Luận án Tiến sĩ chuyên ngành Ký sinh trùng và vi sinh vật học thú y: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút cúm A/H5N1 Clade 7 phân lập ở Việt Nam

Chia sẻ: Phong Hoàng | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:156

Thêm vào BST

Báo xấu

183
lượt xem 21
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ chuyên ngành Ký sinh trùng và vi sinh vật học thú y: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút cúm A/H5N1 Clade 7 phân lập ở Việt Nam nhằm xác định đặc tính di truyền học, tính kháng nguyên và độc lực của virus cúm A/H5N1 Clade 7 phân lập ở Việt Nam năm 2008; tạo cơ sở hiểu biết rõ hơn về virus cúm gia cầm độc lực cao H5N1, góp phần xây dựng biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ chuyên ngành Ký sinh trùng và vi sinh vật học thú y: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút cúm A/H5N1 Clade 7 phân lập ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆ H N I NGUYỄN TÙNG NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE 7 HÂN LẬ Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ CHUYÊN NG NH: KÝ SINH TRÙNG V VI SINH VẬT HỌC THÚ Y H N I, NĂM 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆ H N I NGUYỄN TÙNG NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE 7 HÂN LẬ Ở VIỆT NAM CHUYÊN NG NH: KÝ SINH TRÙNG V VI SINH VẬT HỌC THÚ Y MÃ SỐ: 62.64.01.04 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN BÁ HIÊN TS NGUYỄN VĂN CẢM H N I, NĂM 2013
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: công trình khoa học này là của tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan: mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án đều được cảm ơn. Các thông tin trích dẫn trong luận án đều chính xác và được nêu rõ nguồn gốc. Hà nội, tháng 10 năm 2013 Tác giả Nguyễn Tùng i
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Quản lý Đào tạo, Khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo nghiên cứu sinh tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo và các cán bộ của Trung tâm Chẩn đoán Thú y đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ thuộc bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ long biết ơn sâu sắc đến Thầy giáo, TS Nguyễn Bá Hiên, Khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và TS Nguyễn Văn Cảm – Hội Thú y , là những người thầy hướng dẫn khoa học, trực tiếp giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến những đồng nghiệp công tác tại các tổ chức và cơ quan quốc tế như FAO, CDC, USDA đã hỗ trợ và cung cấp tài liệu cũng như các nguyên liệu cần thiết để tôi thực hiện nghiên cứu. Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành nghiên cứu và luận án. Hà Nội, tháng 10 năm 2013 Tác giả Nguyễn Tùng ii
M CL C Trang Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii cl c iii Danh m c các ký hiệu, các chữ viết tắt v Danh m c các bảng vi Danh m c các hình viii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm 4 1.1.1. Lịch sử bệnh trên thế giới 4 1.1.2. Bệnh cúm gia cầm Việt Nam 7 1.2. Nguyên nhân của bệnh cúm gia cầm 9 1.2.1. Đặc điểm sinh học phân tử của virus cúm gia cầm 10 1.2.2. Kháng nguyên của virus cúm gia cầm 14 1.2.3. Đặc điểm tiến hóa và hình thành genotype của virus cúm gia cầm 20 giai đoạn 1996-2008 1.2.4. Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1 29 1.2.5. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ 30 1.2.6. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm 32 1.2.7. Triệu chứng lâm sàng của gia cầm mắc bệnh cúm 34 1.2.8. Bệnh tích của gia cầm mắc cúm gia cầm 36 1.3. Chẩn đoán bệnh 36 1.3.1. Chẩn đoán dựa vào dịch tễ học 36 1.3.2. Chẩn đoán dựa vào triệu chứng và bệnh tích 36 1.3.3. Chẩn đoán phòng thí nghiệm 37 1.4. Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm 37 1.4.1. Tình hình sử d ng vắc-xin cúm gia cầm trên thế giới 39 1.4.2. Tình hình sử s ng vắc-xin cúm gia cầm tại Việt Nam 41 1.5. Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm Việt Nam 42 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 44 NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung 46 2.1.1. Phân lập và giám định virus cúm gia cầm A H N1 từ các mẫu dịch 46 ngoáy ổ nhớp 2.1.2. Xác định đặc tính di truyền học của virus cúm A/H5N1 clade 7 46 2.1.3. Xác định một số đặc tính sinh học của virus A/H5N1 clade 7 46 2.1.4. Xác định đặc tính kháng nguyên (tính tương đồng kháng nguyên) 46 2.1.5. Xác định hiệu lực của vacxin H5N1 Re-1 46 2.2. Địa điểm nghiên cứu 46 2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 47 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 47 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 47 iii
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 59 3.1. Phân lập và giám định virus cúm gia cầm H5N1 clade 7 59 3.2. Xác định đặc tính di truyền của virus cúm A H N1 thuộc clade 62 phân lập Việt Nam 3.2.1. Giải trình tự gen HA (H ) và phân tích cây phả hệ sử d ng chuỗi 62 gen H5 3.2.2. Giải trình tự gen NA(N1) và phân tích cây phả hệ dựa trên chuỗi 71 nucleotide của gen N1 3.2.3. Giải trình tự gen và phân tích cây phả hệ dựa trên chuỗi 78 nucleotide của gen M 3.3. Xác định một số đặc tính sinh học của chủng virus A/H5N1 clade 84 7 A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 3.3.1. Tính thích ứng trên phôi gà (xác định chỉ số EID50) 84 3.3.2. Tính thích ứng trên tế bào xơ phôi gà (xác định chỉ số TCID50) 89 3.3.3. Kết quả xác định độc lực của virus cúm A/H5N1clade 7 92 3.3.4. Kết quả đánh giá độ bài thải virus trên động vật thí nghiệm 103 3.3.5. Đánh giá khả năng nhiễm đa phủ tạng của virus cúm 106 A/H5N1clade 7 3.3.6. Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng virus cúm A H N1 113 clade phân lập Việt Nam. 3.3.7. Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin Re-1 đối với virus cúm 116 A H N1HA clade trên gà. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 121 Tài liệu tham khảo 124 Công trình công bố liên quan đến luận án 135 Ph l c 136 iv
DANH M C CÁC KÝ HIỆU, CÁC CH VIẾT T T Viết tắt Tên đầy đủ AI Avian Influenza CDC Center of Disease Control and Prevention CEF Chicken Embryo Fibroblast CK Chicken cs cộng sự Ct Cycle Threshold DEF Duck Embryo Fibroblast Dk Duck EID50 Embryo Infection Dose 50% ELD50 Embryo Lethal Dose 50% FAO Food and Agriculture Organisation HA Hemaglutinin HI Hemagglutination Inhibition HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza IHC Immuno Histochemistry LPAI Low Pathogenic Avian Influenza M Matrix protein MDCK Mardine Darby Canine Kidney MDEF Muscovy Duck Embryo Fibroblast MDT Mean Death Time MEGA Molecular Evolution Genetic Analysis NA Neuraminidase NCBI National Center for Biotechonology Information NCVD National Centre for Veterinary Diagnostics NP Nucleoprotein NS Non-strutural protein OIE Office International des Epizooties PA Polymerase acidic PB1 Polymerase basic protein 1 PB2 Polymerase basic protein 2 RNA Ribonucleic acid RRT-PCR Realtime Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction TCID50 Tissue Culture Infection Dose 50% WHO World Health Organisation v
