Tóm tắt Luận án tiến sĩ Thủy sản: Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

71
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án là sưu tập và chọn lọc bộ chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ ao nuôi tôm cá nước mặn nhằm tạo nguồn vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho nuôi trồng thủy sản.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Thủy sản: Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản Mã ngành: 9620301 NGUYỄN THỊ TRÚC LINH TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (Vibrio parahaemolyticus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Cần Thơ, 2018
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Trương Quốc Phú Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: .................................................................................... Vào lúc ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm ….. Phản biện 1: ............................................................................. Phản biện 2: ............................................................................. Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Isolation and selection of lactic acid bacteria that can antagonize Vibrio parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease in whiteleg shrimp (Penaeus vannamei). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Vol 7 (74-81). 2. Ảnh hưởng của việc bổ sung vi khuẩn lactic vào thức ăn lên khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 52b:122-130.
Chương I GIỚI THIỆU 1.1. Giới thiệu Tôm biển được xem là một trong những sản phẩm có giá trị kinh tế cao và đã trở thành nguồn xuất khẩu chính của nhiều nước trên thê giới như Thailand, Indo, Vietnam, Malaysia,... (FAO, 2013). Tuy nhiên, người nuôi hiện nay đã nuôi tôm với mật số cao nên họ phải đối mặt với rất nhiều rủi ro. Đặc biệt là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND). Bệnh đã gây tác hại rất lớn đối với nhiều ao nuôi ở phía Nam Châu Á (FAO, 2013). Tổng số thiệt hại hàng năm hơn 1 tỷ USD (Zorriehzahra and Banaederakhshan, 2015). Bệnh lần đầu tiên xuất hiện ở Trung Quốc năm 2009, sau đó lan truyền đến Việt Nam năm 2010, Malaysia và Thailand năm 2011, và lan truyền đến Mexico năm 2013 (Tran Loc et al., 2014). Bệnh AHPND xãy ra khoảng 30 ngày sau khi thả giống, tỷ lệ chết lên đến 70% (Zorriehzahra and Banaederakhshan, 2015). Hiện nay, có một số biện pháp để ngăn ngừa bệnh AHPND như dùng hóa chất, kháng sinh và chế phẩm sinh học. Tuy nhiên, dùng hóa chất, kháng sinh thì hiệu quả không cao dễ gây ô nhiễm môi trường và tồn lưu hóa chất và kháng sinh trong cơ thể thịt tôm. Vì thế, cách tốt nhất là sử dụng chế phẩm sinh học Vi khuẩn lactic (LAB) đã được ứng dụng rộng rãi và ngày càng phổ biến trong việc sản xuất chế phẩm sinh học, bổ sung trong thức ăn động vật thủy sản, thức ăn chăn nuôi cũng như việc bón vào ao nuôi để ức chế các loài vi khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản. Trong nghiên cứu về các loài vi khuẩn hữu ích thì có một số dòng vi khuẩn tiết ra chất ức chế đề kháng lại với vi khuẩn khác như 1
Lactobacillus sp. kháng lại vi khuẩn Vibrio sp. (Trịnh Hùng Cường, 2011); Lactobacillus suntoryeus LII1 có khả năng kháng mạnh đối với Escherichia coli và Bacillus cereus (Hồ Lê Huỳnh Châu và ctv., 2010). Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh ra acid hữu cơ, chúng ức chế vi khuẩn gây bệnh do sự tác động lên tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ của màng tế bào (Fooks et al., 1999; Jay, 2000; Gerald, 1999; Kuipers et al., 2000). Các nghiên cứu vừa nêu đã chỉ ra rằng LAB có khả năng tiết ra chất ức chế vi khuẩn gây bệnh. Việc nghiên cứu khả năng phòng trị bệnh của các chủng vi khuẩn là rất khả thi và đặc biệt là việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Vi thế, nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích sử dụng LAB đối kháng với V. parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm. 1.2. Mục