và so sánh với tiêu chuẩn của Merck (2010) và Khorami et al. (2010). 5
c. Chỉ tiêu khảo sát - Sự thay đổi các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trên chó bệnh Leptospirosis. - Những dấu hiệu lâm sàng trên chó nghi bệnh Leptospirosis: sốt, bỏ ăn, nôn mửa, xuất huyết da,... 3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis trên chó Đối tượng nghiên cứu: chó khỏe và chó bệnh được mang đến khám và điều trị ở 3 phòng khám thú y tại thành phố Cần Thơ. - Bố trí phác đồ điều trị có sự hợp tác tham gia nghiên cứu với chủ nuôi. - Sáu mươi ba chó trong nội dung 2 có hiệu giá kháng thể kháng Leptospira ≥ 1: 400, có sự hiện diện của xoắn khuẩn Leptospira trong nước tiểu khi soi bằng KHV nền đen (được phân bố ngẫu nhiên gồm 32 chó không biểu hiện triệu chứng lâm sàng (TCLS) và 31 chó có một số biểu hiện TCLS nghi nhiễm bệnh Leptospirosis: ói, ăn ít, buồn, lười vận động, suy thận, suy gan, báng bụng, xuất huyết da và vàng da). Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm Thuốc sử dụng Số chó điều Liều lượng Đường Liệu trình trị (con) cấp Phác đồ 1: 20 0,2 mg/kgP, Tiêm dưới 7–14 ngày Shoptapen cách 3 ngày da/ bắp (Penicillin G+Streptomycin) Phác đồ 2: 22 22 mg/kgP, Uống 7–14 ngày Amoxicillin ngày 2 lần Phác đồ 3: 21 5 mg/kgP, Uống 7–14 ngày Doxycycline ngày 2 lần Chỉ tiêu theo dõi để đánh giá hiệu quả điều trị dựa theo Goldstein, (2010); Sykes et al. (2011); Francey and Schweighauser, (2012) và Schuller et al. (2015). 3.5 Phân tích và xử lý số liệu - Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2013. - Các chỉ tiêu sinh lý máu, sinh hóa máu, sinh lý, sinh hóa nước tiểu được trình bày dưới dạng ± SE. - Khảo sát các yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm Leptospira bao gồm 6
nhóm giống, nhóm tuổi, giới tính và phương thức nuôi bằng phép trắc nghiệm χ2 trong phần mềm Minitab 16.0 - Phương pháp hồi qui (regression) dùng phân tích mối tương quan về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột và chó với phương trình có dạng: y=a+ bx, trong đó a và b là hằng số, y và x là tỷ lệ dương tính trên chó và chuột. Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên chó và chuột 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira trên chó ở một số tỉnh ĐBSCL Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó Tỉnh Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT Tỷ lệ dương dương tính tính (%) Cần Thơ 650 159 24,46a Vĩnh Long 256 69 26,95a An Giang 263 53 20,15a Cà Mau 264 50 18,94b Tổng 1.433 331 23,10 Những số liệu trong cùng một cột với chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P
địa phương khảo sát sẽ khác nhau (Levett, 2001; Ellis, 2010). Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó Tổng 1.433 mẫu HT khảo sát Các serogroup Leptospira Số lượt nhiễm Tỷ lệ (%) L. australis 19 5,74 L. autumnalis 12 3,63 L. bataviae 40 12,08 L. canicola 61 18,43 L. ballum 7 2,11 L. icterohaemorrhagiae 116 35,05 L. pyrogenes 30 9,06 L. cynopterie 9 2,72 L. gryppotyphosa 40 12,08 L. hebdomadis 12 3,63 L. javanica 22 6,65 L. panama 29 8,76 L. semaranga 3 0,91 L. pomona 9 2,72 L. tarassovi 1 0,30 L. sejroe 31 9,37 L. louisiana 9 2,72 L. hurstbridge 42 12,69 Tổng số mẫu dương tính 331 Qua Bảng 4.2 chứng minh có sự lưu hành 18/18 serogroup Leptospira trên chó ở các tỉnh ĐBSCL. Các serogroup chiếm tỷ lệ cao L. icterohaemorrhagiae (35,05%), L. canicola (18,43%), L. hurstbridge (12,69%), L. bataviae (12,08%) và L. gryppotyphosa (12,08%). So với nghiên cứu của Vũ Đạt và Lê Huỳnh Thanh Phương (1999) đã chứng minh được trên chó ở vùng phụ cận Hà Nội cũng có nhiễm các serogroup L. bataviae, L. canicola, L. gryppotyphosa và L. icterohaemorrhagiae. Như 8