DANH M C CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 1.1. Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A H N1 người báo cáo 6 cho WHO đến 4 2012 1.2. ột số đặc điểm triệu chứng của gia cầm mắc cúm A/H5N1 34 1.3 Một số loại vacxin phòng cúm gia cầm H N1 đang được sử d ng 40 trên thế giới 1.4 Kết quả tiêm phòng vacxin cúm gia cầm chương trình quốc gia 41 2.1. Bảng tổng hợp số liệu tính toán theo phương pháp eed-Muench 49 2.2. Primer và probe để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 52 2.3. Chuẩn bị mix (hỗn hợp phản ứng cho ealtime T-PCR 52 2.4. Chuẩn bị mix (hỗn hợp phản ứng) T-PC giải trình tự gen 55 2.5. Trình tự primer để giải trình tự gen(theo quy trình CDC) 56 3.1. Kết quả xét nghiệm virus từ chương trình giám sát biên giới 60 3.2. Kết quả giải trình tự gen và phân tích cây phát sinh loài các mẫu 62 virus cúm A H N1 phát hiện Lạng Sơn 3.3. Danh sách các chủng virus cúm A H N1 dùng để so sánh và lập cây 66 phát sinh loài dựa trên gen H5 3.4. So sánh mức độ khác biệt về di truyền trên gen HA của chủng 69 virus A H N1 clade với một số chủng tham chiếu 3.5. Danh sách các chủng virus A H N1 sử d ng để so sánh và lập cây 74 phát sinh loài dựa trên N1 3.6. So sánh mức độ khác biệt về di truyền trên gen N1 của 5 chủng 77 virus cúm A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu 3.7. Danh sách các chủng virus cúm A H N1 sử d ng để so sánh và lập 80 cây phát sinh loài dựa trên gen 3.8. So sánh mức độ khác biệt về di truyền trên gen của 5 chủng virus 83 cúm A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu 3.9. Theo dõi thời gian gây chết phôi 85 3.10. Kết quả theo dõi tỷ lệ sống/chết của phôi trứng khi gây nhiễm virus 86 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 3.11. Theo dõi thời gian virus gây nhiễm lên tế bào CEF 89 3.12. Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào trên CEF khi gây nhiễm virus 90 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 3.13. Các axit amin vùng “cleavage site” của virus cúm H N1 độc lực cao 93 clade và một số chủng virus tham chiếu 3.14. Kết quả đánh giá độc lực của virus cúm A/H5N1clade trên gia 95 cầm 3.15. Kết quả theo dõi lâm sàng của gà thí nghiệm 96 3.16. Đánh giá độ bài thải virus khi gây nhiễm b ng virus A/chicken/ 103 Vietnam/NCVD-016/2008 3.17. Kết quả xét nghiệm T-PC đối với một số loại phủ tạng gà gây 107 bệnh b ng virus A H N1 clade và chuyển đổi sang nồng độ virus vi
3.18. Phân bố bệnh tích vi thể và nhuộm IHC phát hiện kháng nguyên 109 virus cúm H N1A chicken Vietnam NCVD-016/2008 3.19. Kết quả xác định đặc tính kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 115 clade phân lập được b ng phản ứng HI 3.20. Kết quả theo dõi thí nghiệm công cường độc gà tiêm vacxin cúm gia 118 cầm H5N1 Re-1 vii
