Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Vi sinh vật học: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ và tích lũy Poly-P trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng dụng xử lý nước thải

Chia sẻ: Elysale Elysale | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:37

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án là nhận diện và tìm hiểu quan hệ phát sinh của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ nitơ và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu có các đặc tính tốt bằng phương pháp sinh học phân tử và công cụ Tin Sinh học kết hợp với một số mô tả hình thái tế bào và khuẩn lạc đã có. Tuyển chọn một số dòng kết tụ sinh học, loại bỏ nitơ và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu tốt nhất để đánh giá hiệu quả xử lý nước thải hủ tiếu trong thùng hay bể chứa có dung tích 100 mL, 1-L, 10-L, 100-L và 1000-L.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Vi sinh vật học: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ và tích lũy Poly-P trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng dụng xử lý nước thải

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 TÊN NCS: LÊ THỊ LOAN TÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, CHUYỂN HÓA NITƠ VÀ TÍCH LŨY POLY-P TRONG NƯỚC THẢI SẢN XUẤT HỦ TIẾU MỸ THO VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI Cần Thơ, 2020
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: GS.TS. Cao Ngọc Điệp Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Phòng bảo vệ Luận án tiến sĩ, Nhà Điều Hành, Trường Đại học Cần Thơ. Vào lúc ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm ….. Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: (ghi rõ học hàm học vị, họ và tên, font chữ: Times New Roman, cỡ chữ 13) Xác nhận đã xem lại của chủ tịch Hội đồng Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Le Thi Loan, Tran Vu Phuong, Cao Ngoc Diep. 2018. Isolation and identification of bioflocculant-producing bacteria, heterotrophic nitrogen removal bacteria and poly- phosphate bacteria in wastewater from “My Tho rice noodle” factories, Tien Giang provice. Internation Journal of Innovations in Engineering and Technology (IJIET). 185-198. 2. Le Thi Loan, Tran Vu Phuong, Cao Ngoc Diep. 2019. Application of bioflocculant-producing bacteria heterotrophic nitrogen removal bacteria and poly-phosphate bacteria and water-hyacinth (Eichhornia crassipes) for wastewater treatment of My Tho rice noodle factories, Tien Giang provice, Vietnam. Internation Journal of Innovations in Engineering Agriculture Research (IJOEAR). 16-26. (Volume-5, Issue-1, PP-26, January, 2019). 3. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn số 19, kỳ 1 tháng 10/2019, tên bài báo “Tối ưu hóa khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PRO.01.B và thử nghiệm xử lý nước thải từ cơ sở sản xuất bún”. (Lê Thị Loan1, Cao Ngọc Điệp2) NCS chuyên ngành Vi sinh vật học; Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ). 4. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn số 21, kỳ 1 tháng 11/2019, tên bài báo “Tối ưu hóa khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PRO.01.C và thử nghiệm xử lý nước thải sau chế biến sữa đậu nành”. (Lê Thị Loan1 , Cao Ngọc Điệp2 ) NCS chuyên ngành Vi sinh vật học; Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ). 1
