Luận án tiến sĩ thủy sản: Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon)

Chia sẻ: Nguyen Khanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:40

Thêm vào BST

Báo xấu

150
lượt xem 32
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án tiến sĩ thủy sản: Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon). Mời các bạn cùng tham khảo luận án dưới đây.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ thủy sản: Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon)

B GIÁO D C VÀ ÀO T O TRƯ NG I H C C N THƠ ------------♣♣♣----------- PH M TH TUY T NGÂN NGHIÊN C U QU N TH VI KHU N CHUY N HOÁ M TRONG BÙN ÁY AO NUÔI TÔM SÚ (Penaeus monodon) Chuyên ngành: Nuôi tr ng Th y s n nư c M n, L Mã s : 62 62 70 05 TÓM T T LU N ÁN TI N SĨ TH Y S N C n Thơ, 2012 i
Công trình ư c hoàn thành t i B môn Th y Sinh h c ng d ng, Khoa Th y s n, Trư ng i h c C n Thơ. Ngư i hư ng d n khoa h c: PGS. TS. Nguy n H u Hi p PGS. TS. Trương Qu c Phú Ph n bi n 1: TS. LƯU H NG M N Ph n bi n 2: TS. LÊ H NG PHƯ C Lu n án s ư c b o v trư c H i ng ch m lu n văn c p Nhà nư c, h p t i Khoa Th y s n, Trư ng i h c C n Thơ. Vào lúc: gi ngày tháng năm 2012 Có th tìm hi u lu n án t i: - Trung tâm H c li u Trư ng i h c C n Thơ - Thư vi n Khoa Th y s n, Trư ng i h c C n Thơ ii
KHÁI QUÁT CHUNG V LU N ÁN 1. Tính c p thi t c a tài Tôm sú (Penaeus monodon) là i tư ng nuôi tăng nhanh nh t trong ho t ng nuôi th y s n trên th gi i. S phát tri n nhanh c a ngh nuôi tôm bi n ã mang l i vi c làm cho ngư i dân và t o ngu n thu nh p ngo i t c a nhi u qu c gia. Tuy nhiên, h l y c a t c phát tri n nuôi tôm công nghi p ã d n n tình tr ng ô nhi m môi trư ng và d ch b nh, do v y ngh nuôi tôm bi n ã g p nh ng tr ng i l n. S n lư ng tôm nuôi c a nhi u qu c gia suy gi m, nh hư ng l n n i s ng kinh t c a nhi u dân cư. gi i quy t v n này ch t hoá h c và kháng sinh ã ư c s d ng trong ho t ng nuôi tôm (Gomez-Gil et al., 2000; Gräslund và Bengtsson, 2001). Vi c s d ng thu c kháng sinh không úng cách ã d n n s kháng thu c (Weston, 1996). M t khác s n ph m th y s n xu t kh u không t tiêu chu n do dư lư ng thu c kháng sinh, thu c b o v th c v t và vi sinh v t gây b nh ( ng ình Kim và ctv., 2006). Chính vì v y gi i pháp trong phòng tr b nh ã và ang ư c t ra bao g m vi c qu n lý b nh, ch h i t ng h p (Li, 2008), c bi t là vi c s d ng các vi sinh v t h u ích (probiotic) nh m c i thi n môi trư ng nuôi và tăng năng su t v t nuôi. ây là m t gi i pháp tích c c, có nhi u tri n v ng qu n lý vi sinh trong ao nuôi thâm canh, h n ch t i a thu c kháng sinh b o m an toàn v sinh th c ph m, h n ch áng k lư ng ch t h u cơ th i ra môi trư ng góp ph n phát tri n ngh nuôi th y s n m t cách b n v ng. Vi c nghiên c u ch n l a các dòng vi khu n h u ích có ngu n g c t i a phương làm cơ s cho vi c s n xu t i trà ch ph m vi sinh là r t c n thi t và có ý nghĩa th c ti n cao trong giai o n hi n 1