tiêu tổng quát Sưu tập và chọn lọc bộ chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ ao nuôi tôm cá nước mặn nhằm tạo nguồn vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho nuôi trồng thủy sản. 1.3. Mục tiêu cụ thể Sưu tập và chọn lọc các chủng vi khuẩn lactic từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi và bùn đáy ao nuôi tôm đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) trên tôm he, từ đó sử dụng chúng để phòng bệnh AHPND trên đàn tôm nuôi. 1.4. Ý nghĩa nghiên cứu Luận án đã sưu tập và chọn lọc bộ chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ ruột cá rô phi và ruột tôm thẻ nhằm góp phần tạo nguồn vi khuẩn hữu ích có khả năng ngăn 2
ngừa bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm nước lợ nói chung và tôm thẻ nói riêng. Đồng thời, các chủng LAB này có thể sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho nuôi trồng thủy sản, đóng góp vào sự phát triển nông nghiệp theo hướng bền vững. Luận án đã góp phần mở rộng cơ hội cho người nuôi tôm giảm thiểu việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi tôm vùng ven biển, đồng thời tạo ra sản phẩm sạch và giảm thiểu ảnh hưởng tiêu cực của nghề nuôi đến môi trường xung quanh. 1.5. Điểm mới của luận án Luận án đã sàng lọc được 12 chủng LAB có khả năng kháng tốt với V. parahaemolyticus với đường kính vòng vô khuẩn từ 16,5-18,5mm. Trong đó có 05 chủng có khả năng kháng V. parahaemolyticus rất tốt, đường kính vòng vô khuẩn là 17,5-18,5mm. Luận án đã định danh được chủng LAB có khả năng làm giảm thiểu đáng kể bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trong nuôi tôm thẻ là chủng Lactobacillus plantarum khi trộn vào thức ăn. Chủng vi khuẩn này có thể được sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học. Luận án đã xác định được khi bổ sung các thành phần acid glutamic, KH2PO4, K2HPO4, và đường trehalose theo tỷ lệ C, N, và P theo tỷ lệ 15, 1 và 0,1 đã làm tăng sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh hoại tử cấp tính, đồng thời làm tăng khả năng gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ. 3
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Phân lập LAB từ nhiều nguồn khác nhau a) Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu Mẫu tôm thẻ được thu ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng, ở mỗi tỉnh thu 6 ao và mỗi ao thu 5 con tôm. Tôm được lựa chọn thí nghiệm phải khỏe mạnh và có kích cỡ khoảng 20g/con. Mẫu cá rô phi được thu ở các ao lắng và các ao nuôi tôm kết hợp với kích cỡ khoảng 100 gam/con. Địa điểm, cách thu mẫu cá rô phi cũng được thực hiện giống như thu mẫu tôm. Mẫu bùn được thu ở các ao thu mẫu tôm thí nghiệm (Somiri et al., 2006). Trong mỗi ao, mẫu được thu 3 vị trí (đầu ao, giữa ao, và cuối ao) và lượng bùn thu tại mỗi vị trí khoảng 100 g. Mẫu thu tại 3 vị trí của cùng 1 ao được trộn lại với nhau (mẫu hổn hợp), giữ lạnh bằng nước đá trong thùng xốp và chuyển về phòng thí nghiệm. b) Phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm, ruột cá rô phi và bùn đáy ao nuôi tôm (Nirunya et al., 2008) Mẫu tôm và cá rô phi được rửa sạch bằng nước cất vô trùng và khử trùng bên ngoài bằng ethanol 70o, tiếp theo dùng dụng cụ giải phẫu để tách lấy toàn bộ ruột tôm và ruột trước của cá rô phi cho vào lần lượt từng ống nghiệm chứa 5 mL nước muối sinh lý đã được khử trùng. Sau đó, dùng que thủy tinh nghiền cho đến khi mẫu đã đồng nhất với nước muối sinh lý, để lắng khoảng 5 phút sau đó hút 1 4