vậy tùy vào tình hình dịch tễ của mỗi địa phương có sự khác nhau về các serogroup Leptospira đang lưu hành. Bảng 4.3 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 Serogroup Lượt % Lượt % Lượt % Lượt % Lượt % Leptospira australis 15 78,95 4 21,05 0 0,00 0 0,00 0 0,00 autumnalis 11 91,67 1 8,33 0 0,00 0 0,00 0 0,00 bataviae 31 77,50 9 22,50 0 0,00 0 0,00 0 0,00 canicola 41 67,21 14 22,95 3 4,92 2 3,28 1 1,64 ballum 6 85,71 1 14,29 0 0,00 0 0,00 0 0,00 icterohaemorrh agiae 86 74,14 22 18,97 6 5,17 2 1,72 0 0,00 pyrogenes 22 73,33 7 23,33 1 3,33 0 0,00 0 0,00 cynopterie 6 66,67 2 22,22 1 11,11 0 0,00 0 0,00 gryppotyphosa 30 75,00 7 17,50 2 5,00 1 2,50 0 0,00 hebdomadis 7 58,33 5 41,67 0 0,00 0 0,00 0 0,00 javanica 15 68,18 6 27,27 1 4,55 0 0,00 0 0,00 panama 17 58,62 9 31,03 3 10,34 0 0,00 0 0,00 100,0 semaranga 3 0 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 pomona 7 77,78 2 22,22 0 0,00 0 0,00 0 0,00 100,0 tarassovi 1 0 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 sejroe 26 83,87 5 16,13 0 0,00 0 0,00 0 0,00 louisiana 6 66,67 3 33,33 0 0,00 0 0,00 0 0,00 hurstbridge 33 78,57 9 21,43 0 0,00 0 0,00 0 0,00 Tổng lượt 492 363 73,78 106 21,54 17 3,46 5 1,02 1 0,2 9
Cường độ nhiễm chủ yếu tập trung ở mức hiệu giá ngưng kết kháng nguyên kháng thể thấp từ 1: 200 đến 1: 800, chỉ có hai serogroup L. canicola và L. icterohaemorrhagiae ở mức cao từ 1: 1600 đến 1: 3200. So với kết quả nghiên cứu của Vũ Đình Hưng (1995), cường độ nhiễm chủ yếu tập trung ở hiệu giá ngưng kết 1: 800 và nghiên cứu của Lê Huỳnh Thanh Phương (2001), chủ yếu tập trung ở hiệu giá ngưng kết từ 1: 800 đến 1: 1600. Nếu hiệu giá kháng thể kháng Leptospira càng cao chứng tỏ mức độ nhiễm càng cao vì hiệu giá kháng thể phản ánh hàm lượng kháng thể có trong máu chó. Tùy vào mỗi vùng, mỗi khu vực, mỗi quốc gia có thể nhiễm các serogroup Leptospira với cường độ khác nhau và còn tùy thuộc vào thời điểm lấy mẫu, tình trạng sức khỏe của con vật lúc lấy huyết thanh và điều kiện nuôi dưỡng của chó. Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo giống chó Giống chó Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT dương tính Tỷ lệ (%) Chó nội 835 198 23,71a Chó ngoại 598 133 22,24a Tỷ lệ nhiễm Leptospira ở giống chó nội 23,71% và giống chó ngoại 22,24% khác nhau không ý nghĩa thống kê. Điều này có thể do trong cùng một môi trường sống nên khả năng chó tiếp xúc với mầm bệnh là như nhau nên tỷ lệ nhiễm Leptospira không khác biệt giữa hai nhóm giống chó giống như nhận định của Harland et al. (2013) và Maele et al. (2008), yếu tố giống không ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm Leptospira. Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo lứa tuổi chó Số mẫu HT Số mẫu HT Tỷ lệ Độ tuổi kiểm tra dương tính (%) 4 tháng < 12 tháng tuổi 358 77 21,51a ≤ 1-6 năm tuổi 737 166 22,52a ≥ 6 năm tuổi 338 88 26,04a Tỷ lệ dương tính với Leptospira cao nhất ở chó lớn hơn 6 năm tuổi (26,04%), kế đến chó từ ≤ 1 tuổi đến 6 năm tuổi (22,52%) và chó từ 4 tháng đến dưới 12 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm thấp nhất (21,51%), tuy nhiên qua phân tích thống kê khác nhau không có ý nghĩa. Điều này nói lên rằng Leptospira có thể gây bệnh cho chó ở mọi lứa tuổi và chó càng lớn tuổi thì có tỷ lệ nhiễm càng cao (Harland et al., 2013). 10