nay nh m nâng cao hi u qu nuôi th y s n, h n ch s ô nhi m môi trư ng thúc y và tăng cư ng s b n v ng c a ngh nuôi. T nh ng nguyên nhân trên mà tài "Nghiên c u qu n th vi khu n chuy n hoá m trong bùn áy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon)” ã ư c th c hi n. 2. M c tiêu c a tài Nghiên c u thành l p b ch ng vi khu n h u ích có ngu n g c t các ao nuôi tôm sú thâm canh nh m b sung b sưu t p vi khu n làm cơ s khoa h c trong vi c ch n l a các dòng vi khu n h u ích s n xu t ch ph m vi sinh. 3. N i dung c a lu n án - Sưu t p và nh danh các nhóm vi khu n phân h y h u cơ, chuy n hoá m phân l p t ao nuôi tôm sú thâm canh qua m t chu kỳ nuôi. - Xác nh bi n ng các y u t môi trư ng và y u t vi sinh v t qua m t chu kỳ nuôi. - ánh giá kh năng c i thi n ch t lư ng nư c c a nhóm vi phân l p và vai trò c a chúng trong ương nuôi tôm trong b qui mô phòng thí nghi m. 4. Ý nghĩa khoa h c và th c ti n c a tài Lu n án ã b sung b sưu t p nh ng dòng vi khu n h u ích có hi u qu x lý nư c t t trong nuôi tôm và nh ng k t lu n khoa h c v nh hư ng c a các dòng vi khu n này lên s thay i các ch tiêu ch t lư ng nư c và tăng trư ng c a tôm sú vào ngu n cơ s d li u khoa h c chung v ng d ng vi khu n h u ích, làm cơ s ph c v cho ngh nuôi tôm sú phát tri n b n v ng. 5. Nh ng i m m i c a lu n án 2
- Lu n án ã ch n l c, nh danh và ánh giá ư c hi u qu c i thi n ch t lư ng nư c c a m t s loài vi khu n h u ích t ao nuôi tôm sú thâm canh. - Lu n án ã i sâu tìm hi u ng thái c a qu n th vi khu n trong ao, cũng như các bi n ng ch t lư ng môi trư ng trong ao nuôi thâm canh thông qua m t chu kỳ nuôi. - Lu n án ã xác nh loài vi khu n B. cereus là loài có ngu n g c trong ao và không ph i là loài có trong ch ph m vi sinh (B. subtilis và B. licheniformis). - 6 loài vi khu n là B. subtilis (B41), B. cereus (B8, B9, B37, B38) và B. amyloliquefaciens (B67) có th ư c s d ng s n xu t ch ph m vi sinh. 6. B c c c a lu n án Chương 1: Gi i thi u 6 trang Chương II: Lư c kh o tài li u 40 trang Chương III: Phương pháp nghiên c u 30 trang Chương IV: K t qu và Th o lu n 79 trang Chương V: K t lu n và ki n ngh 2 trang Danh m c các công trình c a tác gi 1 trang Tài li u tham kh o 21 trang (g m 298 tài li u, trong ó 34 tài li u ti ng vi t và 264 tài li u ti ng nư c ngoài) Ph l c 33 trang 3
Chương 1: T NG QUAN Chương này t p trung vào tìm hi u và phân tích các n i dung quan tr ng như: 1. Khái quát v tôm sú, hi n tr ng môi trư ng và d ch b nh trong nuôi tôm sú. 2. Các y u t nh hư ng n i u ki n s ng c a tôm. 3. Hi n tr ng ô nhi m môi trư ng và d ch b nh trong nuôi tôm thâm canh. 4. Các ch t c sinh ra t quá trình phân h y ch t th i trong ao nuôi thâm canh (NH3, H2S và NO2-). 5. X lý ô nhi m môi trư ng b ng phương pháp sinh h c. 6. Vai trò c a vi khu n phân h y h u cơ. 7. c i m sinh h c c a vi khu n Bacillus. 8. Các quá trình chuy n hoá nitơ vô cơ và vai trò các nhóm vi khu n nitrate hóa (Nitrosomonas và Nitrobacter). 9. K thu t PCR và ng d ng trong nuôi tr ng th y s n 10. K thu t gi i trình t nucleotid trong ADN. 11. ng d ng k thu t PCR nh danh vi khu n trong NTTS. T t ng quan tài li u cho th y chưa có công trình nào nghiên c u hoàn ch nh v qu n th vi khu n phân h y h u cơ và chuy n hóa m trong ao nuôi tôm sú thâm canh, c bi t là xác nh ư c các vi khu n h u ích chi m ưu th trong ao nuôi tôm thâm canh có ngu n g c t t nhiên. T t c các nghiên c u trên là cơ s hư ng t i vi c qu n lý ch t lư ng nư c b ng bi n pháp sinh h c, làm cơ s ph c v cho ngh nuôi tôm sú phát tri n b n v ng. 4
Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 Th i gian và a i m nghiên c u Th i gian thu m u t tháng 3/2008 n tháng 8/2008 t i p Tân Tĩnh, xã Vĩnh Hi p, huy n Vĩnh Châu, t nh Sóc Trăng. Th i gian phân tích m u t tháng 3/2008 n tháng 10/2008 t i B môn Th y sinh h c ng d ng, Khoa Th y s n, Trư ng i h c C n Thơ. Th i gian nh danh vi khu n t tháng 8/2009 - 8/2011 t i Vi n Nghiên c u và Phát tri n Công ngh sinh h c, trư ng i h c C n Thơ và Công ty Nam khoa, TP. H Chí Minh. 2.2 i tư ng nghiên c u: Tôm sú (Penaeus monodon) giai o n u trùng và tôm thương ph m, vi khu n Bacillus sp., Nitrosomonas sp. và Nitrobacter sp. 2.3 Chu kỳ thu m u Chu kỳ thu m u ư c th c hi n trư c và sau khi th tôm m t ngày. Sau ó gi chu kỳ thu m u 2 tu n/l n cho n khi k t thúc v nuôi (5,5 tháng). 2.4 c i m ao nuôi, ch chăm sóc tôm và bón vi sinh trong ao thu m u 2.5 Các bư c chu n b trư c khi thu m u 2.6 Thi t b , d ng c và hóa ch t 2.6.1 Thi t b và d ng c thí nghi m 2.6.2. Môi trư ng và hóa ch t 2.7 Phương pháp phân l p và nh danh vi khu n trong ao 2.7.1 Phương pháp thu m u n n áy (Somsiri et al., 2006) M u bùn ư c thu b ng h th ng ng PVC ã ư c ti t trùng b ng dung d ch c n 70%. M u ư c gi l nh b ng nư c 5
á và chuy n v phòng thí nghi m trong vòng 3 - 5 gi , sau ó ư c b o qu n 4 °C và x lý trong vòng 2 gi . 2.7.2 Phương pháp phân l p và nh danh vi khu n 2.7.2.1 Phương pháp phân l p và nh danh Bacillus sp. a) Phương pháp phân l p vi khu n Bacillus: Môi trư ng phân l p Bacillus d a theo Harwood và Archibald (1990). Cách ti n hành phân l p d a theo Nguy n Lân Dũng (1983). Phương pháp c y chuy n và lưu tr vi khu n (th c hi n theo phương pháp c a ng Th Hoàng Oanh và ctv. (2004)). b) Phương pháp nh danh Bacillus sp. nh danh vi khu n b ng phương pháp sinh lý, sinh hóa Các ch tiêu sinh lý, sinh hóa nh danh các ch ng vi khu n phân l p ư c d a theo Andretta et al., (2004). nh danh vi khu n b ng phương pháp sinh h c phân t (1) i v i các ch ng vi khu n B8, B37, B41 và B67, m u vi khu n sinh dư ng ã phát tri n trên môi trư ng th ch nghiêng ư c g i n Công ty Nam Khoa - th c hi n ph n ng PCR và nh danh v i c p m i chung: 16F (5’- TCCAGAGTTTCATCCTGGCTGAC-3’) và 16R (5’- TACCGCGCCTGCTCGCTG-3’). (2) i v i hai ch ng vi khu n B9 và B38 th c hi n quy trình trích ADN, ph n ng PCR khu ch i o n gen c a bán ơn v nh 16S rRNA c a vi khu n b ng c p m i 16F8 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 16R1391 (5’- GACGGGCGGTGWGTRCA-3’) (Eden et al. 1991, Lane, 1991, trích d n b i Kaspari, 2010). Các thí nghi m này ư c th c hi n t i vi n NC & PT Công ngh Sinh h c, ih cC n Thơ theo các bư c sau: - Trích ADN (d a theo phương pháp c a Boon et al., (2002)) - Ki m tra ch t lư ng ADN sau khi trích (Tr n Nhân Dũng, 2011). 6
