Luận án Tiến sĩ Vi sinh vật học: Phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh

Chia sẻ: Elysale Elysale | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:277

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là nghiên cứu nhằm tìm kiếm và khai thác tiềm năng của các giống vi khuẩn bản địa có khả năng thúc đẩy tăng trưởng cây mía trong lĩnh vực sản xuất phân bón vi sinh, hướng tới một nền nông nghiệp phát triển bền vững.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Vi sinh vật học: Phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HOÀNG MINH TÂM PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, NHẬN DIỆN VI KHUẨN NỘI SINH VÀ VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY MÍA (Saccharum spp L.) TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM TỈNH TÂY NINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 42 01 07 Cần Thơ, 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HOÀNG MINH TÂM PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, NHẬN DIỆN VI KHUẨN NỘI SINH VÀ VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY MÍA (Saccharum spp L.) TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM TỈNH TÂY NINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 42 01 07 Người hướng dẫn khoa học GS. TS. CAO NGỌC ĐIỆP PGS. TS. NGUYỄN BẢO TOÀN Cần Thơ, 2021
LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin được gửi lời cám ơn đến Thầy, GS. TS. Cao Ngọc Điệp và Thầy, PGS. TS Nguyễn Bảo Toàn, đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện luận án tiến sĩ. Chân thành cảm ơn quý Thầy Cô của trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là các Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học đã truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức bổ ích, kinh nghiệm quý báu, phục vụ quá trình nghiên cứu thực hiện luận án. Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Khoa Sau Đại học và các Phòng Ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Lãnh đạo các đơn vị của Trường Đại học Sài Gòn đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt thời gian làm nghiên cứu sinh. Chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ và Trường Đại học Sài Gòn đã quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian làm nghiên cứu sinh. Chân thành cảm ơn các em sinh viên, học viên cao học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ và các em sinh viên Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên Trường Đại học Sài Gòn đã cộng tác cùng tôi trong thời gian thực hiện thí nghiệm. Chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, Tây Ninh đã hỗ trợ và giúp tôi triển khai thực hiện các thí nghiệm trong chậu và ngoài đồng. Đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc đến em Nguyễn Thị Xuân Mỵ, Nguyễn Tây Khoa, Lê Đức Toàn người đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình triển khai và thực hiện nghiên cứu. Sau cùng xin được gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, những người thân trong gia đình, vợ và các con đã ủng hộ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm nghiên cứu sinh. Hoàng Minh Tâm i
TÓM TẮT Luận án nhằm phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và sản xuất siderophore. Các đặc tính này giúp thúc đẩy sự tăng trưởng và năng suất của mía, đồng thời giảm thiểu lượng phân đạm, lân hóa học cũng như sự ảnh hưởng tiêu cực lên môi trường và sức khỏe con người. Vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía có khả năng cố định đạm và hòa tan lân đã được phân lập trên môi trường Burk, LGI không đạm và môi trường NBRIP chứa phosphate khó tan. Đánh giá khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA, siderophore của các dòng vi khuẩn đã được thực hiện thông qua phương pháp so màu. Định danh các dòng vi khuẩn đã chọn dựa trên trình tự gene 16S rRNA bằng phương pháp sinh học phân tử và công cụ tin sinh học. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật đã được đánh giá trên cây mía trồng trong điều kiện nhà lưới, trong chậu và ngoài đồng. Kết quả là đã phân lập được 422 dòng vi khuẩn, trong đó có 246 dòng vi khuẩn vùng rễ và 176 dòng vi khuẩn nội sinh có cả hai khả năng cố định đạm và hòa tan lân, 101 dòng có khả năng tổng hợp IAA, và 81 dòng có khả năng sinh siderophore. Ba mươi sáu dòng tuyển chọn đã được định danh dựa trên trình tự gene 16S rRNA với mức tương đồng trình tự từ 95 – 100% so với các chủng vi khuẩn có trong cơ sở dữ liệu của Genbank, NCBI. Các dòng vi khuẩn này thuộc về các chi Enterobacter, Burkholderia, Bacillus, Stenotrophomonas, Kosakonia, Serratia, Advenella, Paraburkholderia, Chitinophaga, Herbaspirillum, và Acinetobacter. Mười hai trong số 36 dòng đã định danh được tiếp tục chọn lựa để đánh giá khả năng thúc đẩy sự phát triển của cây mía nuôi cấy mô trồng trong bình Leonard. Hai dòng tốt nhất là vi khuẩn nội sinh cây mía CT4bd (Serratia oryzae) và vi khuẩn vùng rễ cây mía TPD3b (Bacillus subtilis) đã được tiếp tục đánh giá sự thúc đẩy tăng trưởng của cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng. Sự kết hợp của 2 dòng CT4bd và TP3b cho thấy khả năng thúc đẩy sinh trưởng của cây mía cao nhất. Đối với mía trồng trong chậu và ngoài đồng, khi sử dụng phối hợp 2 dòng vi khuẩn với 75% lượng phân N và P đã cho kết quả về năng suất mía ngang bằng với nghiệm thức sử dụng 100% phân N và P hóa học. Ngoài ra, năng suất đường cũng tăng 14%, tương đương 1,02 tấn/ha trong điều kiện trồng ngoài đồng. Hai dòng vi khuẩn tiềm năng CT4bd và TP3b đã được đề xuất tiếp tục khảo nghiệm khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật trên nhiều giống mía khác nhau ở cả vụ mía tơ và mía gốc ở các vùng mía nguyên liệu khác nhau của tỉnh Tây Ninh. Từ khóa: cố định đạm, đất xám, hòa tan phosphate, mía, thúc đẩy tăng trưởng thực vật, vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn vùng rễ. ii