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án Hủ tiếu được sản xuất theo quy trình là gạo được ngâm trong thời gian 24 giờ, sau đó tháo nước rửa chua, kế tiếp là xay bột rồi ủ bột trong khoảng thời gian 48 giờ. Bước tiếp theo là luộc bột và tráng bột trên các vĩ mỏng sau đó phơi khô và dùng máy cắt thành sợi. Hủ tiếu thành phẩm có thể trộn với rau củ quả cùng với thịt và nước súp (nước lèo) được nấu chín từ xương heo là đặc sản nổi tiếng ở Mỹ Tho, Tiền Giang. Tuy nhiên, hầu hết các cơ sở sản xuất hủ tiếu chưa có hệ thống xử lý nước thải hay xử lý không đạt tiêu chuẩn. Nhu cầu nước cho sản xuất tại các cơ sở chế biến nông sản thực phẩm thường rất lớn, nhưng nước thải trong quá trình sản xuất thường không được xử lý mà xả thẳng ra môi trường gây ô nhiễm nặng nề cho nguồn nước sông, rạch. Cụ thể ở Mỹ Tho - Tiền Giang, đa số các cơ sở đều mang tính tự phát, nhỏ lẻ nên chưa thật sự chú trọng đến việc xử lý nước thải bảo vệ môi trường. Nhiều cơ sở sau khi sản xuất đã xả trực tiếp nước thải hủ tiếu chưa qua xử lý ra môi trường khiến nhiều sông ngòi, kênh rạch gây ô nhiễm nghiêm trọng đồng thời gây nguy hại cho sinh vật và người dân sống quanh đó. Nhận thấy được tiềm năng cũng như hiệu quả của các nhóm vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa đạm, vi khuẩn tích lũy poly-P trong việc xử lý nước thải, đồng thời vấn đề cấp bách hiện tại là phải có biện pháp xử lý nước thải hủ tiếu, để ngăn chặn việc ảnh hưởng đến môi trường. Quan trọng hơn là bảo vệ danh tiếng của ẩm thực Việt Nam, danh tiếng 50 năm danh hiệu của hủ tiếu Mỹ Tho và hình ảnh của Việt Nam. Vì vậy đề tài “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ và tích lũy Poly-P trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng dụng xử lý nước thải” được thực hiện là một nghiên cứu vô cùng cấp thiết và mang tính ứng dụng vào thực tiễn rất cao nhằm giải quyết những khó khăn nêu trên. 1.2 Mục tiêu của nghiên cứu 2
- Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ nitơ và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu từ các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho. - Nhận diện và tìm hiểu quan hệ phát sinh của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ nitơ và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu có các đặc tính tốt bằng phương pháp sinh học phân tử và công cụ Tin Sinh học kết hợp với một số mô tả hình thái tế bào và khuẩn lạc đã có. - Tuyển chọn một số dòng kết tụ sinh học, loại bỏ nitơ và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu tốt nhất để đánh giá hiệu quả xử lý nước thải hủ tiếu trong thùng hay bể chứa có dung tích 100 mL, 1-L, 10-L, 100-L và 1000-L 1.3 Những điểm mới của luận án Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách cơ bản, có hệ thống, từ 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho – tỉnh Tiền Giang đã thải ra một lượng nước thải khá lớn có pH thấp (chua), chứa nhiều độc chất có hàm lượng cao. Từ 08 mẫu thu được từ các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho – tỉnh Tiền Giang, phân lập 109 dòng vi khuẩn bao gồm 59 dòng vi khuẩn chuyển hoá đạm với 15 dòng vi khuẩn trên môi trường nitrite, 18 dòng vi khuẩn trên môi trường nitrate, 15 dòng vi khuẩn trên môi trường ammonium và 11 dòng vi khuẩn trên môi trường nitơ tổng hợp; 42 dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học bao gồm 23 dòng vi khuẩn kết tụ chất protein và 19 dòng vi khuẩn kết tụ chất polysaccharide; 08 dòng vi khuẩn tích luỹ poly-P trên những dòng môi trường chuyên biệt. Tuyển chọn được dòng vi khuẩn kết tụ sinh học là Bacillus subtilis PRO.01.C và Bacillus subtilis PO.03.B; dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ gồm Bacillus altitudinis HNi.01.03.DL, Stenotrophomonas maltophilia HNa.02.03.C, Enterobacter hormaechei HAm.03.05.C và dòng vi khuẩn tích lũy poly-P Bacillus megaterium Poly-P.06.4.B. 1.4 Ý nghĩa thực tiễn và khả năng ứng dụng của luận án 3
