Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Vi sinh vật học: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn trong dạ cỏ để ứng dụng chăn nuôi gia súc nhai lại và cung cấp cho quá trình lên men cồn từ bã mía

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

116
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài "Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn trong dạ cỏ để ứng dụng chăn nuôi gia súc nhai lại và cung cấp cho quá trình lên men cồn từ bã mía" với mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứ: Tuyển chọn tổ hợp VKDC ứng dụng trong chăn nuôi GSNL; tuyển chọn tổ hợp VKDC-nấm men để lên men ethanol từ bã mía.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Vi sinh vật học: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn trong dạ cỏ để ứng dụng chăn nuôi gia súc nhai lại và cung cấp cho quá trình lên men cồn từ bã mía

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành: 62 42 01 07 VÕ VĂN SONG TOÀN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ ĐỂ ỨNG DỤNG CHĂN NUÔI GIA SÚC NHAI LẠI VÀ CUNG CẤP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN CỒN TỪ BÃ MÍA Cần Thơ, 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành: 62 42 01 07 VÕ VĂN SONG TOÀN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ ĐỂ ỨNG DỤNG CHĂN NUÔI GIA SÚC NHAI LẠI VÀ CUNG CẤP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN CỒN TỪ BÃ MÍA Cần Thơ, 2015
CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Trần Nhân Dũng Người hướng dẫn phụ: PGS.TS. Hồ Quảng Đồ Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ……………………………………………………………………… Vào lúc ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm ….…….. Phản biện 1: …………………………………………….. Phản biện 2: …………………………………………….. Phản biện 3: …………………………………………….. Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
Chapter 1 CHƢƠNG I: KHÁI QUÁT CHUNG VỀ LUẬN ÁN 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Công nghệ sinh học cung cấp cho những nền kinh tế đang phát triển những giải pháp về nhiều vấn đề đã và đang phải đối mặt thường xuyên trong sản xuất nông nghiệp, lương thực, dược phẩm, năng lượng cũng như năng suất thấp và ô nhiễm môi trường. Một trong những sản phẩm của công nghệ sinh học là dạng thức ăn bổ sung probiotic. Bào tử của một số loài B. cereus, B. licheniformis, và B. subtilis thường được sử dụng như thức ăn bổ sung probiotic để đưa vào đường tiêu hóa (Sanders et al., 2003). Việc cho ăn trực tiếp vi sinh vật (Microbials Direct-Fed, DFM) đã tác động tốt đến môi trường dạ cỏ, đồng thời cải thiện sức khỏe và sự phát triển của bê non (Krehbiel et al., 2014). Điều này đã cho thấy việc sử dụng những vi sinh vật sở hữu hệ cellulase đồng thời có khả năng sử dụng như một thức ăn probiotic là rất cần thiết để cải thiện khả năng tiêu hóa của gia súc nhai lại, góp phần cải thiện sức khỏe của vật nuôi. Bên cạnh đó, sức p t khủng hoảng dầu mỏ và nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề đặt ra cho bất cứ quốc gia nào trên thế giới. Tuy nhiên, việc sản xuất ethanol thế hệ thứ nhất (sản phẩm nông nghiệp) đe dọa nền an ninh lương thực toàn cầu. Điều này đã khích lệ các nước trên thế giới đầu tư nghiên cứu vào lĩnh vực nhiên liệu sinh học thế hệ thứ hai: lignocellulose (Rubin, 2008). Bã mía đã được sử dụng để lên men ethanol bằng Candida shehatae NCIM 3501 (Anuj, 2007). Pichia stipitis tái tổ hợp đã được sử dụng để lên men thân cây bắp sau khi nổ hơi nước và được thủy phân trực tiếp với enzyme (Xiushan, 2011). Với mong muốn phát triển chế phẩm vi sinh vật hỗ trợ gia súc nhai lại tiêu hóa xơ thực vật và phát triển nguồn nhiên liệu sinh học thế hệ thứ 2, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “phân lập, tuyển chọn vi khuẩn trong dạ cỏ để ứng dụng chăn nuôi gia súc nhai lại và cung cấp cho quá trình lên men cồn từ bã mía” 1.2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu - Tuyển chọn tổ hợp VKDC ứng dụng trong chăn nuôi GSNL. - Tuyển chọn tổ hợp VKDC-nấm men để lên men ethanol t bã mía. 1