mL lấy dịch trong cho vào 5 mL môi trường MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl. Đối với mẫu bùn, cân 1 gam mẫu hỗn hợp cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước muối sinh lý đã tiệt trùng, lắc đều mẫu bằng máy trộn, để lắng, sau đó hút 1 mL phần dịch trong cho vào ống nghiệm có chứa 5 mL môi trường MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl. Các ống nghiệm nuôi cấy LAB được ủ ở 28o C trong 48 giờ. Sau khi ủ, dịch nuôi được pha loãng thành 10-1, 10- 2 , 10-3 trong muối sinh lý. Kế đến, hút lần lượt 50 µL từ các ống nghiệm có độ pha loãng nêu trên trải lên môi trường MRS agar (có bổ sung 1,5% NaCl và CaCO3 1%) rồi đem ủ ở 280 C trong 48 giờ. Sau đó tiến hành chọn khuẩn lạc có màu trắng đục hoặc không màu và có khả năng làm tan CaCO3, cấy ria ra các đĩa petri có chứa môi trường MRS agar để tách ròng. 3.3.2. Xác định tính đối kháng của chủng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn V. parahaemolyticus trong điều kiện in vitro (Sivakumar et al., 2012) Vi khuẩn V. paraheamolyticus được nuôi sinh khối trong môi trường TSB có bổ sung 1,5% NaCl trong 24 giờ. Sau đó sử dụng tăm bông tiệt trùng nhúng vào ống nghiệm đã nuôi vi khuẩn và tán đều trên các đĩa petri chứa môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl, đặt vào tủ mát 40 C khoảng 1 giờ. Sau khi làm mát, mỗi đĩa petri được đục 4 lỗ để tạo các giếng có đường kính 6 mm. Các chủng LAB (94 chủng) dùng trong thí nghiệm xác định tính đối kháng được nuôi trong ống nghiệm có chứa 5 mL MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl, ủ ở 280C trong 48 giờ. Tiếp theo hút 1mL dịch nuôi cấy cho vào ống tuýp (1,5 mL), ly tâm 10000 rpm trong 20 phút ở 40 C để 5
lấy phần dịch trong. Sau đó hút 50 µL phần dịch trong bơm vào mỗi giếng. Trên mỗi đĩa petri, bơm dịch trong vào 3 giếng, giếng còn lại được bơm vào nước cất vô trùng. Các đĩa petri này sau đó được ủ ở 28o C trong 24 giờ. Sau khi ủ, khả năng kháng V. parahaemolyticus của LAB được xác định thông qua sự hình thành vòng vô trùng. Mức độ kháng khẩn V. parahaemolyticus của LAB được đánh giá dựa trên đường kính của vòng vô trùng (Sivakumar et al., 2012). 3.3.3. Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp khi bổ sung các chủng LAB vào thức ăn Thí nghiệm được tiến hành trong bể kính có thể tích 30 L, bể thí nghiệm được rửa bằng nước sạch sau đó khử trùng trước khi sử dụng. Nguồn nước được xữ lý và loãng với nước ngọt để có độ mặn 20‰. Tôm thẻ chân trắng kích cỡ trung bình khoảng 1g/con thì tiến hành bố trí thí nghiệm. Trước khi bố trí, tôm được kiểm tra bằng phương pháp PCR, những mẻ tôm không mang mầm bệnh WSSV và AHPND. Sau khi bố trí vào các bể thí nghiệm, tôm được thuần dưỡng 3 ngày cho quen với điều kiện môi trường. Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Nguyễn Trọng Nghĩa và ctv., 2015) được phục hồi trong môi trường nutrient broth (NB, Merck) có bổ sung 1,5% NaCl (NB+), sau đó ủ ở 280C trong 18 giờ. Ghi nhận màu sắc và hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram để kiểm tra tính thuần của vi khuẩn. Khuẩn lạc vi khuẩn thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường 6
NB+ ở 280C trong 18 – 24 giờ sau đó xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm. Năm chủng LAB (T3.1, RP5.4.1, T4.2, RP5.5.1, RP6.5) đã xác định có khả năng kháng mạnh nhất với vi khuẩn V. parahaemolyticus được nuôi sinh khối trong môi trường 100 mL MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl trong 48 giờ. Điều chỉnh để đạt mật số 109 CFU/mL. Tiếp đến, đem ly tâm LAB với tốc độ 7000 vòng trong 5 phút, rửa lại 3 lần bằng nước muối sinh lý đã tiệt trùng, sau đó từng chủng LAB sẽ được hòa đều vào 10 mL nước muối sinh lý và trộn đều vào 100g thức ăn và áo bằng 1mL dầu mực bên ngoài. Thức ăn được cho vào túi ni lon, dán nhãn bảo quản ở 40C cho đến khi sử dụng. Phương pháp cảm nhiễm được thực hiện theo phương pháp Loc Tran et al. (2013). Tôm được ngâm trong dung dịch vi khuẩn V. parahaemolyticus mật độ 2 x 107 CFU/mL trong 15 phút sau đó vớt và bố trí vào bể thí nghiệm đã được bổ sung vi khuẩn V. parahaemolyticus với mật độ vi khuẩn của nước trong bể ở 106 CFU/mL. Đối với nghiệm thức đối chứng âm tiến hành ngâm tôm trong môi trường TSB (có bổ sung 1,5% NaCl) tiệt trùng và cho vào bể không bổ sung vi khuẩn. Mẫu gan tụy tôm dùng trong phân tích mô bệnh học được thu khi tôm có dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn, ruột rỗng sau 3 ngày cảm nhiễm với V. parahaemolyticus. Ngoài ra, mẫu còn được thu (3 con/bể) khi kết thúc thí nghiệm. 7