Bảng 4.6 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo giới tính Giới tính Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT dương tính Tỷ lệ (%) Chó đực 715 173 24,20a Chó cái 718 158 22,01a Bảng 4.6 cho thấy ở ĐBSCL chó đực dương tính với Leptospira 24,20% và chó cái 22,01% và khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Điều này nói lên rằng chó đực và cái đều có thể nhiễm Leptospira như nhau. Theo kết quả khảo sát của Senthil et al. (2013), tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó đực (20,9%) và chó cái (21%) là tương đương nhau và nghiên cứu của Dhliwayo et al. (2012) và Anabel et al. (2013) nhận xét tỷ lệ chó dương tính với Leptospira không phụ thuộc theo giới tính. Bảng 4.7 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo phương thức nuôi Số mẫu HT Số mẫu HT Phương thức nuôi Tỷ lệ (%) kiểm tra dương tính Nuôi thả 949 246 25,92a Nuôi nhốt 484 85 17,56b Những số liệu trong cùng một cột với chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P
4.1.2 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột và mối tương quan về tỷ lệ dương tính giữa các serogroup Leptospira trên chuột và chó. 4.1.2.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột Bảng 4.8 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột ở một số tỉnh ĐBSCL Loại chuột Mẫu HT Mẫu HT Tỷ lệ kiểm tra dương tính (%) Chuột cống (Rattus norvegicus) 285 132 46,32 a Chuột xạ (Suncus murinus) 152 40 26,32b Chuột nhắt (Mus musculus) 210 57 27,14b Tổng 647 229 35,40 Những số liệu trong cùng một cột với chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P
Tổng 647 mẫu HT khảo sát Các serogroup Leptospira Số lượt nhiễm Tỷ lệ (%) L. icterohaemorrhagiae 93 40,61 L. pyrogenes 19 8,30 L. cynopterie 10 4,37 L. gryppotyphosa 18 7,86 L. hebdomadis 6 2,62 L. javanica 13 5,68 L. panama 25 10,92 L. semaranga 1 0,44 L. pomona 17 7,42 L. tarassovi 7 3,06 L. sejroe 22 9,61 L. louisiana 10 4,37 L. hurstbridge 25 10,92 Tổng số mẫu dương tính 229 Kết quả ở Bảng 4.9 chứng minh gián tiếp có sự lưu hành 18/18 serogroup Leptospira trên chuột ở 4 tỉnh ĐBSCL. Các serogroup chiếm tỷ lệ cao L. icterohaemorrhagiae (40,61%), L. canicola (20,52%), L. bataviae (13,97%), L. panama (10,92%) và serogroup L. hurstbridge (10,92%). So với kết quả nghiên cứu của Vũ Đình Hưng (1995) chuột nhiễm chủ yếu là L. bataviae và L. pomona hay nghiên cứu của Hoàng Kim Loan et al. (2013) về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên các loài gặm nhấm ở miền Nam Việt Nam có 2 serogroups chiếm tỷ lệ cao trên chuột gồm L. bataviae và L. hurstbridge. Bảng 4.10 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chuột 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 Serogroup Lượt % Lượt % Lượt % Lượt % Lượt % Leptospira australis 9 75,00 2 16,67 1 8,33 0 0,00 0 0,00 autumnalis 6 66,67 2 22,22 0 0,00 1 11,11 0 0,00 bataviae 18 56,25 8 25,00 4 12,50 2 6,25 0 0,00 13