- Khu ch i vùng gen m c tiêu b ng ph n ng PCR - Ki m tra s n ph m PCR - Gi i trình t o n gen ã khu ch i - Phân tích s li u 2.7.2.2 Phương pháp phân l p và nh danh vi khu n Nitrosomonas sp. a) Phương pháp phân l p vi khu n Nitrosomonas sp Môi trư ng ammonium-calcium-carbonate ư c s d ng phân l p vi khu n Nitrosomonas sp. d a theo phương pháp c a Ehrlich, 1975. Nuôi tăng sinh vi khu n Nitrosomonas sp. ư c th c hi n theo Lewis và Pramer (1958) và MacDonad và Spokes (1980). b) Phương pháp nh danh vi khu n Nitrosomonas sp. nh danh b ng phương pháp ki m tra c i m sinh hóa g m 2 phép th : - Ki m tra kh năng kh NH3 thành NO2- c a nhóm vi khu n AOB: thu c th Griess - Ilosvay ư c s d ng ki m tra kh năng chuy n hóa t NH3 thành NO2- c a nhóm vi khu n oxi hóa ammonium (AOB) sau khi ã nuôi tăng sinh. - Ki m tra hình d ng t bào vi khu n b ng phương pháp nhu m Gram. nh danh b ng phương pháp sinh h c phân t - Phương pháp trích và ki m tra ch t lư ng ADN ư c ti n hành theo các bư c như i v i vi khu n Bacillus sp. (m c 2.7.2.1). - Khu ch i vùng gen m c tiêu b ng ph n ng PCR: ph n ng PCR ư c th c hi n khu ch i vùng gen m c tiêu c a gen 16S rRNA amoA v i c p m i AmoA 1F: 5’-GGG GTT TCT ACT GGT GGT-3’ và 2R: 5-CCC CTC KGS AAA GCC TTC-3’ (Rotthauwe et al., 1997). 7
- Gi i trình t DNA nh danh loài: s n ph m PCR c a các ch ng vi khu n ư c g i n Phòng xét nghi m Nam Khoa - BIOTEK th c hi n nh danh. 2.7.2.3 Phương pháp phân l p và nh danh vi khu n Nitrobacter sp. a) Phương pháp phân l p vi khu n Nitrobacter sp. Môi trư ng nitrite-calcium-carbonate s d ng cho phân l p vi khu n Nitrobacter sp. d a trên phương pháp c a Ehrlich, 1975. Môi trư ng Aleem và Alexander, 1960 ư c s d ng nuôi tăng sinh vi khu n Nitrobacter. b) Phương pháp nh danh vi khu n Nitrobacter sp. nh danh b ng phương pháp ki m tra c i m sinh hóa g m 2 phép th - Ki m tra kh năng kh NO2- thành NO3- c a nhóm vi khu n oxy hóa nitrite (NOB): thu c th Griess - Ilosvay ư c s d ng ki m tra kh năng chuy n hóa t NO2- thành NO3- c a nhóm vi khu n NOB sau khi ã nuôi tăng sinh. - Ki m tra hình d ng t bào vi khu n b ng phương pháp nhu m Gram. nh danh b ng phương pháp sinh h c phân t - Phương pháp trích và ki m tra ch t lư ng ADN ư c ti n hành theo các bư c như i v i vi khu n Bacillus sp. (m c 2.7.2.1). - Khu ch i vùng gen m c tiêu b ng ph n ng PCR: th c hi n ph n ng PCR v i primer PNGT 1F: 5’- TTT TTT GAG ATT TGC TAG - 3’. PNTG 2R: 5’- CTA AAA CTC AAA GGA ATT TGA - 3’ là m i chuyên bi t nh n di n nhóm Nitrobacter (Degrange và Bardin, 1995) khu ch i vùng gen m c tiêu c a gen 16S rRNA c a nhóm vi khu n Nitrobacter sp. - Gi i trình t ADN nh danh loài: ư c th c hi n t i Vi n NC & PT Công ngh Sinh h c, trư ng i h c C n Thơ. 8
2.8 Phương pháp xác nh bi n ng ch t lư ng nư c và vi khu n trong ao nuôi tôm sú 2.8.1 Phương pháp thu m u và xác nh ch t lư ng nư c và bùn áy ao 2.8.1.1 Phương pháp thu m u Nhi t , pH, m n ư c o t i hi n trư ng. Các ch tiêu TAN, TSS, NO2-, NO3-, TN, H2S ư c thu và b o qu n l nh (4 °C). DO ư c c nh t i ch b ng hóa ch t. 2.8.1.2 Phương pháp phân tích ch t lư ng nư c T t c các ch tiêu môi trư ng ư c phân tích theo phương pháp chu n (APHA, et al., 1995). Các hóa ch t ư c s d ng trong phân tích có xu t x t c (Merck). 