Kết quả nghiên cứu của luận án là nguồn tài liệu cơ bản, là một bộ sưu tập gồm 109 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa N và tích lũy poly-P. Trong đó: 42 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học (23 dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ protein và 19 dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ polysaccharide), 59 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ (15 dòng vi khuẩn chuyển hóa ammonium, 18 dòng vi khuẩn chuyến hóa nitrate, 15 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitrite và 11 dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa ammonium, nitrite, nitrate), 8 dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P. Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn hai nhóm kết tụ sinh học và tích lũy poly-P là đều là họ Bacilaceae trong khi đó vi khuẩn ở nhóm chuyển hóa nitơ có sự đa dạng loài hơn bao gồm vi khuẩn Gram âm và chi Bacillus trong đó chi Bacillus chỉ chiếm tới 12% tổng số dòng vi khuẩn. 4
CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn 3.1.1. Nuôi cấy 3.1.1.1 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein (Hazana et al., 2008) Bảng 3.1. Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein. Hóa chất Hàm lượng Glucose 20 g L- Acid glutamic 50 g MgSO4.7H2O 0,5 g Yeast extract 0,5 g Agar 20 g (bổ sung khi đổ môi trường thạch) H2O 1L pH 7 3.1.1.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide ( Deng et al., 2002) Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide. Hóa chất Hàm lượng Glucose 10 g KH2PO4 5g K2HPO4 0,2 g MgSO4.7H2O 0,1 g NaCl 0,1 g 5
Carbamide 0,5 g Yeast extract 0,5 g Agar 20 g (bổ sung khi đổ môi trường thạch) H2O 1L 3.1.1.3 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ (Zhao et al., 2010) Bảng 3.3 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ. Môi Môi Môi Môi trườn trường trường bổ Đơn trường g bổ bổ sung sung T Hóa chất vị bổ sung sung Ammoni (Nitrite, tính Nitrite Nitrat um Nitrate, e Ammoniu) NH4Cl g/L 0,12 0,12 NaNO3 g/L 0,04 0,04 NaNO2 g/L 0,04 0,04 NaCl g/L 4 4 4 4 Na2HPO4.12H2O g/L 21,5 21,5 21,5 21,5 KH2PO4 g/L 0,9 0,9 0,9 0,9 Vi lượng * mL/L 3 3 3 3 Glucoze g/L 1 1 3 2 Agar g/L 20 20 20 20 3.1.1.4 Môi trường phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P (Wang et al., 2008) Bảng 3.4 Môi trường phân lập vi khuẩn tích luỹ poly-P. Hóa chất Hàm lượng Glucose 0,5 g/L Acetate 5 g/L 6
Succinate 0,5 g/L NH4Cl 0,02 g/L KH2PO4 0.088 g/L Pepton 0,02 g/L MgSO4.7H2O 0,01 g/L CaCl2 0,005 g/L Dung dịch khoáng vi lượng 0,5 mL/L Agar 20 g/L 3.1.2. Phân lập vi khuẩn 3.2 Tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa Nitơ N và vi khuẩn poly-P Sau khi phân lập được các dòng vi khuẩn từ nước thải của các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho, tiến hành tuyển chọn các dòng có độ hữu hiệu cao và tiếp đến nhận diện (xác định) các dòng vi khuẩn này để làm cơ sở cho việc xử lý nước thải sau này. 3.2.1. Tuyển chọn 3.2.1.1. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học trên môi trường protein và polysaccharide Kiểm tra khả năng kết tụ của vi khuẩn: lấy 90 mL dung dich Kaolin (5g/l) thêm vào 10 mL dung dịch CaCl2 (1%) trong bình 7
tam giác 250 mL, sau đó thêm 0,1 mL dung dịch vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học. Khuấy hỗn hợp trên trong 30 giây ở 60 vòng/phút bằng máy lắc, giữ yên hỗn hợp trong 1 giờ, lấy phần trong đo OD ở độ bước sóng 550 nm. Tỷ lệ kết tụ % = (OD đối chứng – OD mẫu)/OD đối chứng x 100 Phương pháp tiến hành bằng cách nhân sinh khối chủng vi khuẩn trong 20 mL môi trường với sự phối hợp của ba nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ ở trên, với giá trị pH đã chọn, nhiệt độ 30oC, lắc 150 vòng/phút, sau thời gian một ngày tiến hành xác định hiệu quả kết tụ với dung dịch kaolin theo như mô tả. Phối hợp ba nguồn dinh dưỡng (03 nguồn carbon + 04 nguồn nitrogen + 04 nguồn khoáng vô cơ) có 48 nghiệm thức khác nhau và mỗi nghiệm thức được thực hiện 03 lần lặp lại. Kết quả cuối cùng chọn ra được môi trường tối ưu có nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ thích hợp cho vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cho tỷ lệ kết tụ cao nhất. Ở dòng vi khuẩn kết tụ sinh học thì nguồn khoáng là nguồn lô phụ bậc 2, còn nguồn carbon là lô chính hay ngược lại để tìm ra kết quả tối ưu. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến hiệu quả tổng hợp chất kết tụ sinh học. Nhân sinh khối chủng vi khuẩn trong môi trường gồm 03 nguồn carbon, nitrogen và khoáng đã được chọn ở thí nghiệm trên. Mỗi nguồn dinh dưỡng sẽ được chia thành 03 mức độ khác nhau và phối hợp tạo ra 27 nghiệm thức với tỷ lệ carbon, nitrogen và khoáng vô cơ bổ sung khác nhau. Chủng vi khuẩn được nhân sinh khối trong ống fancol 50 mL chứa 20 ml môi trường tổ hợp từ 03 nguồn dinh dưỡng với tỷ lệ khác nhau, điều chỉnh về giá trị pH cho tỷ lệ kết tụ cao nhất đã chọn, ủ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C. Đánh giá khả năng kết tụ với dung dịch kaolin, phân tích hồi quy tuyến tính 03 nhân tố từ đó chọn ra nghiệm thức có tỷ lệ bổ sung thích hợp cho vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cho tỷ lệ kết tụ cao nhất. 3.2.1.2. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn chuyển hóa Nitơ 8
Chọn những dòng vi khuẩn phát triển được trên môi trường có có bổ sung NH4+, NO3- , NO2- và T (NH4 +, NO3-, NO2-) trong đó NH4+ và NO3- ở nồng độ 100mM, NO2- ở nồng độ 10 mM để tiếp tục kiểm tra khả năng phát triển của chúng trên môi trường có bổ sung NH4+, NO3-, NO2- và T (NH4+, NO3-, NO2-) ở nồng độ cao hơn trong đó NH4+ và NO3- ở nồng độ tăng dần 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM và NO2- ở nồng độ tăng dần 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM. Chủng nào phát triển mạnh, có vi khuẩn phát triển trên dĩa, với số lượng lớn (ký hiệu: +++): là chủng được xem là có khả năng chuyển hóa mạnh. 3.2.1.3. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (không có màu xanh) làm mẫu blank để điều chỉnh giá trị về 0, tiến hành đo OD của 05 ống còn lại. 05 ống theo thứ tự từ 1 - 5 có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với giá trị OD tăng dần (Hình 3.3). Đo hàm lượng lân hòa tan có trong mẫu: Mẫu được lọc qua giấy lọc trước khi đo lân, chuẩn bị ống nghiệm (20 mL) cho mỗi mẫu, cho vào ống nghiệm lần lượt: 08 mL nước khoáng + 0,5 mL dung dịch mẫu + 04 mL dung dịch B. Trộn đều dung dich trong ống nghiệm bằng máy Vortex, ổn định ở nhiệt độ phòng 20 phút và tiến hành đo. Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị để xác định phương trình đường chuẩn của P2O5. Phương trình đường chuẩn có dạng Y=a*X +b. Trong đó: Y: là độ hấp thụ quang (OD) X: là nồng độ P2O5 (mg/L). Dựa vào phương trình đường chuẩn P2O5 và giá trị OD của mẫu đo được để tính hàm lượng P2O5 có trong mẫu theo công thức Y=a*X + b. Sau khi có kết quả, tính hàm lượng PO43-dựa theo công thức: PO43- = C * MPO4/MP2O5, (C là hàm lượng Lân có trong mẫu tương ứng với hàm lượng P2O5 , MPO4 = 95; MP2O5 = 142). 9