ABSTRACT The thesis aims to isolate, characterize and identify endophytic bacteria and rhizospheric bacteria from sugarcane (Saccharum spp L.) grown on acrisols in Tay Ninh province with capacities of nitrogen fixation, phosphate solubilization, IAA synthesis and siderophore production. These characteristics help promote the growth and yield of sugarcane, while minimizing the amount of chemical nitrogenous and phosphorus fertilizer as well as negative impacts on the environment and human health. Endophytic and rhizospheric bacteria of sugarcane capable of nitrogen fixation and phosphate solubilization were isolated on N-free Burks’ and LGI media and NBRIP media containing insoluble phosphate. Evaluation of nitrogen fixation, phosphorus solubility, IAA and siderophore synthesis of bacterial strains was done through colorimetric method. Identification of selected bacterial strains based on 16S rRNA gene sequence by molecular biology method and bioinformatics tool. The ability to promote plant growth was assessed in sugarcane grown in net houses, pots and field. As a result, 422 bacterial strains were isolated, including 246 rhizospheric isolates and 176 endophytic isolates capable of nitrogen fixation and phosphorus solubilization, 101 isolates are capable of synthesizing IAA, and 81 isolates are capable of producing siderophore. Thirty-six selected strains were identified based on the 16S rRNA gene with sequence similarity from 95 to 100% compared with strains found in Genbank database, NCBI. These strains belong to the genera Enterobacter, Burkholderia, Bacillus, Stenotrophomonas, Kosakonia, Serratia, Advenella, Paraburkholderia, Chitinophaga, Herbaspirillum, and Acinetobacter. Twelve of the 36 identified isolates were selected to evaluate their ability to promote the growth of sugarcane grown in Leonard jars. The two best bacterial strains, the endophytic bacteria CT4bd (Serratia oryzae) and the rhizospheric bacteria TPD3b (Bacillus subtilis), were further evaluated for their ability to promote the growth of potted and field sugarcane plants. The combination of these two isolates showed the highest ability to promote the growth of sugarcane. In terms of sugarcane grown in pots and in the field, when using a combination of the two bacterial isolates and 75% of N and P fertilizer amount, the result was equal to the sugarcane yield of the treatment of 100% chemical N and P fertilizer. In addition, sugar yield also increased by about 14%, equivalent to about 1.02 tons/ha in field trial. These two potential isolates CT4bd and TPD3b have been proposed to continue testing their ability to promote plant growth on many different sugarcane varieties in both plant-cane and ratoon crops in different raw material sugarcane areas of Tay Ninh province. Key words: acrisols, endophytic bacteria, phosphate solubilization, nitrogen fixation, plant growth promotion, sugarcane, rhizospheric bacteria. iii
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................. i TÓM TẮT...................................................................................... ii MỤC LỤC ...................................................................................... v DANH MỤC BẢNG ....................................................................... ix DANH MỤC HÌNH........................................................................ xii Chương 1: GIỚI THIỆU ................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu ................................................. 2 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................... 2 1.2.2. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 3 1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................. 3 1.4. Ý nghĩa nghiên cứu ................................................................... 4 1.5. Thời gian thực hiện và địa điểm nghiên cứu ................................ 4 1.6. Các điểm mới của nghiên cứu..................................................... 5 Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................. 6 2.1. Hiện trạng sản xuất mía đường của tỉnh Tây Ninh ........................ 6 2.1.1. Đặc điểm khí hậu, đất đai của tỉnh Tây Ninh ...................................... 6 2.1.2. Đặc điểm vùng mía đường Tây Ninh ................................................ 10 2.2. Các vấn đề về môi trường và sức khoẻ phát sinh từ việc trồng mía13 2.2.1. Đối với thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ .............................................. 13 2.2.2. Đối với phân bón hoá học ................................................................ 15 2.3. Đa dạng các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía ....................................................................... 17 2.3.1. Các khái niệm vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn liên kết thực vật và vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật .................................... 17 2.3.2. Các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía ..................................................................................................... 19 2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất v