DANH M C CÁC H NH TT Tên hình Trang 1.1. Bản đồ phân bố các ca cúm A/H5N1trên thế giới (tính đến 2009) 5 1.2. Biểu đồ biểu diễn dịch cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 theo thời 8 gian 1.3. (A) ô phỏng hình thái của virus cúm, (B) Hình thái kính hiển vi 10 điện tử 1.4. ô hình hệ gen virus cúm A 14 1.5. ô phỏng cấu trúc kháng nguyên Haemalutinin và Neurminidase 15 1.6. Sơ đồ minh họa đột biến điểm của các phân đoạn genvirus cúm A 20 1.7. Sơ đồ minh họa hiện tượng trộn kháng nguyên của virus cúm 20 A/H5N1và H3N2 1.8. Cây phả hệ dựa trên gen HA các virus cúm A H N1 độc lực cao 22 1.9. Sự tiến hóa của các clade virus A/H5N1 theo thời gian 23 1.10. Sự phân bố của các clades virus cúm gia cầm trên thế giới từ 2003- 24 2009 1.11. Thời gian xuất hiện của các clade H5N1 Việt Nam từ 2001-2007 25 1.12. Hình 1.12. Sự phân bố các clade virus A/H5N1 khác nhau theo 27 không gian 1.13. Các genotype của virus cúm gia cầm A H N1 độc lực cao 28 1.14. ối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A 30 1.15. ô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A tế bào chủ 31 1.16. Minh hoạ vùng “Cleavage site” của virus cúm độc lực thấp(LPAI) 33 2.1. Sơ đồ bố trí primer giải trình tự gen H , N1 và virus cúm A H N1 52 3.1. Hình 3.1. Bản đồ nơi phát hiện được virus A/H5N1 clade 7 61 3.2. Cây phả hệ dựa trên gen H5 của các virus A H N1 clade 7 62 3.3. Hiện tượng chèn và xóa các axit amin tại vị trí cleavage site của các 71 chủng virus A H N1 clade phân lập Việt Nam 3.4. Cây phả hệ dựa trên gen N1 các virus A H N1 clade 73 3.5. Cây phả hệ dựa trên gen các virus A H N1 clade 79 3.6. Kiểm tra đặc tính gây ngưng kết hồng cầu(phản ứng HA) 87 3.7. Kết quả kiểm tra bệnh tích phôi bsau khi gây nhiễm b ng chủng virus 88 cúm A H N1 clade phân lập tại Việt Nam 3.8. Hình ảnh tế bào CEF và DEF khi phân lập và chuẩn độ virus 92 3.9. Một số hình ảnh bệnh tích đại thể gà gây bệnh b ng virus A/H5N1 98 Clade 7 (A/Chicken/Vietnam/NCVD 016) 3.10. ôt số hình ảnh thể hiện bệnh tích đại thể gà gây bệnh b ng 99 virus A H N1 clade 2.3.4 và 2.3.2 viii
3.11. Diễn biến sống/chết của gà sau khi gây nhiễm b ng chủng virus 100 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 3.12. Phân bố virus các cơ quan phủ tạng qua xét nghiệm RRT-PCR 107 (chuyển đổi sang log10) 3.13. ột số hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch phủ tạng gà gây bệnh 110 3.14. ột số hình ảnh bệnh tích vi thể trên phủ tạng gà gây bệnh 111 ix
MỞ ĐẦU Việt Nam là một đất nước nông nghiệp với khoảng 0% dân số sống nông thôn và gắn liền với lĩnh vực sản xuất nông nghiệp như trồng trọt và chăn nuôi. Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gia cầm nói riêng đang ngày càng phát triển và dần chiếm vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta. Trong những năm qua do các tiến bộ kỹ thuật về giống, thức ăn, quản lý, thú y cùng với các biện pháp khuyến khích chăn nuôi của nhà nước làm cho ngành chăn nuôi gia cầm nước ta phát triển với tốc độ tương đối cao. Sự phát triển đó đã mang lại hiệu quả kinh tế cho người dân, tạo nhiều cơ hội việc làm và nâng cao đời sống vật chất tinh thần cho người dân, góp phần xóa đói giảm nghèo và tạo cơ hội vươn lên làm giàu cho nhiều hộ gia đình đồng thời góp phần vào nền kinh tế quốc gia. Tuy nhiên, bên cạnh với sự phát triển đó