2.8.1.3 Phương pháp xác nh m t vi khu n a) Xác nh m t M t vi khu n t ng s và Vibrio b ng phương pháp m khu n l c (Baumann et al., 1980). Môi trư ng Tripticase Soya Agar (TSA) thêm 1,5% NaCl và môi trư ng Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar (TCBS) ư c s d ng xác nh m t vi khu n t ng và Vibrio. M t s vi khu n ư c tính b ng công th c: ơn v hình thành khu n l c (CFU/g bùn) = s khu n l c trung bình × pha loãng × 10. b) Xác nh m t Bacillus sp. d a theo phương pháp c a Nguy n Lân Dũng, 1983; Harwood và Archibald, 1990. S d ng môi trư ng th ch chuyên bi t cho xác nh m t vi khu n Bacillus. M t vi khu n ư c tính như công th c ã trình bày trên. c) Xác nh m t Nitrosomonas và Nitrobacter (Ehrlich, 1975). Phương pháp MPN d a trên nguyên t c xác su t th ng kê s phân b vi khu n trong các pha loãng khác nhau c a m u. ây là phương pháp nh lư ng d a trên k t qu nh tính c a m t lo t thí nghi m ư c l p l i m t s pha 9
loãng khác nhau. Sau ó d a vào b ng th ng kê Mac Crady suy ra giá tr ư c oán s lư ng vi sinh v t trong m u. ơn v tính m t c a 2 nhóm Nitrosomonas và Nitrobacter là MPN/g. 2.9 Các thí nghi m ánh giá hi u qu x lý nư c c a vi khu n ch n l c 2.9.1 Thanh l c vi khu n Các ch ng vi khu n thu c ba nhóm Bacillus sp., Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp. ư c thanh l c ch n ra - ch ng có kh năng phân h y h u cơ, TAN, NO2 t t nh t. 2.9.2 i u ki n b trí thí nghi m ư c ki m soát là như nhau t t c các nghi m th c 2.9.3 nh hư ng c a vi khu n B37, S8 và N10 lên u trùng tôm sú trong h th ng ương tu n hoàn 2.9.3.1 V t li u thí nghi m Loài vi khu n ư c ch n b sung vào h th ng thí nghi m bao g m B37 (B. cereus), S8 (N. nitrosa) và N10 (N. winogradskyi). 2.9.3.2 B trí thí nghi m Thí nghi m g m 3 nghi m th c v i m t vi khu n Bacillus l n lư t là 106 (NT1), 105 (NT2), 104 CFU/mL (NT3) và nghi m th c i ch ng không b sung vi khu n ( C). Trong h th ng l c tu n hoàn còn b sung thêm vi khu n Nitrosomonas và Nitrobacter (m t 104 MPN/mL trên m i loài). Các b ương ư c n i v i b l c tu n hoàn giai o n Mysis 1, h th ng l c ư c v n hành cho n khi k t thúc thí nghi m. M i nghi m th c ư c l p l i 3 l n. u trùng tôm giai o n Nauplius b trí v i m t 150 u trùng/L. M u ư c thu 3 ngày/l n v i các ch tiêu bao g m: pH, nhi t , TAN, NO3-, NO2-, COD, DO, TSS, TN, H2S và 10
m t vi khu n. Thí nghi m ư c k t thúc khi u trùng chuy n sang giai o n PL7. 2.9.3.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khu n a) Nuôi tăng sinh vi khu n Bacillus Môi trư ng nuôi tăng sinh là môi trư ng Luria Bertani (LB, Hình 3.7). M t vi khu n m c ư c xác nh b ng phương pháp o OD t i bư c sóng 600 nm (Leonel et al. 2006). b) Nuôi tăng sinh vi khu n Nitrosomonas và Nitrobacter Hai dòng vi khu n S8 và N10 ư c nuôi tăng sinh trong môi trư ng l ng cho gi ng Nitrosomonas theo Lewis và Pramer (1958) và MacDonad và Spokes (1980) và cho gi ng Nitrobacter theo Aleem và Alexander (1960). 2.9.2.4 Các ch tiêu theo dõi Hình 3.7 Nuôi tăng sinh vi khu n và h th ng thí nghi m Các ch tiêu môi trư ng như pH, DO, COD, TSS, TAN, NO2-, NO3- và TN, và các ch tiêu vi khu n như m t vi khu n t ng s , Vibrio, Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter ã ư c theo dõi (3 ngày/l n) cho n k t thúc thí nghi m. Ch tiêu t l s ng c a tôm ư c xác inh giai o n Zoae3, Mysic2, Postlarvae 1 và Poslarvae 7. 2.9.3.5 Phương pháp thu và phân tích m u ch t lư ng nư c (APHA et al. (1995)). 11