1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Vi khuẩn được phân lập t dịch dạ cỏ bò, trâu, c u và dê và nấm men (D3, D7, D9, D11, D16, H6, H13, ST1 và CM4). 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án Về khoa học, tổ hợp VKDC sử dụng để bổ sung trực tiếp vào dạ cỏ bò cũng như tổ hợp VKDC bò và nấm men trong lên men ethanol làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo và tài liệu tham khảo cho giảng dạy. Về thực tiễn, tổ hợp 4 dòng VKDC (BM13, BM21, BM49 và DD9) có thể phát triển thành chế phẩm như thức ăn bổ sung probiotic vào khẩu ăn cho gia súc. Bên cạnh đó, tổ hợp bao gồm dòng nấm men (D11) và VKDC bò (BM13, BM21, BM49) có thể sử dụng để phát triển lên men ethanol thế hệ thứ 2. 1.5. Những đóng góp mới của luận án T 121 dòng vi khuẩn dạ cỏ (VKDC) đã được phân lập t dịch dạ cỏ bò, trâu, c u và dê. Đề tài đã xác định được VKDC dê DD9 (tương đồng 94% với Bacillus subtilis RC24) phối hợp với tổ hợp VKDC bò BM13, BM21 và BM49 (tương đồng 91%, 94% và 94% lần lượt với Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis strain S2O, Uncultured Bacillus sp. Filt.17) theo tỷ lệ 3:1 cho kết quả phân giải bã mía hiệu quả nhất trong điều kiện in vitro, đồng thời hỗ trợ tích cực bò thí nghiệm tiêu hóa thực liệu giàu xơ trong điều kiện in vivo. Bên cạnh đó, dòng nấm men D11 (tương đồng 96% với Candida inconspicua) cũng đã cho thấy có thể phối hợp với tổ hợp VKDC bò (BM13, BM21, BM49) để lên men cồn t bã mía. Chapter 2 CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu “Tổ hợp vi khuẩn dạ cỏ thích hợp để để phân giải bã mía trong điều kiện in vitro và in vivo và lên men ethanol t bã mía có sự kết hợp giữa nấm men và tổ hợp dịch vi khuẩn dạ cỏ bò” đề tài đã xây dựng và hoàn thành nội dung nghiên cứu: (1) Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn dạ cỏ của bò, trâu, c u, dê. (2) Tuyển chọn vi khuẩn dạ cỏ để phân giải bã mía trong điều kiện in vitro và in vivo. 2
(3) Tuyển chọn nấm men để kết hợp với vi khuẩn dạ cỏ bò để lên men ethanol t bã mía. Những nội dung nghiên cứu được mô tả theo sơ đồ sau: Hinh 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu luận án 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải xơ bã mía từ dịch dạ cỏ trâu, bò, cừu và dê 2.2.1.1. Phân lập vi khuẩn có nguồn gốc từ dịch dạ cỏ (VKDC) Dịch dạ cỏ mỗi loài gia súc nhai lại (bò, trâu, c u và dê) dùng để phân lập vi khuẩn trên đĩa petri theo phương pháp của Robert Koch (Brock, 1961) với thành phần dung dịch khoáng của môi trường nuôi cấy theo Ryckeboer et al. (2003) và tiến hành ủ ở ở 38oC trong 48 giờ trong bình ủ thủy tinh có nắp kín. Đèn cầy được đặt bên trong bình đốt hết oxy trong bình ủ để tạo môi trường kỵ khí (bình ủ kỵ khí). Những khuẩn lạc đồng nhất về hình dạng, màu sắc dạng bìa sẽ được sử dụng quan sát tiếp ở vật kính độ phóng đại 100X để xác định độ 3