Hàm lượng lân hòa tan có trong mẫu được đo dựa trên phương pháp Blue-molypden (so màu Oniani) ở bước sóng 880 nm (OD880nm). Giá trị OD được đo ở 6 ống nghiệm đường chuẩn, sau đó mới tiến hành đo OD của các mẫu thí nghiệm. Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (không có P2O5, không có màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo giá trị OD của 05 ống còn lại. Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn của P2O5. Phương trình đường chuẩn có dạng: y = ax + b. Trong đó: x là nồng độ của mẫu (mg/L), y là độ hấp thu quang (OD880nm). Dựa vào phương trình đường chuẩn P2O5 và giá trị OD880nm của mẫu để tính hàm lượng P2O5 theo công thức: x = (y-b)/a. Từ kết quả trên đánh giá sơ bộ về lượng lân hòa tan của các mẫu nước thải. 3.2.2 Nhận diện Thực hiện phản ứng PCR nhận diện vi khuẩn: Sau khi ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn, thực hiện phản ứng PCR gen 16S rDNA được tiến hành với từng cặp mồi chuyên biệt. Trích DNA - Theo Breugelmans và Uyttebroek (2004) mô tả 3.3. Ứng dụng các dòng vi khuẩn tốt trên nước thải hủ tiếu 3.3.1. Ứng dụng các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học vào xử lý nước thải hủ tiếu Mỹ Tho * Chọn pH thích hợp Do pH nước thải hủ tiếu có pH thấp (từ 4 - 5) nên cần có thí nghiệm để chọn pH thích hợp cho vi khuẩn kết tụ sinh học hoạt động tốt. Xây dựng qui trình xử lý nước thải sau bằng cách bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 03 nghiệm thức sau: pH = 5, pH = 6, pH = 7 (đo bằng pH kế) vì 02 dòng vi khuẩn có 02 dãy pH thích hợp khác nhau nên cần có thí nghiệm này. 10
* Tuyển chọn dòng vi khuẩn kết tụ sinh học Sau khi chọn được pH tối hảo cho từng dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, tiến hành kết hợp 02 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học protein và polysaccharide: Trong điều kiện có kaolin Trong điều kiện nước thải 100 mL, 1 L, 10 L Đánh giá khả năng kết tụ hay % kết tụ và hàm lượng TSS của nước thải được tại trung tâm Đo lường và Chất lượng Cần Thơ Hình 3.7 Sơ đồ đánh giá khả năng kết tụ hay % kết tụ và hàm lượng TSS của nước thải. 3.3.2. Ứng dụng các dòng Vi khuẩn chuyển hóa Nitơ và dòng vi khuẩn Poly-P vào xử lý nước thải hủ tiếu Mỹ Tho * Khả năng xử lý ammonium của các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ ở 100 mL Chọn vi khuẩn chuyển hoá Nitơ tốt nhất bằng cách bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 05 nghiệm thức. NT1: Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn chuyển hóa Nitơ). 11
NT2: Bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa nitrite. NT3: Bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa nitrate. NT4: Bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa amoni. NT5: Bổ sung 0,1% hỗn hợp vi khuẩn chuyển hóa amoni, nitrate, nitrite. Tiến hành sục khí trong 6 giờ mỗi ngày, sau đó để yên trong 24 giờ → Lấy các mẫu trên để đo lại các chỉ tiêu ammonium và orthophosphate, khảo sát trong 3 ngày. * Khả năng xử lý ammonium của các dòng vi khuẩn poly-P ở 100 mL Chọn vi khuẩn tích luỹ Poly-P tốt nhất bằng cách bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 03 nghiệm thức. NT1: Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn tích luỹ Poly-P) (sục khí). NT2: Bổ sung 0,1% vi khuẩn tích luỹ Poly-P (sục khí). NT3: Bổ sung 0,1% vi khuẩn tích luỹ Poly-P (không sục khí). Tiến hành sục khí trong 6 giờ mỗi ngày ở NT1 và NT2, sau đó để yên 24 giờ → Lấy các mẫu trên để đo lại các chỉ tiêu ammonium và orthophosphate, khảo sát trong 03 ngày. * Khả năng xử lý orthophosphate của các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ ở 100 mL Chọn vi khuẩn tích luỹ Poly-P tốt nhất bằng cách bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 03 nghiệm thức. NT1: Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn tích luỹ Poly-P) (sục khí). NT2: Bổ sung 0,1% vi khuẩn tích luỹ Poly-P (sục khí). NT3: Bổ sung 0,1% vi khuẩn tích luỹ Poly-P (không sục khí). Tiến hành sục khí trong 06 giờ mỗi ngày ở NT1 và NT2, sau đó để yên trong 24 giờ → Lấy các mẫu trên để đo lại các chỉ tiêu ammonium và orthophosphate, khảo sát trong 03 ngày. 12