2.9.3.6 Phương pháp thu và phân tích m u vi khu n (xem 2.8.1.3) 2.9.3.7 Phương pháp phân tích m u tôm T l s ng (%) = S u trùng * 100/S lư ng u trùng b trí 2.9.4 nh hư ng c a vi khu n Bacillus B9, B41, B67 lên ch t lư ng nư c b nuôi tôm sú 2.9.4.1 V t li u thí nghi m Ba loài vi khu n B9 (B. cereus), B41 (B. amyloliquefaciens) và B67 (B. subtilis) ã ư c b trí vào b nuôi tôm sú. Tôm gi ng thí nghi m có ngu n g c t tr i gi ng C n Thơ. Ngu n bùn ư c l y t ao nuôi tôm sú t i huy n Vĩnh Châu, t nh Sóc Trăng. 2.9.4.2 B trí thí nghi m Thí nghi m ư c ti n hành v i 4 nghi m th c: Nghi m th c 1 ( C): không c y vi khu n. Nghi m th c 2 (B41): c y vi khu n B. amyloliquefaciens). Nghi m th c 3 (B67): c y vi khu n B. subtilis. Nghi m th c 4 (B9): c y vi khu n B. cereus. 105 - 106 CFU/mL / nghi m th c. M i b ư c b trí m t l p bùn t 4 - 5 cm áy b . M t th tôm 30 con/m2. M i nghi m th c ư c l p l i 3 l n. Trong su t quá trình thí nghi m, m u vi khu n ư c thu trư c khi b sung vi khu n và ti p theo nh kỳ 2 tu n thu m u m t l n cho n khi k t thúc thí nghi m. 2.9.4.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khu n (xem 2.9.3.3) 2.9.4.4 Phương pháp xác nh m t vi khu n (xem 2.9.3.6) 2.9.4.5 Phương pháp thu và phân tích ch t lư ng nư c (APHA et al. (1995)). 2.9.4.6 Cách cho ăn và qu n lý tôm nuôi thí nghi m Tôm ư c cho ăn th c ăn công nghi p Grow Feed 5 l n/ngày (06, 10, 14, 18, 22 gi ). Kh i lư ng tôm ư c xác nh lúc b t u thí nghi m và k t thúc. 12
2.9.4.7 Phương pháp phân tích m u tôm Phương pháp xác nh t c tăng trư ng và t l s ng c a tôm d a theo các tác gi Robertson et al. (2000), Felix và Sudharsan (2004); Venkat et al. (2004). 2.9.5 nh hư ng c a vi khu n Bacillus B8, B37, B38 lên ch t lư ng nư c b nuôi tôm sú 2.9.5.1 V t li u thí nghi m Thí nghi m ư c b trí trong 12 b composite th tích 500 L. Ba loài vi khu n B. cereus (B37), B. cereus. (B38), và B. cereus (B8) ư c ch n thí nghi m. Tôm gi ng có kh i lư ng trung bình là 1 g/con. Nư c bi n 100‰ có ngu n g c t Vĩnh Châu (Sóc Trăng), ư c pha v i nư c máy t m n 16‰. 2.9.5.2 Phương pháp b trí thí nghi m Thí nghi m g m 4 nghi m th c: (1) b sung B. cereus (B37); (2) b sung B. cereus (B38); (3) b sung B. cereus (B8) và (4) i ch ng ( C) không b sung vi khu n. M t vi khu n ư c b sung là 105-106CFU/mL. M t th tôm là 30 con/m2. Vi khu n ư c b sung 5 ngày/l n. Tôm ư c cho ăn 5 l n/ngày. M u ư c thu trư c khi b sung vi khu n và nh kỳ 5 ngày m t l n cho n khi k t thúc thí nghi m. 2.9.5.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khu n (xem 2.9.3.3) 2.9.5.4. Các ch tiêu theo dõi (xem 2.9.4.4 và 2.9.4.5) 2.9.6 Phương pháp x lý s li u S li u ư c x lý v i chương trình Excel và ph n m m Statistica 6.0. T t c các s li u u ư c ki m tra tính ng nh t và phân ph i chu n trư c khi ưa vào x lý One-way ANOVA. S khác bi t gi a các nghi m th c ư c ki m tra b ng phép th Duncan m c ý nghĩa 0,05. 13