cũng có rất nhiều thách thức cho ngành chăn nuôi đó là sự gia tăng và diễn biến ngày càng phức tạp của dịch bệnh, trong đó phải kể đến bệnh cúm gia cầm do virus cúm A H N1 độc lực cao thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Đây là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm có tốc độ lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh. Bệnh cúm gia cầm xảy ra lần đầu tiên Việt Nam vào cuối năm 2003 đầu năm 2004 được ghi nhận là do virus cúm A H N1 độc lực cao (HPAI). Kể từ đó cho đến nay dịch cúm gia cầm H5N1 vẫn liên t c xảy ra Việt Nam tuy nhiên quy mô dịch đã thay đổi tr nên nhỏ và lẻ tẻ. Cũng trong những năm qua, các nước trong khu vực châu Á như Nhật Bản, Hàn quốc, Trung quốc, Lào Thái lan, Indonesia… dịch cúm gia cầm cũng xảy ra. Việc khống chế dịch cúm gia cầm đã được tiến hành một cách mạnh mẽ, đã giảm thiểu đi nhiều những thiệt hại mà virus này gây ra nhưng những nguy cơ bệnh tái phát vẫn luôn tồn tại. Virus cúm A H N1 độc lực cao không những nguy hiểm cho gia cầm mà còn rất nguy hiểm đối với con người. Từ năm 2003 cho đến nay, thế giới đã ghi nhận virus cúm gia cầm đã gây nhiễm lên người 1 nước, với 602 ca bệnh và 3 người đã chết. (WHO,2012). 1
Virus cúm A H N1 có đặc tính là biến chủng rất nhanh và đến nay đã có nhiều biến chủng H N1 đã được phát hiện và phân lập nhiều nước khác nhau từ châu Á sang châu Âu. Đặc biệt Việt Nam chúng ta đã cũng đã phát hiện được nhiều chủng virus A H N1 khác nhau được phân loại vào các nhánh (clade) khác nhau như: clade 1, clade 3, clade 2.3.4, clade 2.3.2.1…(C c Thú y, 2012) Đầu năm 2008 Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương đã phát hiện và phân lập được một số chủng virus A/H5N1 mới thuộc clade 7 từ gà nhập lậu biên giới. Virus cúm A/H5N1 mới này trước đó mới chỉ được phát hiện gà Trung quốc và từng được phát hiện trên người năm 2003. Trung Quốc đã sản xuất vacxin (Re-4) từ chủng virus A/H5N1 thuộc clade và đã sử d ng phòng bệnh một số địa phương từ năm 2006 (Chen và cs, 2008). Với thực tế có rất nhiều gà nhập lậu vào Việt Nam qua biên giới cho thấy nguy cơ virus này sẽ xâm nhập và nhiễm cho các đàn gia cầm của Việt Nam và có nguy cơ đối với cả con người. Vì vậy việc tiến hành nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus này như khả năng sinh bệnh đối với các đối tượng gia cầm khác nhau, khả năng bảo hộ của vacxin hiện hành đối với đối với gia cầm chống lại virus trên là cần thiết. Từ đó có những phương án chủ động tích cực để đối phó nếu virus này xâm nhập vào đàn gà nội địa nước ta. Đứng trước thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứ t đặc tính inh học củ i c A/H5N1 cl de 7 phân lập ở Việt N ”. Nh m góp phần cung cấp thông tin làm cơ s cho việc xây dựng biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm.  Mục tiê củ đề tài - Xác định đặc tính di truyền học, tính kháng nguyên và độc lực của virus cúm A H N1 clade phân lập Việt Nam năm 2008; - Tạo cơ s hiểu biết rõ hơn về virus cúm gia cầm độc lực cao H N1, góp phần xây dựng biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm.  Ý nghĩ kho học củ đề tài Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên Việt Nam có hệ thống về đặc tính sinh học của virus cúm A H N1 clade . 2