ròng của mẫu và để mô tả một số đặc điểm về khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008). 2.2.1.2. Tuyển chọn và định danh VKDC có hệ endo- và exoglucanase Mỗi 20 µL dịch VKDC (đã được phân lập t dạ cỏ của mỗi loài gia súc) có mật số 106 tế bào/mL được bơm vào giếng thạch có đường kính 5 mm của môi trường M1 (cơ chất CMC hoặc bã mía), ủ 3 ngày ở 38oC trong bình ủ kỵ khí. Mẫu được nhuộm với Congo red để khảo sát vòng halo (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Mỗi loại VKDC chọn ra 4 dòng vi khuẩn với hệ endo- và exoglucanase mạnh để định danh bằng kỹ thuật PCR dựa theo phương pháp của White et. al. (1983) với cặp mồi 8F và 1492R (Turner et al., 1999) khuếch đại vùng gen 16S rDNA. Sản phẩm PCR tiếp tục được giải trình tự theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung (Sanger et al., 1977) với đoạn mồi 8F (Turner et al., 1999). Trình tự nucleotide vùng gen 16S rDNA sẽ được so sánh sự tương đồng với các trình tự nucleotide của NCBI; Đồng thời cũng được sử dụng để cây phả hệ mô tả tương quan di truyền giữa các dòng vi khuẩn theo phương pháp phân tích Neighbor- joining bằng phần mềm Mega 6.0 với số lần lặp lại 100 lần. 2.2.1.3. Tuyển chọn tổ hợp VKDC để phân giải bã mía Mẫu: Các dòng VKDC bò (BM13, BM21, BM49 và BM97), VKDC trâu (TM9, TM11, TM17 và TM27), VKDC c u (CD15, CD11, CD21 và CD43) và VKDC dê (DD9, DD5, DD7, DD13). Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm tổ hợp 4 dòng VKDC VK NT ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 -         2 -         3 -         4 -         Ghi chú: ĐC: đối chứng, NT: nghiệm thức. Mỗi 20 µL dịch VKDC (đã được phân lập t dạ cỏ của mỗi loài gia súc) có mật số 106 tế bào/mL được bơm vào giếng thạch có đường kính 5 mm của môi trường M1 (cơ chất CMC hoặc bã mía), ủ 3 ngày ở 38oC trong bình ủ kỵ khí. Mẫu được nhuộm với Congo Red sau 3 ngày để khảo sát vòng halo phân giải bả mía (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 4
2.2.2. Nội dung 2: Tuyển chọn tổ hợp dịch VKDC phân giải bã mía trong điều kiện in vitro và in vivo 2.2.2.1. Phối hợp VKDC giữa các loài trong điều kiện in vitro a) Ảnh hƣởng của tổ hợp VKDC bò và trâu hoặc cừu hoặc dê Mẫu: Tổ hợp 03 VKDC bò (BM13, BM21 và BM49 = 1:1:1), dịch VKDC trâu (TM9 và TM11), hoặc VKDC c u (CD43 và CD11), hoặc VKDC dê (DD9 và DD7) được chọn t kết quả của 2.2.1.3. Thành phần dung dịch đệm theo Tilley và Terry (1963). Dịch dạ cỏ (DDC) bò được thu qua lỗ dò của bò được trữ vào lọ tối màu và chuyển vào bình giữ ấm. Dịch dạ cỏ thu về được dùng để bố trí thí nghiệm in vitro sau khi gạn bỏ thức ăn th a. Khí CO2 được bơm trong 45 phút để tạo kỵ khí và ủ ấm ở nhiệt độ 38oC trong bồn ủ ổn nhiệt trước khi dùng. Bảng 2.2. Phối hợp VKDC giữa các loài trong điều kiện in vitro Thành phần DC- DC+ NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 DDC bò 40 0 40 40 40 40 40 40 40 DD đệm (mL) 160 160 160 160 160 160 160 160 160 VKDC bò (mL) 0 12 12 6 6 6 3 3 3 VKDC 1 (mL) 0 0 0 6 0 3 9 0 4,5 VKDC 2 (mL) 0 0 0 0 6 3 0 9 4,5 * Ghi chú: DC-: Đối chứng âm; DC+: Đối chứng dương; NT: Nghiệm thức * VKDC bò (BM13, BM21 và BM49 = 1:1:1); Dịch VKDC 1: Trâu/cừu/dê : TM9/CD43/DD9; Dịch VKDC 2: Trâu/cừu/dê: TM11/CD11/DD7 Ủ ổn nhiệt cách thủy trong 3 ngày ở 38oC trong điều kiện kỵ khí. Đánh giá phần trăm VCK (AOAC, 2000), cellulose, hemicellulose và lignin (Van Soest and Wine, 1967; Van Soest, 1979) bã mía được phân giải. b) Ảnh hƣởng tổ hợp VKDC bò, cừu và dê Bảng 2.3. Phối hợp VKDC bò, c u và dê Thành phần Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 Bã mía (g) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 DD đệm (mL) 160 200 160 160 160 160 160 160 160 160 Dịch dạ cỏ bò 40 0 40 40 40 40 40 40 40 40 (mL) VK 1 (mL) 0 12 12 9 6 3 9 6 3 4 VK 2 (mL) 0 0 0 3 6 9 0 0 0 4 VK 3 (mL) 0 0 0 0 0 0 3 6 9 4 5