a) Ảnh hưởng của việc bổ sung vi khuẩn lactic vào thức ăn lên tỷ lệ sống và khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần (36 lô thí nghiệm). Các nghiệm thức thí nghiệm gồm: 1. ĐCA: Tôm ăn thức ăn không bổ sung LAB và không gây cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus. 2. LAB1: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng T3.1 và không gây cảm nhiễm. 3. LAB2: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng RP5.4.1 và không gây cảm nhiễm. 4. LAB3: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng T4.2 và không gây cảm nhiễm. 5. LAB4: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng RP5.5.1 và không gây cảm nhiễm. 6. LAB5: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng RP6.5 và không gây cảm nhiễm. 7. ĐCD: Tôm ăn thức ăn không bổ sung LAB và gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus. 8. VP-LAB1: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng T3.1 và gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus. 9. VP-LAB2: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng RP5.4.1, gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus. 10. VP-LAB3: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng T4.2 và gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus. 11. VP-LAB4: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng RP5.5.1, gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus. 8
12. VP-LAB5: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng RP6.5, gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus. Thí nghiệm được tiến hành trên bể kính chứa 20 L nước có độ mặn 20‰, sục khí liên tục trong thời gian thí nghiệm. Mỗi bể thí nghiệm bố trí 30 con tôm khỏe với 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức thí nghiệm, kích cỡ trung bình 1g/con. Ở nghiệm thức ĐCA và ĐCD, tôm được cho ăn bằng thức ăn viên CP chứa 40% đạm. Ở các nghiệm thức còn lại, tôm được cho ăn thức ăn cùng loại nhưng có bổ sung các chủng LAB với mật số 109CFU/g trong suốt thời gian thí nghiệm. Tôm được cho ăn 3 lần mỗi ngày vào lúc 7, 13, và 17 giờ, cho ăn theo nhu cầu. Bảy ngày sau khi được bổ sung LAB ở các nghiệm thức thí nghiệm bao gồm nghiệm thức 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, và 12, tôm được gây cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus, sau đó thí nghiệm được tiếp tục theo dõi trong thời gian là 14 ngày. Các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình thí nghiệm bao gồm: - Tỷ lệ sống của tôm sau khi cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus 14 ngày. - Theo dõi và ghi nhận dấu hiệu bệnh lý và khả năng kháng bệnh ở tôm bằng cách tiến hành thu mẫu và phân tích mô bệnh học sau khi cảm nhiễm. b) Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp của các chủng LAB trong điều kiện có bổ sung các thành phần C, N, P (acid glutamic, KH2PO4, K2HPO4, và đường trehalose) Thí nghiệm sử dụng acid glutamic (C5H9NO4) là nguồn cung cấp C và N. Đường trehalose cũng là nguồn cung cấp C. KH2PO4 và K2HPO4 là nguồn cung cấp P với tỷ lệ C, N, P là 15, 1, 0,1. Nhịp bổ sung là 7 ngày/lần. 9
Các chủng LAB và vi khuẩn V. parahaemolyticus dùng trong thí nghiệm này cũng chính là các chủng đã được sử dụng ở thí nghiệm ở Mục 3.3.3a. Tuy nhiên, trong thí nghiệm này chỉ chọn 3 chủng có khả năng phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính là chủng LAB1, LAB2 và LAB5 để thực hiện. Thí nghiệm được bố trí với 10 nghiệm thức. Các bước thí nghiệm cũng được thực hiện tương tự như thí nghiệm ở mục 3.3.3a với 10 nghiệm thức: 1. ĐCA: Tôm ăn thức ăn không bổ sung LAB và không gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus, không bổ sung C, N, P. 2. ĐCA+CNP: không cảm nhiễm V. parahaemolyticus, cho ăn thức ăn không chứa LAB, có bổ sung C, N, P. 3. ĐCD: có cảm nhiễm V. parahaemolyticus, cho ăn thức ăn không chứa LAB, không bổ sung C, N, P. 4. ĐCD+CNP: có cảm nhiễm V. parahaemolyticus, cho ăn thức ăn