Chương 3: K T QU VÀ TH O LU N 3.1 Phân l p và nh danh vi khu n chuy n hóa mt bùn áy ao nuôi tôm 3.1.1 Phân l p và nh danh vi khu n Bacillus 3.1.1.1 Phân l p vi khu n Bacillus ã thu th p ư c 67 ch ng (B1 - B67). T t c các ch ng này ư c lưu tr trong th ch nghiêng 4°C và trong glycerol nhi t -80°C t i khoa Th y s n. 3.1.1.2 nh danh vi khu n Bacillus a) nh danh b ng phép th sinh lý, sinh hóa Hình d ng khu n l c: d ng hình tròn, hơi rìa, khu n l c ph ng, b m t nh n ho c hơi nhăn, màu tr ng c n hơi vàng. T bào vi khu n Bacillus Gram dương, có d ng hình que ng n, ho c que dài tùy thu c vào các loài khác nhau. K t qu nhu m bào t : các t bào dinh dư ng c a vi khu n Bacillus có hi n tư ng hình thành bào t sau 24 gi phát tri n trên b m t môi trư ng th ch. Quan sát các m u vi khu n Bacillus ã nhu m bào t trên kính hi n vi cho th y bào t b t màu xanh c a thu c nhu m Malachite Green và thành t bào vi khu n b t màu h ng c a Safranin. Sau khi ki m tra và ánh giá l i 67 ch ng vi khu n ã thu th p ư c d a trên quan sát hình d ng, c i m, màu s c, kích thư c và th i gian phát tri n c a khu n l c trên môi trư ng th ch cũng như hình d ng và kích thư c t bào vi khu n trên tiêu b n nhu m Gram, nhu m bào t ã lo i b các ch ng vi khu n trùng l p gi a các ao và các t thu m u. ng th i th c hi n các thí nghi m xác nh kh năng hình 14
thành n i bào t và ph n ng catalase dương tính c trưng c a các loài thu c gi ng Bacillus. K t qu xác nh ư c 9 ch ng vi khu n khác nhau (B2, B6, B7, B8, B9, B37, B38, B41, B67). Chín ch ng vi khu n này ư c thanh l c v i m c ích ch n ra ch ng có kh năng phân h y h u cơ t t nh t, nên ch có 6/9 ch ng vi khu n ư c ch n l c (B8, B9, B37, B38, B41 và B67). Các ch ng này ư c tr trên môi trư ng th ch nghiêng 4ºC và trong glycerol -80°C s d ng cho các nghiên c u ti p theo. Hình 4.1: Hình d ng vi khu n Bacillus b. T bào Bacillus (v t C. Bào t Bacillus (v t a. Khu n l c Bacillus kính 100 X) kính 100 X) b) nh danh b ng k thu t sinh h c phân t M 1 2 1 2 M 3 4 1000 bp 500bp 200bp 100bp (a) (b) Hình 4.3: K t qu i n di s n ph m PCR (a) B9 (gi ng 2), i ch ng âm (gi ng 1), M: thang chu n ADN 200 bp (Fermentas); (b) B37, B67, B41, B8(gi ng 1-4), M: thang chu n ADN 100bp (Fermentas)) 15
- K t qu nh n di n vi khu n Bacillus b ng k thu t PCR Hai ch ng B9 và B38 u có s n ph m PCR v trí 1.500 bp d a theo thang chu n (Hình 4.3a). i v i 4 ch ng vi khu n còn l i B8, B37, B41 và B67, s n ph m PCR có kích thư c n m trong kho ng 500 - 600 bp d a trên thang chu n (Hình 4.3b) - K t qu gi i trình t 6 ch ng vi khu n Bacillus B ng 4.3: K t qu so sánh trình t c a các dòng Bacillus ã phân l p Kí Max Total Max Accession Mô t loài hi u score score ident number B9 B. cereus BRL02-43 881 904 97% DQ339674 B38 B. cereus CMST-AP-MSU 894 1024 99% JN038553 B37 B. cereus F837/76 996 998 100% CP003187.1 B67 B. subtilis BL10 887 887 99% GU826165 B41 B.amyloliquefaciens