1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 canicola 36 76,60 6 12,77 4 8,51 1 2,13 0 0,00 ballum 4 100 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 icterohaemorrh 54 58,06 agiae 23 24,73 13 13,98 2 2,15 1 1,08 pyrogenes 11 57,89 5 26,32 2 10,53 1 5,26 0 0,00 cynopterie 9 90,00 1 10,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 gryppotyphosa 13 72,22 4 22,22 1 5,56 0 0,00 0 0,00 hebdomadis 4 66,67 3 50,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 javanica 10 76,92 2 15,38 0 0,00 0 0,00 0 0,00 panama 17 68,00 6 24,00 1 4,00 1 4,00 0 0,00 1 100,0 0,00 semaranga 0 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 pomona 10 58,82 5 29,41 2 11,76 0 0,00 0 0,00 tarassovi 7 100 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 sejroe 16 72,73 4 18,18 2 9,09 0 0,00 0 0,00 louisiana 8 80,00 2 20,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 hurstbridge 14 56,00 6 24,00 3 12,00 2 8,00 0 0,00 Tổng lượt 370 247 66,76 79 21,35 33 8,92 10 2,70 1 0,27 Kết quả trình bày ở Bảng 4.10 cho thấy cường độ nhiễm Leptospira trên chuột ở 4 tỉnh khảo sát tập trung ở hiệu giá ngưng kết kháng nguyên kháng thể thấp từ 1: 20 đến 1: 40. Điều này cho thấy chuột ở các địa điểm khảo sát chỉ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira ở mức độ thấp, chuột vẫn còn đang trong giai đoạn mang trùng chưa bọc phát thành dịch nhưng có thể truyền mầm bệnh cho các loài vật khác, kể cả người (Levett, 2001). 4.1.2.2. Mối tương quan về tỷ lệ dương tính giữa các serogroup Leptospira trên chuột và chó Bảng 4.11 Tỷ lệ dương tính các serogroup Leptospira trên chuột và chó Tỷ lệ dương Tỷ lệ dương Các serogroup tính trên chuột tính trên chó STT Leptospira (%) (%) 1 L. australis 5,24 5,74 2 L. autumnalis 3,93 3,63 3 L. bataviae 13,97 12,08 14
Tỷ lệ dương Tỷ lệ dương Các serogroup tính trên chuột tính trên chó STT Leptospira (%) (%) 4 L. canicola 20,52 18,43 5 L. ballum 1,75 2,11 6 L. icterohaemorrhagiae 40,61 35,05 7 L. pyrogenes 8,30 9,06 8 L. cynopterie 4,37 2,72 9 L. gryppotyphosa 7,86 12,08 10 L. hebdomadis 2,62 3,63 11 L. javanica 5,68 6,65 12 L. panama 10,92 8,76 13 L. semaranga 0,44 0,91 14 L. pomona 7,42 2,72 15 L. tarassovi 3,06 0,30 16 L. sejroe 9,61 9,37 17 L. louisiana 4,37 2,72 18 L. hurstbridge 10,92 12,69 2 R = 0,90; P
Phân tích phương trình hồi qui cho thấy tỷ lệ dương tính giữa các serogroup Leptospira trên chuột và trên chó là khá chặt chẽ, với hệ số tương quan R2=0,90 thể hiện mức độ tương quan cao và phương trình hồi qui: y= 0,466 + 0,868x. 40 35 y = 0,466 + 0,868x Prevalence of positive Leptospira R² =0,90 30 25 20 in dogs (%) 15 10 5 0 0 hệ tuyến tính10giữa tỷ lệ dương Hình 4.1 Quan 20 tính Leptospira 30 trên chuột40(x) và chó (y) 4.2 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu 4.2.1 Kết quả phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu bằng kỹ thuật PCR Bảng 4.12 Tỷ lệ phát hiện Leptospira trực tiếp từ nước tiểu Triệu chứng lâm sàng Số mẫu nước Số mẫu dương Tỷ lệ tiểu kiểm tra tính (%) Số chó không biểu hiện 32 6 18,75a TCLS Số chó có biểu hiện TCLS 31 7 22,58a nghi nhiễm Leptospira Tổng 63 13 20,63 Trong 63 mẩu nước tiểu kiểm tra có xoắn khuẩn Leptospira bằng KHV thì có 13 (20,63%) mẫu dương tính với Leptospira bằng kỹ thuật PCR. Trong đó 18,75% (6/32) mẫu dương tính từ những chó không biểu hiện TCLS và 22,58% (7/31) mẫu dương tính từ những chó có biểu hiện TCLS nghi ngờ nhiễm Leptospira và sai khác không có ý nghĩa thống kê. Leptospira sau khi nhiễm vào máu và khu trú trong thận, có thể thải Leptospira ra môi trường bên ngoài qua nước tiểu trong một thời gian dài, 16