* Khả năng xử lý orthophosphate của các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P ở 100 mL Như thí nghiệm trên nhưng đo hàm lượng orthophosphate. 3.3.3 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 1- L Chọn vi khuẩn chuyển hoá Nitơ tốt nhất bằng cách bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 05 nghiệm thức. NT1: Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn chuyển hóa Nitơ). NT2: Bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa nitrite. NT3: Bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa nitrate. NT4: Bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa amoni. NT5: Bổ sung 0,1% hỗn hợp vi khuẩn chuyển hóa amoni, nitrate, nitrite. Tiến hành sục khí trong 06 giờ mỗi ngày, sau đó để yên trong 24 giờ → Lấy các mẫu trên để đo lại các chỉ tiêu ammonium và orthophosphate, khảo sát trong 03 ngày. Chọn vi khuẩn tích luỹ Poly-P tốt nhất bằng cách bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 03 nghiệm thức. NT1: Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn tích luỹ Poly-P) (sục khí). NT2: Bổ sung 0,1% vi khuẩn tích luỹ Poly-P (sục khí). NT3: Bổ sung 0,1% vi khuẩn tích luỹ Poly-P (không sục khí). Tiến hành sục khí trong 06 giờ mỗi ngày ở NT1 và NT2, sau đó để yên trong 24 giờ → Lấy các mẫu trên để đo lại các chỉ tiêu ammonium và orthophosphate, khảo sát trong 03 ngày. Ứng dụng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P để xử lý nước thải hủ tiếu ở thể tích 1 lít. Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 02 nghiệm thức: NT1 là đối chứng (không bổ sung vi khuẩn chuyển hóa Nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P) và NT2 bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa Nitơ tốt nhất và 0,1% vi khuẩn tích lũy poly-P tốt nhất. 13
Tiến hành sục khí trong 06 giờ mỗi ngày, sau đó để yên trong 24 giờ → Lấy các mẫu trên để đo lại các chỉ tiêu ammonium và orthophosphate, khảo sát trong 03 ngày. + Mẫu nước thải thu được sau khi lọc đem đo các chỉ tiêu: ammonium, orthophosphate và so sánh với cột B của bảng 9 QCVN40:2011/BTNMT. 3.3.4 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 10-L Sau khi thử nghiệm khả năng xử lý của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P chọn được dòng chuyển hóa N và dòng vi khuẩn tích lũy poly- P có khả năng xử lý đạt hiệu quả cao. Tiến hành ứng dụng kết hợp 02 dòng vi khuẩn này để xử lý nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho ở dung tích 10 L với 03 lần lặp lại, phương pháp thí nghiệm và lấy mẫu đo các chỉ tiêu như thí nghiệm 1 L. 3.3.5 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 100-L Trong hai thí nghiệm 100-L và 1000-L, để đánh giá cụ thể và hiệu quả của từng nhóm vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ và tích lũy poly-P. Thí nghiệm chia ra hai giai đoạn: Xử lý vi khuẩn kết tụ sinh học; Xử lý vi khuẩn chuyển hoá nitơ + vi khuẩn poly-P. Thí nghiệm thực hiện tại hộ ông Nguyễn văn Thuận và mẫu nước thải của mỗi lần thí nghiệm được thu và phân tích tại Trung tâm Kỹ thuật và Công nghệ sinh học tỉnh Tiền Giang. Vi khuẩn kết tụ sinh học được tăng sinh trong môi trường thích hợp và tương ứng cho từng nhóm protein (Hazana et al., 2008) hay polysaccharide (Deng et al., 2002) đạt >109 CFU/ml. Vi khuẩn chuyển hóa Nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P được tăng sinh trong môi trường thích hợp và tương ứng cho từng nhóm nitơ (Zhao et al., 2010) và phosphate (Wang et al., 2008). 14