- Làm cơ s tham khảo cho việc nghiên cứu sự biến đổi của virus cúm gia cầm tiếp theo, đặc biệt là đối với ngành thú y. - Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể được sử d ng ph c v cho công tác giảng dạy  Ý nghĩ thực tiễn củ đề tài - Kết quả nghiên cứu là cơ s cho việc hiểu biết rõ hơn về một số đặc tính sinh học của virus cúm gia cầm. - Kết quả nghiên cứu có thể được sử d ng làm tiền đề để tiếp t c nghiên cứu các virus cúm gia cầm thể độc lực cao H N1, cũng như cúm gia cầm độc lực thấp, và các loại virus cúm khác trên động vật. - Khuyến cáo cho việc sử d ng vacxin cúm phù hợp với nhánh virus mới lưu hành trong thực tế. - Chủ động trong công tác phòng ngừa sự xâm nhập của chủng virus cúm mới vào nội địa.  Những đóng góp ới củ đề tài - Đã xác định được các đặc tính sinh học của virus cúm gia cầm độc lực cao H5N1 clade 7 phân lập Việt Nam, như đặc tính kháng nguyên, độc lực, khả năng nhân lên trên động vật cảm nhiễm, môi trường nuôi cấy. - Đã xác định được đặc tính di truyền, c thể là giải trình tự các gen HA- H5, NA-N1 và gen atrix ( ) của virus cúm A/H5N1 clade 7. - Đánh giá được khả năng bảo hộ của vacxin H5N1 Re-1 với virus cúm A/H5N1 clade 7 tại Việt Nam. 3
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN T I LIỆU 1.1. Lịch ử bệnh c gi cầ 1.1.1. Lịch sử bệnh t ên thế giới Cúm gia cầm lần đầu tiên được phát hiện Italia vào năm 18 8 với tên gọi là dịch hạch gà (Fowl plague) (Stubb và cs, 196 ). Nhưng mãi tới năm 1901 mới xác định được yếu tố gây bệnh là căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua màng lọc và tới năm 19 mới xác định được nguyên nhân chính xác nguyên nhân gây bệnh cúm gia cầm là virus cúm type A thông qua kháng thể bề mặt A H N1 và A H N gây chết nhiều gà và gà tây và các loài động vật khác (Beard và cs, 1998). Đã xuất hiện 8 đại dịch cúm trong thế kỉ XVII, đại dịch trong thế kỉ XX. Đại dịch cúm lần đầu tiên được xác nhận đã xảy ra vào những năm 1 10 và 1580. Kể từ đó đến năm 2003, trên toàn thế giới đã có những đợt dịch lớn như: - Năm 1918 – 1919, một đại dịch cúm đã nổ ra với mức độ trầm trọng đã gây tử vong khoảng 20 – 40 triệu người trên toàn thế giới. Vào thời kì đó, chưa có các phương pháp phòng thí nghiệm để giám định tác nhân gây bệnh. Các số liệu có sức thuyết ph c sau này cho thấy đại dịch này do virus cúm type A/H1N1. - Cúm Châu Á – Asian Flu do virus cúm type A H2N2 gây nên, bắt đầu từ Hong Kong năm 19 ; - Cúm Hong Kong – Hong Kong Flu do virus cúm type A H3N2, xảy ra năm 1968; - Cúm Nga – ussia flu” do virus cúm type A(H1N1) xảy ra năm 1977. Trong đó, đại dịch cúm “Châu Á” và “Hong Kong” , người mọi lứa tuổi đều mắc và tỉ lệ tử vong cao đặc biệt đối với người trên 6 tuổi và người có tiền sử về bệnh tim phổi (Kilbourne, 2006). Chủng virus cúm A/H5N1được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 19 9 và có thể là biến thể H N1 đầu tiên trên thế giới. 4