không chứa LAB, có bổ sung C, N, P. 5. LAB1+CNP: cho ăn thức ăn có bổ sung LAB1, không cảm nhiễm V. parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P. 6. VPLAB1+CNP: cho ăn thức ăn có bổ sung LAB1, có cảm nhiễm V. parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P. 7. LAB2+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB2, không cảm nhiễm V. parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P. 8. VPLAB2+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB2, có cảm nhiễm V. parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P. 9. LAB5+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB5, không cảm nhiễm V. parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P. 10. VPLAB5+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB5, có cảm nhiễm V. parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P 10
Các chỉ tiêu theo dõi trong tương tự như Mục 3.3.3a 3.3.4. Định danh chủng LAB có khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Sản phẩm PCR gen 16S rRNA được gởi đến công ty Nam Khoa giải trình tự. Kết quả giải trình tự được so sánh bằng chương trình Blast search trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen của NCBI để định danh loài vi khuẩn. 3.4. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập được tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn bằng phần mềm Excel, so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo phương pháp phân tích ANOVA một nhân tố và 2 nhân tố với phép thử Duncan thông qua phần mềm SPSS 22.0. 11
Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập các chủng LAB và xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa. 4.1.1. Phân lập LAB Trong tổng số 198 mẫu thí nghiệm đã tìm ra 94 chủng LAB được phân lập từ ruột tôm, ruột cá rô phi và bùn đáy ao nuôi tôm biển. Trong tổng số 94 chủng LAB phân lập được có 30 chủng LAB được phân lập ở tỉnh Trà Vinh, 25 chủng được phân lập ở tỉnh Sóc Trăng và 39 chủng được phân lập ở Bến Tre. Số lượng LAB phân lập được nhiều nhất là trong ruột tôm (51/94 chủng), kế đến ruột cá rô phi là 41/94 chủng. Số lượng LAB được phân lập ít nhất ở bùn đáy ao nuôi tôm 2/94 chủng. 4.1.2. Xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của LAB Tất cả các khuẩn lạc có khả năng làm tan CaCO3 được chọn để xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, và sinh hóa cho thấý tất cả các khuẩn lạc của LAB đều có màu trắng đục, tròn, lồi, có kích cỡ 1-2 mm và có khả năng làm tan CaCO3 sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường MRS agar (bổ sung 1,5% NaCl và 1% CaCO3). Kết quả này cũng tương đồng với nghiên cứu của Klaenhammer (1987) vi khuẩn lactic là một nhóm các vi khuẩn Gram dương, chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu khuẩn (cocci) không sinh bào tử. 4.2. Kết quả xác định tính đối kháng của vi khuẩn lactic với vi khuẩn V. parahaemolyticus. 12
Kết quả xác định tính đối kháng của LAB với V. parahaemolyticus ở Trà vinh được thể hiện qua Hình 1 Hình 1: Khả năng kháng khuẩn của LAB với V. parahaemolyticus được phân lập tại Trà Vinh Kết quả xác định tính đối kháng với V. parahaemolyticus của các chủng LAB đã cho thấy hai chủng LAB có khả năng kháng với V. parahaemolyticus nhưng đường kính kháng khuẩn yếu (+) nhỏ hơn 11 mm và 20 chủng LAB có khả năng kháng V. parahaemolyticus ở mức trung bình (++), với đường kính vô trùng (11.00 - 16.00 mm). Tám chủng LAB còn lại có khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus với vòng kháng khuẩn lớn (+++), đặc biệt là đối với chủng LAB phân lập từ ruột cá rô phi và ruột tôm RP5.4.1, RP5.5.1 và T4.2 có vòng tròn kháng khuẩn lớn nhất tương ứng là 18,2±0,289 mm, 18 mm và 17,5 mm. Do đó, các chủng LAB này có thể sử dụng làm chế phẩm sinh học. Kết quả tương tự cũng được Nguyễn Văn Minh và ctv. (2014) đã nghiên cứu Bacillus polyfermenticus F27 đối kháng với vi khuẩn V. 13