Tăng sinh khối các dòng vi khuẩn Thu mẫu nước Vi khuẩn kết tụ sinh học thải Protein, vi khuẩn kết tụ sinh học Polysaccharide Bổ sung 0,1% hai Đối chứng NT 1 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học Khuấy trộn Để yên trong 3 giờ Bổ sung 0,1% hai dòng vi khuẩn chuyển hóa Nitơ, Lọc lấy phần trong tích lũy Polyphosate Sục khí 8 tiếng chia 2 lần/ ngày: 7h đến 11h và 13h đến 17h Thu mẫu và tiến hành đo các chỉ tiêu amomonium, orthophsphate Hình 3.8 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá hiệu quả Vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa N và vi khuẩn poly-P trên nước thải hủ tiếu Mỹ Tho. 15
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập, nhận diện vi khuẩn kết tụ sinh học Đề tài đã phân lập được 42 dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ sinh học, trong đó 23 dòng trên môi trường protein và 19 dòng trên môi trường polysaccharide. * Trên môi trường protein đã phân lập tổng cộng 23 dòng vi khuẩn, phần lớn có khuẩn lạc màu trắng đục, dạng bìa nguyên và độ nổi mô (Hình 4.1). Đặc điểm khuẩn lạc và vi khuẩn phân lập trên môi trường protein: Tất cả 23/23 dòng khuẩn lạc phân lập được có dạng hình tròn, màu trắng đục, bìa nguyên và mô, chiếm tỷ lệ 100%. * Trên môi trường polysaccharide, phân lập được tổng cộng 19 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học có khuẩn lạc màu trắng đục, dạng bìa nguyên và độ nổi mô. Hình dạng: khuẩn lạc dạng tròn chiếm 89,5%, và khuẩn lạc dạng không đều chiếm 10,5%. Màu sắc: khuẩn lạc có màu trắng đục có 16/19 dòng chiếm 84,2%, trắng trong là 2/19 dòng chiếm 10,5% và trắng vàng 1/19 dòng chiếm 5,3%. Dạng bìa: 17/19 dòng vi khuẩn có dạng bìa nguyên chiếm 89,5%, và 2/19 dòng vi khuẩn có dạng bìa răng cưa chiếm 10,5%. Độ nổi: tất cả đều có độ nổi mô. Kích thước: phần lớn khuẩn lạc có kích thước tương đối lớn, hơn 80% có kích thước lớn hơn 01 mm và 01 khuẩn lạc có kích thước lớn hơn 02 mm chiếm 5,3%. Đặc điểm khuẩn lạc: Trong 19 dòng phân lập được, khuẩn lạc hình tròn có 15/19 dòng chiếm 78,9%, khuẩn lạc có hình dạng que ngắn là 4/19 dòng chiếm 21,1%, phần lớn có khả năng chuyển động chiếm 18/19 dòng chiếm 94,7%. Trong 23 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường protein, dòng PRO.01.C có tỷ lệ kết tụ cao nhất 67,09% và PRO.05.02 có tỷ lệ kết tụ thấp nhất 7,44% trong điều kiện có kaolin, trong 19 dòng vi khuẩn trên môi trường polysaccharide, chỉ dòng PO.03.B có tỷ lệ 16
kết tụ cao nhất 59,8% và PO.06.03 có tỷ lệ kết tụ thấp nhất 29,79% trong điều kiện có kaolin. Kết quả cho thấy tất cả 07 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học có độ tương đồng với chi Bacillus đến 97 – 99%. Tiến hành vẽ giản đồ phả hệ của các dòng đã giải trình tự (Hình 4.26). Kết quả trình bày trong Hình 4.26 cho thấy chia thành 02 nhánh A và nhánh B, phân biệt nhóm protein và nhóm polysaccharide. Bảng 4.21 Kết quả giải trình tự 07 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học độ ST Dòng vi Số đồng Tên vi khuẩn đồng hình T khuẩn nucleotit hình (%) AB986572 Bacillus tequilensis, 99 1 PO.08A 1018 strain: Cs.10-4.1.9 KX214613 Bacillus sp. strain 2N-14 99 KC172004 Bacillus 99 methylotrophicus strain JF29 2 PO.03B 676 KU179336 Bacillus subtilis strain 99 L23 FJ392729 Bacillus subtilis strain 99 3 PO.01C 743 M3-7 KX214613 Bacillus sp. strain 2N-14 99 AB986572 Bacillus tequilensis, 99 4 PRO.07.04 684 strain: Cs.10-4.1.9 LC065158 Bacillus sp. NCCP-1131 99 MG430224 Bacillus megaterium 98 strain CS17 5 PRO 04.01 1413 KU991810 Bacillus aryabhattai 98 strain J5 KP735610 Bacillus subtilis strain 98 6 PRO 01.C 1424 SH23 KY283142 Bacillus sp. strain ZJ-1 97 MG430224 Bacillus megaterium 98 strain CS17 7 PRO 03.B 823 KY283142 Bacillus sp. strain ZJ-1 97 17
4.2. Phân lập, nhận diện các dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hoá Nitơ Đề tài đã phân lập được 59 dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ. Trong đó có 15 dòng phân lập được trên môi trường nitrite, 18 dòng 18