có thể chó bệnh có biểu hiện TCLS hoặc không biểu hiện TCLS của bệnh và một khi TCLS rõ ràng thì rất khó điều trị (Levvet, 2001). 4.2.2 Kết quả phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ mẫu nuôi cấy Bảng 4.13 Tỷ lệ Leptospira phát hiện được theo các địa điểm lấy mẫu Địa điểm Số mẫu nước Số mẫu nghi Số xoắn tiểu kiểm tra nhiễm Leptospira khuẩn phân lập được Bệnh xá Thú y, 28 14 (50%) 0 (0%) ĐHCT. Phòng mạch Thú 11 2 (18,18%) 0 (0%) y Liên Quận Ninh Kiều - Bình Thủy, TPCT. Phòng mạch Thú 72 47 (65,27%) 3 (6,38%) y, 50 đường Võ Văn Kiệt, TPCT. Tổng 111 63 (56,76%) 3 (4,76%) Tổng số 111 mẫu nước tiểu chó từ những chó có hiệu giá kháng thể kháng 18 serogroup Leptospira MAT ≥ 1: 400, kết quả có 63 (56,76%) mẫu nước tiểu nghi có nhiễm Leptospira khi soi dưới KHV nền đen. Sáu mươi ba mẫu này được cấy vào môi trường EMJH và được theo dõi đến 3 tháng, kết quả có 3 mẫu (4,76%) có xoắn khuẩn phát triển vào thời điểm 17 ngày. Do Leptospira có đặc tính là khó nuôi cấy và thời gian nuôi cấy dài, đòi hỏi phải có nhiều kinh nghiệm và kỹ năng và dễ tạp nhiễm các vi khuẩn khác. Hình 4.2 Leptospira soi dưới Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm KHV nền đen (X40) lúc nuôi PCR trên gel agarose 1,5%, 90V, cấy 17 ngày 45 phút. Mẫu 1, 2 âm tính. Các 17 mẫu 3, 4 và 5 dương tính.
Kết hợp kết quả định danh loài xoắn khuẩn với kết quả giám định huyết thanh học bằng phương pháp vi ngưng kết đã được thực hiện đồng thời trên cùng mẫu chó cho thấy mẫu số 3 với tổng số nucleotide (nt) là 1374nt và mẫu số 5 với tổng số nucleotide là 1369nt tương đồng với chủng xoắn khuẩn tham chiếu Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae strain RGA có mã số trên GeneBank là NR 116542.1 ở mức ≥ 99%. Mẫu số 4 với tổng số nucleotide được giải trình tự là 1393nt, khi so sánh với chủng xoắn khuẩn tham chiếu Leptospira fainei serovar hurstbridge strain BUT6 có mã số trên GeneBank là NR 043049.1 với mức độ tương đồng ≥ 99% và có thể xác định thuộc loài gây bệnh cơ hội Leptospira fainei (intermediate pathogenic Leptospira). Bảng 4.14 Xác định loài xoắn khuẩn Leptospira dựa vào mức độ tương đồng của gene 16S rRNA STT Ký Số nt và mã gene Mức độ Loài xoắn khuẩn hiệu tương đồng Leptospira phân mẫu lập được 1 3 1374 nt, NR 116542.1 99% 2 5 1369 nt, NR 116542.1 99% 3 97 1385 nt, NR 116542.1 93% 4 181 1392 nt, NR 116542.1 99% 5 204 1412 nt, NR 116542.1 98% 6 307 1391 nt, NR 116542.1 99% Leptospira 7 308 1408 nt, NR 116542.1 99% interrogans 8 310 1390 nt, NR 116542.1 99% 9 312 1394 nt, NR 116542.1 99% 10 313 1390 nt, NR 116542.1 99% 11 490 1393 nt, NR 116542.1 99% 12 493 1390 nt, NR 116542.1 99% 13 494 1396 nt, NR 116542.1 98% 14 4 1393 nt, NR 043049.1 99% 15 328 1391 nt, NR 043049.1 99% Leptospira 16 330 1413 nt, NR 043049.1 99% fainei Tổng số 16 mẫu có DNA Leptospira trong Bảng 4.14 được giải trình tự, 13 mẫu thuộc về nhóm Leptospira interrogans (3, 5, 97, 181, 204, 307, 308, 310, 312, 313, 490, 493 và 494) và 3 mẫu thuộc về nhóm Leptospira 18