Năm 199 Hong Kong, lần đầu tiên virus cúm gia cầm H N1 đã gây ra ổ dịch trên gia cầm và lây sang người làm 18 ngưòi nhiễm bệnh, 6 người chết và hàng triệu gia cầm đã bị tiêu huỷ nh m ngăn chặn dịch lây lan. Đây là lần đầu tiên virus cúm A/H5N1gây bệnh được trên người (Wu và cs, 2008). Từ cuối năm 2003 đến 2012, dịch cúm gia cầm H N1 bùng phát nhiều nước châu Á, trong đó có Việt Nam, lây lan nhanh chóng và liên t c tái bùng phát hàng năm nhiều nước trên thế giới. Đến nay đã có nhiều nước và vùng lãnh thổ xuất hiện dịch cúm gia cầm H N1 gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Campuchia, Lào, Indonesia, Trung Quốc, alaysia, Hong Kong, Việt Nam. Ngoài ra, có nước và vùng lãnh thổ có dịch cúm gia cầm nhưng khác chủng gồm: Pakistan, Hoa Kì, Canada, Nam Phi, Ai Cập, Cộng hoà dân chủ nhân dân triều tiên và Đài Loan. Tính đến tháng 4-2012 đã có tổng số nước, vùng lãnh thổ bùng phát dịch cúm làm 2 0 triệu gia cầm chết hoặc bị tiêu huỷ bắt buộc (WHO, 2008). Các nước có c /H5N1trên gia cầ hoặc chi hoang dã Các nước có c /H5N1trên người Hình 1.1. Bản đồ phân b c c c c A/H5N1t ên thế giới (tính đến 2009)(WHO-2010) 5
Bảng 1.1. Tổng t ường hợp nhiễ c gi cầ A/H5N1 ở người b o c o cho WHO đến 4/2012 (WHO 2012) 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Total Quốc gia Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Ajerbaijan 8 5 8 5 Bangladesh 1 2 3 6 0 Cambodia 4 4 2 2 1 1 1 1 1 1 8 8 2 2 20 18 China 1 1 8 5 13 8 5 3 4 4 7 4 2 1 1 1 1 1 42 28 Djibouti 1 1 0 Egypt 18 10 25 9 8 4 39 4 29 13 39 15 9 5 167 60 Indonesia 20 13 55 45 42 37 24 20 21 19 9 7 12 10 5 5 188 156 Ỉraq 3 2 3 2 Lao PDR 2 2 2 2 Myanmar 1 1 0 Nigeria 1 1 1 1 Pakistan 3 1 3 1 Thailand 17 12 5 2 3 3 25 17 Turkey 12 4 12 4 Vietnam 3 3 29 20 61 19 8 5 6 5 5 5 7 2 4 2 123 61 Total 4 4 46 32 98 43 115 79 88 59 44 33 73 32 48 24 62 34 24 15 602 355 6
Đặc biệt, đã có nhiều người nhiễm và bị tử vong do virus cúm H N1, theo thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 của các nước báo cáo với Tổ chức Y tế thế giới (WHO) từ th ng 12 2003 đến 12/4/2012, đã có tới 602 trường hợp mắc cúm H N1, trong số đó 3 trường hợp đã tử vong chiếm tới 58.9%. Indonesia, Việt Nam và Ai Cập là 3 nước có số người tử vong và nhiễm cao nhất do virus cúm A/H5N1trên thế giơi, và đang được Tổ chức Y tế Thế giới-WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” có thể xảy ra dịch cúm mới người trong tương lai cần được quan tâm ngăn chặn, do virus cúm A/H5N1có được các điều kiện thuận lợi để tiến hoá thích nghi và lây nhiễm trên người (WHO, 2008). 1.1.2. Bệnh c gi cầ ở Việt N Bệnh cúm gia cầm xuất hiện lần đầu tiên Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 (Bùi Quang Anh, 200 ; BCĐQG, 200 ) do virus cúm gia cầm H5N1 độc lực cao (HPAI) gây ra. Sau đó liên t c tái phát và thường vào lúc chuyển mùa, nhất là v Đông – Xuân. Theo C c Thú y, tính tới năm 2010 thì có 6 đợt dịch (epidemic) cúm gia cầm H5N1 xảy ra: - Đợt 1: từ tháng 12 2003 đến tháng 3 2004: dịch bệnh đã xảy ra 2.574 xã, phường, 381 huyện, thị thuộc 57 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 43,9 triệu con (gà: 30,4 triệu; thuỷ cầm: 13,5 triệu). Trong năm 2003 có 3 ca tử vong người do virus cúm H N1. - Đợt 2: từ tháng 4 đến tháng 11 2004: dịch phát ra rải rác với quy mô nhỏ các hộ gia đình chăn nuôi gia cầm, bệnh xuất hiện 46 xã, phường tại 32 huyện, quận, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành. Thời gian cao điểm nhất là tháng , sau đó giảm dần, đến tháng 11 cả nước chỉ có 1 điểm phát dịch. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 84.0 8 con (gà: .999, vịt: 8.132). Trong năm 2004, có 29 ca H5N1 người, có 20 ca tử vong. - Đợt 3: từ tháng 12 2004 đến tháng 200 : dịch đã xuất hiện 6 0 xã tại 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố. Số gia cầm tiêu huỷ là 4 0.49 gà, 82 .689 vịt, ngan. Trong năm 200 , có 61 ca bị nhiễm virus cúm A/H5N1 người, trong đó có 19 ca tử vong. 7