xám ........................................................................................................... 25 2.4.1. Tình hình nghiên cứu về các đặc tính của vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất xám ............................................................................................... 25 2.4.2. Tình hình nghiên cứu về hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn liên kết trên cây mía ...................................................................... 29 2.5. Các phương pháp thường được sử dụng trong nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá và nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía .................... 36 2.5.1. Xử lý mẫu để phân lập vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật ......... 36 2.5.2. Xác định khả năng cố định đạm của vi khuẩn ................................... 40 2.5.3. Xác định khả năng hoà tan lân của vi khuẩn ..................................... 43 2.5.4. Xác định khả năng sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn ......................... 46 2.5.5. Xác định khả năng sản xuất siderophore của vi khuẩn ...................... 48 2.5.6. Định danh vi khuẩn liên kết cây mía dựa trên trình tự gene 16S rRNA ....... 49 2.6. Nuôi cấy mô thực vật và một số kết quả trong vi nhân giống mía 51 2.6.1. Một số nguyên lý và vai trò của nuôi cấy mô thực vật ...................... 51 2.6.2. Quy trình và một số kết quả trong vi nhân giống mía ....................... 52 Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 55 3.1. Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm ................................................. 55 3.1.1. Mẫu đất và cây mía trong thí nghiệm phân lập và khảo sát đặc tính vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật .......................................................... 55 3.1.2. Các giống mía dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vivo của vi khuẩn ..................................................................... 55 3.1.3 Đất trồng mía dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở quy mô trong chậu và ngoài đồng .............................................. 56 3.1.4. Phân bón hoá học dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở quy mô trong chậu và ngoài đồng .................................. 56 3.1.5. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ......................................................... 56 3.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................... 57 3.2.1 Thu thập và xử lý mẫu đất và cây mía ............................................... 57 3.2.2. Phân tích một số chỉ tiêu dinh dưỡng của đất ................................... 58 3.2.3. Xác định mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân trong đất vùng rễ vi
cây mía và sự tương quan với các chỉ tiêu dinh dưỡng đất ......................... 58 3.2.4. Phân lập và bảo quản các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân từ đất vùng rễ cây mía ............................................................. 60 3.2.5. Phân lập và bảo quản các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân nội sinh trong cây mía ............................................................. 61 3.2.6. Mô tả hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn thu được .................................................................................................... 63 3.2.7. Định lượng khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sản xuất IAA in vitro của các dòng vi khuẩn thu được ................................................................. 64 3.2.8. Định tính khả năng sản xuất siderophore của một số dòng vi khuẩn . 67 3.2.9. Định danh một số dòng vi khuẩn có đặc tính tốt bằng phương pháp sinh học phân tử ........................................................................................ 68 3.2.10. Đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía con trồng trong điều kiện nhà lưới......................... 72 3.2.11. Đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng . 74 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................... 79 4.1. Đặc tính dinh dưỡng của đất trồng mía tại tỉnh Tây Ninh và sự tương quan với mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân trong đất .... 79 4.2. Nguồn gốc và đặc tính phân lập của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng tại tỉnh Tây Ninh ........................ 84 4.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng tại tỉnh Tây Ninh ............ 