SB 3297 990 990 100% GU191913.1 B8 B. cereus G9842 894 894 99% NC_011772.1 Ghi chú: - Max score: s gi ng nhau gi a trình t các nuleotide ang ki m tra v i các trình t khác trong cơ s d li u. - Total score: t ng s i m c a t t c các c p i m s cao HSP (hight scoring pairs) trong cùng trình t c a cơ s d li u - Max identity: % ng hình cao nh t c a t t c các c p i m s cao HSP ư c xác nh khi so sánh các c p ư c cho i m cao trong cùng 1 cơ s d li u trình t - Accession number: S gia nh p vào cơ s d li u 3.1.2 Phân l p và nh danh vi khu n Nitrosomonas 3.1.2.1 Phân l p vi khu n Nitrosomonas K t qu ã phân l p ư c 8 ch ng vi khu n Nitrosomonas, ký hi u m u ư c li t kê t S5 - S12. Các ch ng vi khu n này ư c lưu tr trong môi trư ng nuôi tăng sinh d ng l ng (Lewis và Pramer, 1958) và l c trên máy l c. Bên c nh ó m u còn tr t ông nhi t -80 °C s d ng cho các nghiên c u ti p theo. 16
3.1.2.2 nh danh vi khu n Nitrosomonas nh danh b ng phép th sinh hóa K t qu nhu m Gram cho th y các ch ng này thu c Gram âm, hình que ng n. M t khác k t qu kh o sát kh năng kh ammonium cho th y t t c các ch ng này u có kh năng kh m nh ammonium giai o n 10 ngày nuôi. Theo mô t v hình d ng vi khu n c a m t s tác gi (Meicklejohn, 1950; Engel và Alexander, 1958; Watson và Mandel, 1997) k t h p v i các k t qu nghiên c u c a Lewis và Pramer (1958), Heselsoe et al. (2001) và Hoàng Phương Hà và ctv (2008) cho th y các ch ng vi khu n ã phân l p u thu c nhóm Nitrosomonas sp. Hình 4.5: K t qu ki m tra c i m sinh hóa Nitrosomonas sp. a. Môi trư ng phân l p b. T bào Nitrosomonas sau khi nhu m Nitrosomonas dương tính v i Gram (v t kính 100 X) thu c th Griess-Ilosvay a nh danh b ng phương pháp sinh h c phân t S n ph m PCR c a ba ch ng S6, S8 và S12 có kh năng kh ammonium m nh nh t ư c s d ng cho nh danh b ng phương pháp sinh h c phân t . - K t qu ph n ng PCR S n ph m PCR c a c 3 dòng vi khu n S6, S8 và S12 u n m v trí kho ng 400 bp d a trên thang chu n (Hình 4.6). 17
i u này ch ng t 3 ch ng vi khu n trên thu c loài vi khu n Nitrosomonas sp. 1 2 3 4 5 M 400 bp 200 bp Hình 4.6: K t qu i n di PCR ng d ng qui trình PCR nh danh vi khu n Nitrosomonas. Gi ng M: thang ADN 200 bp (Fermentas); Gi ng 1: i ch ng âm; Gi ng 2: S6; Gi ng 3: S8; Gi ng 4, 5: S12 - K t qu gi i trình t 3 ch ng vi khu n Nitrosomonas B ng 4.9: K t qu so sánh trình t c a các dòng vi khu n Nitrosomonas phân l p Kí Max Total Max Accession Mô t loài hi u score score ident number S6 Nitrosomonadaceae 3CC11 432 814 99% FJ561357 S8 Nitrosomonas nitrosa 409 409 99% AF272404.1 S12 Nitrosomonas nitrosa 499 499 99% AF272404.1 3.1.3 Phân l p và nh danh vi khu n Nitrobacter 3.1.3.1 Phân l p vi khu n Nitrobacter K t qu ã phân l p ư c 8 ch ng Nitrobacter có kh năng oxy hóa nitrite trong môi trư ng nitrite-calcium-carbonate. Ký hi u m u ư c li t kê t N5 - N12. Các ch ng vi khu n này ư c lưu tr trong môi trư ng Aleem và Alexander, (1960) và l c trên máy l c. Bên c nh ó m u còn tr t ông nhi t -80 °C s d ng cho các nghiên c u ti p theo. 3.1.3.2 nh danh vi khu n Nitrobacter nh danh b ng các phép th sinh lý, sinh hóa 18