- Đợt 4: từ tháng 10 200 đến 01/2006: dịch xảy cả 3 miền với 24 tỉnh, thành tái phát. Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 3.9 2. 63 con, trong đó, gà: 1.338.523; thuỷ cầm và loài khác: 2.13 .081. Hình 1.2. Bi đồ bi u diễn dịch c gi cầ do i c A/H5N1 theo thời gi n (Cục Th y, 2012) - Đợt 5: bắt đầu và kéo dài trong suốt năm 200 . Dịch không tập trung mà rải rác, lẻ tẻ khắp nơi và có thể chia nhiều đợt: Từ 12 2006 đến 3/2007 dịch xảy ra trên 83 xã, phường của 33 quận, huyện thuộc 11 tỉnh, thành. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 103.092 con, trong đó có 13.622 gà ; 89.4 2 ngan, vịt. Từ 200 đến 8/2007, dịch xảy ra 16 xã, phường của 10 huyện, thị thuộc 23 tỉnh, thành. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 294.894 con (21. 2 gà, ; 264. 49 vịt và 8. ngan). Sau khi bị khống chế trong vòng 1 tháng, đến tháng 10 200 , dịch lại tái 1 xã, phường của 9 huyện, quận, thị trấn thuộc 6 tỉnh, thành phố. Năm 200 có 8 ca bị nhiễm virus cúm A/H5N1 người, trong đó có 5 người chết. 8
- Đợt 6: từ đầu năm 2008: xảy ra rải rác với 4 đàn gia cầm tại xã, phường của 40 huyện thị thuộc 21 tỉnh phát dịch. Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 60.090 con, trong đó có 23.498 gà, 36. 92 thuỷ cầm. Năm 2008 có 6 ca mắc H5N1 người và trong số 6 ca đã tử vong. Năm 2009, dịch cúm gia cầm đã xảy ra 68 xã, phường, thị trấn của 34 huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành với tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy trên 12 .000 con. Năm 2009 có ca mắc H5N1 người và tỷ lệ tử vong là 100% (5/5). Năm 2010, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ít nhất 63 xã, phường của 3 huyện, quận thuộc 24 tỉnh, thành phố, làm hơn 6.000 con gia cầm mắc bệnh, chết và buộc phải tiêu hủy, trong đó chủ yếu là vịt (chiếm hơn 0%). Trong năm 2010, có ca mắc H5N1 người và có 2 ca tử vong (http://www.cucthuy.gov.vn). 1.2. Tình hình nghiên cứ c gi cầ ở Việt N Bệnh cúm gia cầm xuất hiện Việt nam từ cuối năm 2003 (Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không, 2004). Từ đó đến nay đã có nhiều nghiên cứu về virus và bệnh cúm gia cầm Việt Nam, chủ yếu tập trung nghiên cứu dịch tễ bệnh, khảo sát sự lưu hành của virus, các phương pháp chẩn đoán, nghiên cứu ứng d ng vacxin, xác định hàm lượng kháng thể sau tiêm phòng, điều tra mức độ nhiễm bệnh và giám định phân tử và phân nhóm hệ phả virus gây bệnh, nghiên cứu sản xuất và thử nghiệm vacxin. Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hóa của virus cúm A/H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003. Những chuỗi gen giúp xác định subtype H5, subtype N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP Hồ Chí inh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen (Lê Thanh Hòa, 2006, Dung Nguyen T và cs, 2008). Trên cơ s phân tích trình tự gen kháng nguyên H và N1, các tác giả khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam cùng nhóm với virus A/H5N1 phân lập tại Trung Quốc (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Lê Thanh Hòa, 2006; uramoto và cs, 200 ). 9