86 4.4. Kết quả định lượng khả năng cố định đạm, hoà tan lân và sản xuất IAA in vitro của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh .................................................................... 88 4.5. Kết quả định tính khả năng sinh siderophore của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh ...................... 93 4.6. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây mía đã tuyển chọn ......................................................................... 95 4.6.1. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn đất vùng rễ .................... 97 4.6.2. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn nội sinh....................... 102 4.6.3. Nhận xét chung về kết quả định danh các dòng vi khuẩn liên kết vii
cây mía và sự chọn lọc dòng cho các thí nghiệm in vivo .................. 107 4.7. Kết quả đánh giá hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới ............................................................... 109 4.7.1. Kết quả nuôi cấy mô cây mía ......................................................... 109 4.7.2. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới ...................... 114 4.8. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tuyển chọn trên cây mía trồng trong chậu ................ 120 4.9. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tuyển chọn trên cây mía trồng ngoài đồng ................ 125 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................... 132 5.1. Kết luận ............................................................................... 132 5.2. Đề xuất ................................................................................ 132 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................. 133 PHỤ LỤC .................................................................................. - 1 - viii
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Sản lượng mía của tỉnh Tây Ninh qua các năm (2015 – 2018), phân theo đơn vị hành chính ................................................................................................ 7 Bảng 2.2: Phân loại và quy mô của các loại đất xám ở Tây Ninh ................................ 8 Bảng 2.3: Diện tích trồng mía của tỉnh Tây Ninh qua các năm (2015 – 2018), phân theo đơn vị hành chính ...................................................................................... 10 Bảng 2.4: Sản lượng mía của tỉnh Tây Ninh qua các năm (2015 – 2018), phân theo đơn vị hành chính .............................................................................................. 11 Bảng 2.5: Liều lượng phân N, P, K cho từng loại đất, mức độ thâm canh ở mỗi vụ mía tơ ................................................................................................................... 12 Bảng 3.1: Thành phần và nồng độ hóa chất của môi trường Burk.............................. 59 Bảng 3.2: Thành phần và nồng độ hóa chất của môi trường NBRIP .......................... 59 Bảng 3.3: Thành phần và nồng độ hóa chất của môi trường TYGA .......................... 62 Bảng 3.4: Thành phần và nồng độ hóa chất của môi trường LGI .............................. 62 Bảng 3.5: Thành phần các chất tham gia phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn đất vùng rễ cây mía ..................................................... 69 Bảng 3.6: Thành phần các chất tham gia phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn nội sinh cây mía .......................................................... 70 Bảng 4.1: Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng trong đất trồng mía của tỉnh Tây Ninh tại 41 điểm thu mẫu ............................................................................ 79 Bảng 4.2: Kết quả xác định mật số vi khuẩn cố định đạm/ hòa tan lân trong đất trồng mía của tỉnh Tây Ninh tại 41 điểm thu mẫu ...................................................... 81 Bảng 4.3: Tương quan tuyến tính giữa mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân với pH, N tổng số, P dễ tiêu và hàm lượng chất hữu cơ trong đất vùng rễ cây mía trồng ở Tây Ninh ......................................................................................... 83 Bảng 4.4: Nguồn gốc của 422 dòng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ và nội sinh cây mía ...................................................................................................................... 84 Bảng 4.5: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 422 dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh ......................................................................................... 86 Bảng 4.6: Kết quả định lượng NH4+, P2O5 và IAA của 30 dòng vi khuẩn đất vùng rễ tuyển chọn .................................................................................................... 89 ix