parahaemolyticus NT7 với đường kính lớn nhất là 18,5 mm và có khả năng sử dụng làm chế phẩm sinh học. Kết quả xác định tính đối kháng của vi khuẩn lactic với V. parahaemolyticus ở Sóc Trăng được thể hiện qua Hình 2 A B Hình 2: Khả năng kháng khuẩn của các chủng LAB với V. parahaemolyticus thu tại Sóc Trăng Nhìn chung, kết quả từ Hình 2 đã cho thấy rằng các chủng LAB đã được phân lập ở Sóc Trăng mặc dù có khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus nhưng vòng kháng khuẩn không lớn từ 11-15mm. Kết quả xác định tính đối kháng của LAB với V. parahaemolyticus ở Bến Tre được thể hiện qua Hình 4.3 A B 14
Hình 3: Khả năng kháng khuẩn của LAB với V. parahaemolyticus thu tại Bến Tre Kết quả từ biểu đồ đã chỉ ra rằng có 14 chủng LAB có khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus với đường kính vô trùng rất yếu (+) nhỏ hơn 11.00 mm. Hai mươi mốt chủng LAB có khả năng kháng với V. parahaemolyticus với vòng kháng khuẩn trung bình (++) vòng kháng khuẩn 11.00-16.00 mm. Bốn chủng còn lại có khả năng kháng mạnh với vi khuẩn V. parahaemolyticus với đường kính của vòng vô trùng lớn hơn 16 mm (+++). Chủng vi khuẩn tạo ra vòng kháng khuẩn lớn nhất là RP6.5 và T3.1, chủng vi khuẩn này được phân lập từ ruột cá rô phi và ruột tôm với vòng kháng khuẩn lớn hơn 17 mm. Điều này có thể khẳng định rằng chủng vi khuẩn được xác định là có tiềm năng trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính là chủng RP6.5 và T3.1. Tóm lại, hầu hết vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng với vi khuẩn V. parahaemolyticus nhưng có 5 chủng 15
được lựa chọn sử dụng để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm biển là T3.1, RP5.4.1, T4.2, RP5.5.1, RP6.5. 4.3. Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của các chủng LAB bằng phương pháp cho ăn. 4.3.1. Ảnh hưởng của việc bổ sung LAB vào thức ăn lên tỷ lệ sống và khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng a) Ảnh hưởng của LAB lên tỷ lệ sống của tôm thẻ Khi bổ sung các chủng LAB vào thức ăn, tỷ lệ sống của tôm thẻ có cải thiện đáng kể. Kết quả này được thể hiện qua hình 4 Hình 4. Tỷ lệ sống của tôm thẻ được cho ăn thức ăn có bổ sung LAB Ghi chú: a, b, c, d : các số liệu biểu thị trên cột có chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Số liệu ở Hình 4 cho thấy tôm có tỷ lệ sống cao nhất ở nghiệm thức bổ sung LAB5 (92,23%), kế đến là nghiệm thức LAB2 (90%) và thấp nhất là nghiệm thức VP+LAB3 16
(29,97%) và nghiệm thức đối chứng dương (45,57%). Kết quả thí nghiệm còn chỉ ra rằng khi trộn LAB vào thức ăn trong điều kiện không cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus, tôm thẻ có tỷ lệ sống khá cao và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng âm. Cụ thể là ở nghiệm thức bổ sung LAB (LAB1, LAB2, LAB3, LAB4, LAB5) vào thức ăn, tỷ lệ sống lần lượt là 88,9; 90; 86,6; 82,23%; và 92,23%. Các nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng âm (87,77%). Kết quả này tương tự như nghiên cứu của Aly et al. (2008), Lactobacillus có khả năng làm tăng tỷ lệ sống của động vật thủy sản khi được bổ sung vào thức ăn. Đối với các nghiệm thức có cảm nhiễm V. parahaemolyticus thì tỷ lệ sống của tôm trong nghiệm thức VP+LAB1; VP+LAB2 và VP+LAB5 tương đối cao và khác biệt không có ý nghĩa giữa các nghiệm thức với nhau (lần lượt là 73,37%; 79,97%; và 73,33%) và với nghiệm thức đối chứng âm (87,77%) nhưng lại khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng dương (45,57%). Tóm lại, trong các nghiệm thức có bổ sung LAB1; LAB2 và LAB5, tỷ lệ sống của tôm có cải thiện hơn so với nghiệm thức đối chứng dương. Điều này cũng tương đồng với nghiên cứu của Scharifuzzaman et al. (2011) khi bổ sung vi sinh vật có lợi vào đường ruột sẽ mang lại hiệu quả về mặt dinh dưỡng, tăng đáp ứng miễn dịch và khả năng đề kháng bệnh của vật nuôi. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với với nghiên cứu của Natesan et al.(2012), khi cho tôm sú ăn vi khuẩn Lactobacillus trong điều kiện có cảm nhiễm vi khuẩn V. alginolyticus, tỷ lệ sống cũng được cải thiện từ 20% lên đến 87% trong 10 ngày cảm nhiễm. 17