Bảng 4.7: Kết quả định lượng NH4+, P2O5 và IAA của 36 dòng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn ......................................................................................................... 90 Bảng 4.8: Thông tin về trình tự gene 16S rRNA và các chủng tương đồng với 17 dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây mía tuyển chọn ..................................................... 97 Bảng 4.9: Thông tin về trình tự gene 16S rRNA và các chủng tương đồng với 19 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía tuyển chọn ........................................................ 102 Bảng 4.10 A: Tóm tắt đặc tính của 12 dòng vi khuẩn được tuyển chọn cho các thí nghiệm in vivo ................................................................................................... 108 Bảng 4.10 B: Tóm tắt đặc tính 12 dòng vi khuẩn được tuyển chọn cho các thí nghiệm in vivo (tiếp theo) ....................................................................................... 109 Bảng 4.11: Ảnh hưởng BA lên sự tạo chồi của mẫu cấy đỉnh sinh trưởng của giống mía VN85 – 1859 .......................................................................................... 110 Bảng 4.12: Ảnh hưởng của Kin và BA lên sự nhân nhanh chồi ở giống mía VN85 – 185 ............................................................................................................. 112 Bảng 4.13: Ảnh hưởng NAA lên sự tạo rễ và cây con hoàn chỉnh ở giống mía VN85 – 185 ............................................................................................................. 114 Bảng 4.14: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên số rễ, số lá và chiều cao cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới ........................................................................................................... 115 Bảng 4.15: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khối lượng tươi của rễ, thân, lá và toàn cây ở cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới............................................................................ 117 Bảng 4.16: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khối lượng khô của rễ, thân, lá và toàn cây ở cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới............................................................................ 118 Bảng 4.17: Tóm tắt hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn TPD3b và CT4bd trên các chỉ tiêu tăng trưởng của cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới........... 118 Bảng 4.18 A: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 6 tháng trồng trong chậu ..................................................................... 120 Bảng 4.18 B: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 6 tháng trồng trong chậu (tiếp theo) .................................................... 121 x
Bảng 4.19: Tổng hợp một số kết quả của 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 6 tháng trồng trong chậu .................................................... 124 Bảng 4.20 A: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 12 tháng trồng ngoài đồng .................................................................. 125 Bảng 4.20 B: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 12 tháng trồng ngoài đồng (tiếp theo) ................................................. 126 Bảng 4.21: Tổng hợp một số kết quả của 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 12 tháng trồng ngoài đồng.................................................. 129 Bảng 4.22: Kết quả phân tích một số chỉ tiêu dinh dưỡng đất sau khi thu hoạch....................................................................................................................... 130 xi
DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Các kiểu liên kết giữa vi khuẩn đất có lợi và rễ cây ................................... 17 Hình 2.2: Sơ đồ về các cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn ............... 19 Hình 2.3: Ảnh SEM của chủng B. amyloliquefaciens TF28 có khả năng kháng nấm ........................................................................................................................... 21 Hình 2.4: Ảnh TEM của chủng B. tropica sp. nov. BM27 ........................................ 22 Hình 2.5: Ảnh SEM của Serratia marcescens B4...................................................... 23 Hình 2.6: Hiệu quả của các vi khuẩn hoà tan lân trên cây mía trồng trong điều kiện nhà kính ............................................................................................................. 30 Hình 2.7: Cây mía được chủng P. agglomerans 33.1 so với đối chứng không được chủng sau 30 ngày trồng ................................................................................... 31 Hình 2.8: Tác động của các vi khuẩn vùng rễ cây mía trên sự tăng trưởng của cây bắp ...................................................................................................................... 34 Hình 2.9: Tác động của các vi khuẩn vùng rễ cây mía trên sự nảy mầm của cây đậu Guar, đậu xanh và đậu đũa ........................................................................... 35 Hình 2.10: Hệ vi sinh vật liên kết rễ và phương pháp lấy mẫu tương ứng ................. 37 Hình 2.11: Sơ đồ quy trình nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm liên kết thực vật ở cây không họ Đậu................................................................................................... 38 Hình 2.12: Ảnh hiển vi laser quét kết quả lai tại chỗ phát huỳnh quang của một số vi khuẩn liên kết cây mía ............................................................................... 40 Hình 2.13: Màng mỏng (pellicle) do vi khuẩn cố định đạm tạo thành trong môi trường JNFb không N bán đặc sau 7 ngày nuôi cấy ............................................ 41 Hình 2.14: Sự chuyển màu môi trường trong nuôi cấy trên môi trường đặc và bán đặc với chất chỉ thị BTB ..................................................................................... 42 Hình 2.15: Sự chuyển màu môi trường khi có chất chỉ thị pH và vòng halo chứng minh khả năng hòa tan phosphate của vi khuẩn ............................................... 45 Hình 2.16: Thí nghiệm định tính và định lượng khả năng sản xuất IAA với thuốc thử Salkowski .................................................................................................. 48 Hình 2.17: Màu sắc chỉ thị của siderophore trong phản ứng với CAS lỏng và CAS đặc .................................................................................................................... 49 xii
Hình 2.18: Các giai đoạn cơ bản của một quy trình nhân nhanh giống mía ............... 53 Hình 3.1: Phương pháp đếm sống nhỏ giọt và minh họa kết quả thu được sau khi ủ .......................................................................................................................... 60 Hình 3.2: Phản ứng màu của ammonia, phosphate và IAA với thuốc thử, tương ứng với nống độ các ống chuẩn là 0-1-2-3-4-5 µg/L ........................................ 66 Hình 3.3: Minh họa khảo nghiệm siderophore trên thạch đĩa CAS thông qua phương pháp khuếch tán thạch với đĩa giấy và các kết quả có khả năng thu được .......................................................................................................................... 68 Hình 3.4: Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn đất vùng rễ cây mía ............................................................. 70 Hình 3.5: Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn nội sinh cây mía .................................................................. 71 Hình 3.6: Cụm chồi đã cảm ứng tạo rễ và cây con hoàn chỉnh đã được tách rời ........ 73 Hình 3.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng mía trong chậu theo kiểu lô phụ .................. 76 Hình 3.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng mía ngoài đồng theo kiểu lô phụ.................. 78 Hình 4.1: Xác định mật số vi khuẩn trên môi trường Burk, môi trường NBRIP, và sự tạo vòng hòa tan lân trên môi trường NBRIP ...................................... 81 Hình 4.2: Một số đặc tính phân lập vi khuẩn của vi khuẩn vùng rễ và nội sinh cây mía ..................................................................................................................... 85 Hình 4.3: Hình thái khuẩn lạc và đường kính khuẩn lạc qua kính hiển vi soi nổi của một số dòng vi khuẩn liên kết cây mía .......................................................... 87 Hình 4.4: Kết quả định lượng NH4+, P2O5 và IAA của 8 dòng vi khuẩn tốt nhất ........................................................................................................................... 91 Hình 4.5: Kết quả định tính và định lượng khả năng sản xuất IAA sau 2 ngày nuôi cấy của một số dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh .............. 92 Hình 4.6: Khả năng sản xuất siderophore của một số dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh thông qua khảo nghiệm CAS lỏng ............................. 93 Hình 4.7: Khả năng tạo vòng halo của một số dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh trong khảo nghiệm CAS đặc ................................................... 94 Hình 4.8: Băng 1.500 bp của các sản phẩm khuếch đại trình tự 16S rDNA với cặp mồi 8F và 1492R dành cho vi khuẩn đất vùng rễ ................................................. 95 xiii
Hình 4.9: Băng 900 bp của các sản phẩm khuếch đại trình tự 16S rDNA với cặp mồi p515FPL và p13B dành cho vi khuẩn nội sinh ............................................. 95 Hình 4.10: Kết quả nhuộm Gram và ảnh chụp SEM của một số dòng vi khuẩn. ....................................................................................................................... 96 Hình 4.11: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ tiến hoá giữa 17 dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây mía và 17 chủng tương đồng có trong cơ sở dữ liệu GenBank, NCBI .......... 101 Hình 4.12: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ tiến hoá giữa 19 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía và 17 chủng tương đồng có trong cơ sở dữ liệu GenBank, NCBI. ............... 105 Hình 4.13: Tỷ lệ các chi tương đồng của 17 dòng vi khuẩn vùng rễ và 19 dòng vi khuẩn nội sinh đã định danh. ............................................................................... 107 Hình 4.14: Sự tạo chồi ở mẫu cấy đỉnh sinh trưởng của mía VN85 – 1859 dưới ảnh hưởng của BA........................................................................................... 110 Hình 4.15: Kết quả nhân nhanh chồi ở mía VN85 – 1859 dưới ảnh hưởng của BA và Kin ............................................................................................................... 111 Hình 4.16: Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ ở giống mía VN85 – 185............ 113 Hình 4.17: Các cây mía in vitro trên môi trường nuôi cấy có bổ sung than hoạt tính .......................................................................................................................... 115 Hình 4.18: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên số rễ, số lá và chiều cao cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới ........................................................................................................... 116 Hình 4.19: Cây mía giống K95-156 trồng trong chậu dưới ảnh hưởng của tổ hợp vi khuẩn CT4bd và TPD3b và các mức bón phân N, P ..................................... 123 Hình 4.20: Cây mía giống K95-156 sau 3 tháng trồng ngoài đồng dưới ảnh hưởng của vi khuẩn TPD3b và mức bón 50% phân N, P so với đối chứng không chủng vi khuẩn ............................................................................................. 126 xiv
Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Mía là một cây công nghiệp có giá trị kinh tế quan trọng được trồng tại hơn 110 nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Ngày nay, ngoài sản xuất đường, nhiều sản phẩm có giá trị khác đã được tạo ra từ cây mía như ethanol, nhựa, xơ sợi; đặc biệt là nhiên liệu sinh học (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020). Chính vì thế, việc duy trì và gia tăng năng suất mía đã trở thành trọng tâm nghiên cứu của nhiều quốc gia (Mehnaz, 2011). Nhìn chung tổng diện tích trồng mía trên thế giới tăng dần qua các năm, từ 44.000 nghìn ha ở năm 1961 lên đến 269.434 ha ở năm 2018. Ở một số năm như 1999, 2002, 2003, diện tích trồng mía tăng hơn 300 nghìn ha. Tuy nhiên, trong những năm gần đây diện tích trồng mía đường có phần giảm nhẹ (FAOSTAT, 2020). Trong công nghiệp sản xuất đường, đường mía hiện chiếm trên 60% tổng sản lượng đường thô của toàn thế giới. Ở Việt Nam, nghề trồng mía để sản xuất đường bắt đầu từ những năm 1990. Do thích nghi với điều kiện tự nhiên, cây mía có thể được trồng ở nhiều vùng, miền khắp nước ta (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020). Năng suất mía bình quân của cả nước vào năm 2018 là khoảng 66,6 tấn/ha và sản lượng là 17.945.204 tấn (FAOSTAT, 2020). Năm 2018, theo thống kê sơ bộ từ các Cục thống kê, tổng diện tích trồng mía ở Đông Nam Bộ là khoảng 24.494 ha. Trong đó, Tây Ninh là tỉnh có diện tích trồng mía lớn nhất, gồm 14.669 ha (Cục thống kê tỉnh Tây Ninh, 2019; Tổng cục thống kê, 2018). Chính vì vậy, Tây Ninh có cơ sở để trở thành một vùng mía đường quan trọng của cả nước và của khu vực. Hiện nay, phương thức tổ chức sản xuất và cải tiến kỹ thuật mà các nước, trong đó có Việt Nam, đã áp dụng thành công để tăng năng suất mía là: sản xuất tập trung chuyên canh, cải thiện giống mía, hóa học hóa, thủy lợi hóa và cơ giới hóa, trong đó đặc biệt coi trọng công tác nghiên cứu khoa học. Tuy vậy, theo Thaweenut và cộng sự (2011), ở các nước đang phát triển vẫn có tập quán bón nhiều phân hóa học cho cây mía ở giai đoạn sớm nhằm tăng cường sản lượng và chữ đường. Ở Việt Nam, nghiên cứu cho thấy năng suất mía tơ tăng lên tỷ lệ thuận với lượng phân bón. Lượng phân NPK bón cho 1 ha mía tơ đạt năng suất 70 – 80 tấn là: 180– 200 kg N, 60 – 80 kg P2O5 và 150 – 180 kg K2O. Nếu muốn năng suất tăng lên 90 – 100 tấn/ha, thì lượng phân tương ứng sẽ là: 200 – 250, 80 – 100, và 180 – 220. Ngoài ra, tùy theo loại đất và mức độ thâm canh mà phân bón hoá học được sử dụng với hàm lượng khác nhau. Với đất xám cát và đất xám bạc màu có mức độ thâm canh cao, lượng NPK/ha khuyến cáo là khoảng 200 – 250 kg N, 90 – 100 kg P2O5 và 180 – 200 kg K2O (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020). 1
Việc sử dụng quá nhiều phân hóa học cũng như các chất bảo vệ thực vật không những làm tăng chi phí sản xuất mà còn gây bất lợi đối với cây trồng, ảnh hưởng đến hệ sinh thái, môi trường và sức khỏe con người. Chính vì thế, việc nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn có lợi là một phần trong chiến lược nông nghiệp sinh thái hiện nay. Theo Singh và Singh (2012), việc sử dụng các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật như là các chế phẩm chủng cho cây trồng có khả năng thay thế hoặc bổ sung một phần cho phân bón hóa học, thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ, đồng thời giúp duy trì tính bền vững của năng suất cây trồng và sự an toàn của môi trường. Thực tế đã chứng minh hiệu quả của việc sử dụng phân bón hợp lý và tăng cường ứng dụng vi khuẩn có lợi liên kết thực vật, đặc biệt là các vi khuẩn cố định đạm ở các cây không họ Đậu như lúa, khoai lang và mía. Trong đó, Brazil là một ví dụ điển hình cho các quốc gia sản xuất mía hàng đầu trên thế giới với lượng phân đạm hóa học được sử dụng ở mức thấp nhất (Ridge, 2013; Yoneyama et al., 2017). Mặc dù triển vọng của phân bón vi sinh trong sản xuất nông nghiệp bền vững là rất lớn, song các nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn liên kết thực vật trên cây mía nói chung và cây mía trồng trên đất xám vẫn còn ít được công bố. Trong bối cảnh trên, đề tài nghiên cứu thuộc luận án tiến sĩ “Phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh” đã được thực hiện nhằm tìm kiếm những dòng vi khuẩn bản địa với các đặc tính quý như cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA. Những dòng vi khuẩn này sẽ là nguồn giống cho các nghiên cứu sản xuất các loại phân bón sinh học vừa có khả năng bổ sung các nguyên tố phân bón đa lượng như N và P, vừa có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng của cây trồng nói chung và cây mía nói riêng thông qua sự sản xuất các hormone thực vật. Đây là một hướng nghiên cứu nhằm đảm bảo sử dụng bền vững và hiệu quả các nguồn tài nguyên thiên nhiên trong chiến lược phát triển nông nghiệp bền vững. 1.2. Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1.1 Mục tiêu chung Nghiên cứu nhằm tìm kiếm và khai thác tiềm năng của các giống vi khuẩn bản địa có khả năng thúc đẩy tăng trưởng cây mía trong lĩnh vực sản xuất phân bón vi sinh, hướng tới một nền nông nghiệp phát triển bền vững. 2
1.2.1.2 Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu  Phân lập, nhận diện, tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh và vùng rễ cây mía có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sản xuất hormone tăng trưởng thực vật IAA.  Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng. 1.2.2. Phạm vi nghiên cứu  Vi khuẩn được phân lập từ các mẫu đất vùng rễ và mẫu mô thân, rễ của cây mía trồng tại 7 huyện của tỉnh Tây Ninh (trừ Hoà Thành và thành phố Tây Ninh).  Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía nuôi cấy mô, giống VN-85-1859, trồng trong điều kiện nhà lưới ở giai đoạn 3 tháng tuổi.  Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên các yếu tố cấu thành năng suất, năng suất, và chữ đường của cây mía giống K95-156 trồng trong chậu và ngoài đồng tại Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, ấp Bình Hòa, xã Thái Bình, huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh. 1.3. Nội dung nghiên cứu (1) Phân lập các dòng vi khuẩn có cả hai khả năng cố định đạm và hòa tan lân trong đất vùng rễ và nội sinh cây mía trên môi trường LGI, Burk’s không đạm và NBRIP. (2) Định lượng khả năng cố định đạm và hòa tan lân in vitro của các dòng vi khuẩn đã phân lập. (3) Đánh giá hoạt tính sản xuất IAA và siderophore in vitro của một số dòng vi khuẩn có cả hai khả năng cố định đạm và hòa tan lân. (4) Nhận diện và tìm hiểu quan hệ phát sinh của các dòng có các đặc tính tốt qua kết hợp hình thái tế bào, khuẩn lạc, sinh học phân tử và công cụ tin sinh học. (5) Nhân giống in vitro đối với giống mía VN-85-1859 để tạo nguồn nguyên liệu cây mía con sạch khuẩn. Đánh giá hiệu quả của các vi khuẩn có đặc tính tốt trên các cây mía con trồng trong bình Leonard trong điều kiện nhà lưới. 3
(6) Đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn có hiệu quả tốt sau thí nghiệm ở nội dung thứ 5, dựa trên các yếu tố cấu thành năng suất, năng suất, và chữ đường của mía trồng trong chậu và trồng ngoài đồng. 1.4. Ý nghĩa nghiên cứu Về mặt lý luận Nghiên cứu này nhằm dò tìm và nhận diện vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh có đặc tính thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía trồng trên loại đất xám của tỉnh Tây Ninh. Dựa trên trình tự gene 16S rRNA, xây dựng cây phả hệ để tìm hiểu mối quan hệ giữa các dòng vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh phân lập được từ cây mía trồng ở các địa phương khác nhau của tỉnh Tây Ninh. Kết quả thu được của đề tài sẽ góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về lĩnh vực nông học của Tây Ninh và vùng Đông Nam Bộ về mối quan hệ tương tác của bộ ba “đất, cây trồng và vi sinh vật đất”. Về mặt thực tiễn Đất xám là loại đất có hàm lượng dinh dưỡng thấp nhưng chiếm trên 81% tổng diện tích tự nhiên của tỉnh Tây Ninh. Loại đất này đã được sử dụng để trồng hoa màu và cây công nghiệp, trong đó có cây mía. Chi phí phân bón cho sản xuất mía trên đất xám và đất bạc màu thường cao hơn so với các loại đất khác. Chính vì vậy, nguồn vi khuẩn bản địa mà đề tài đã thu thập được cùng với các thông tin nghiên cứu cơ bản sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu chế tạo và sản xuất phân bón sinh học thân thiện với cây trồng và môi trường của địa phương. 1.5. Thời gian thực hiện và địa điểm nghiên cứu Thu mẫu mía và phân lập, tuyển chọn, nhận diện các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía có khả năng cố định đạm, hòa tan lân được tiến hành từ tháng 10/2015 đến tháng 4/2017. Đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía nhân giống in vitro trồng trong điều kiện nhà lưới được thực hiện từ tháng 4/2017 đến tháng 5/2018. Đánh giá hiệu quả của vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng được thực hiện từ tháng 5/2019 đến tháng 1/2020. Các nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật được thực hiện ở phòng thí nghiệm Vi sinh vật học, phòng thí nghiệm Sinh hóa và phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô (trường Đại học Sài Gòn), phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Vi sinh vật môi trường và phòng thí nghiệm Sinh học phân tử (Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ). 4