* Ghi chú: VK 1: Tổ hợp VKDC bò: BM13, BM21 và BM49 = 1:1:1; VK 2: VKDC cừu: CD43:CD1 = 1:1 , VK 3: VKDC dê = DD9. Trong đó, dịch VKDC bò (BM13, BM21 và BM49 = 1:1:1) chọn t 2.2.1.3, tổ hợp VKDC c u (CD11 và CD43), và VKDC dê (DD9) được chọn t 2.2.2.1.a Thành phần dung dịch đệm theo Tilley và Terry (1963); Dịch dạ cỏ (DDC) bò chuẩn bị như ở tiểu mục 3.3.2.1; VKDC trâu hoặc VKDC c u hoặc VKDC dê có mật số 107CFU/mL được bố trí theo bảng 2.3 và được tiến hành theo phương pháp in vitro của Tilley và Terry (1963). Đánh giá: Phần trăm VCK được phân giải (AOAC, 2000), cellulose, hemicellulose và lignin bã mía được phân giải (Van Soest and Wine, 1967; Van Soest, 1979). c) Khảo sát hệ endoglcanase và exoglucanase của VKDC bò, dê Vi khuẩn (BM13, BM21, BM49 và DD9) được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất là bột bã mía cùng với thành phần môi trường khoáng theo Ryckeboer et. al. (2003) và ủ kỵ khí (để yên, không lắc suốt thời gian nuôi cấy) ở nhiệt độ 38oC, 5 ngày. Dịch nuôi cấy được ly tâm lạnh 6.000 vòng/phút trong 20 phút. Dịch emzym thô thu được dùng để tủa phân đoạn bằng ammonium sulphate theo các nồng độ bão hòa 30 đến 90%. Các phân đoạn protein lần lượt được thu nhận để đánh giá hoạt tính đặc hiệu của mẫu thu được. Enzym (có hoạt tính) thu được t tủa ammonium sulphate được sử dụng để tiếp tục tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion âm với gel sắc ký sử dụng là Uno sphere Q. Các phân đoạn thu được t quá trình sắc ký lần lượt được phân tích hoạt tính đặc hiệu của endoglucanase và exoglucanase; Đồng thời phân tích thành phần và khối lượng phân tử protein hiện diện trong các phân đoạn bằng phương pháp điện di SDS-PAGE. Chỉ tiêu đánh giá - Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (µg/mL). - Hoạt tính bằng phương pháp Nelson-Soymogi (U/mL). - Khối lượng phân tử protein bằng phương pháp điện di SDS- PAGE (kDa). 2.2.2.4. Ảnh hƣởng của VKDC bò và dê trong điều kiện in vivo a. Khảo sát sự phát triển của VKDC Mẫu: VKDC bao gồm BM13, BM21 và BM49 và DD9. 6
Mỗi 1% (v/v) dịch vi khuẩn (BM13, BM21, BM49 và DD9) có mật số 107 tế bào/mL được bổ sung vào môi trường nuôi cấy (Ryckeboer et al., 2003) và ủ vi khuẩn ở 38oC với bình ủ kỵ khí. Dịch vi khuẩn được kiểm tra mật số bằng phương pháp đếm sống ở các thời điểm 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 giờ. b. Khảo sát ảnh hƣởng của VKDC bò và dê trong điều kiện in vivo Bò đực Lai Sind (4 con) khoảng 2,5 năm tuổi có trọng lượng ban đầu trung bình t 150-170 kg và đã được mổ lỗ dò. Tổ hợp VKDC sử dụng bao gồm VKDC bò (BM13, BM21 và BM49 = 1:1:1) và VKDC dê (DD9) có mật số 107 CFU/mL và được phối trộn theo tỷ lệ 1:3. Bò được tiêm ng a lở mồm long móng, được chia làm 2 nhóm. nhóm 1:2 con bò cho ăn theo khẩu phần nhưng không bổ sung VKDC; Nhóm 2:2 con bò cho ăn theo khẩu phần kết hợp bổ sung VKDC. Thí nghiệm tiến hành tại trại nuôi bò của hộ ông Nguyễn Văn Việt (Ấp Phú Long, Xã Phú Thành, H. Trà Ôn, T. Vĩnh Long) diễn ra liên tục trong 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn khảo sát là 15 ngày. Chuồng trại nuôi bò có diện tích dài x rộng = 4 x 3 (m2), chiều cao 3m, nền bêtông, mái lá; bên cạnh có đường bêtông dài x rộng = 6 x 1 (m2) để dẫn bò t trại đến chỗ để cân bò. Khẩu phần thực liệu dùng cho mỗi con bò đã mổ lỗ dò bao gồm cỏ lông tây, bã mía, bánh dầu bông vải và urea theo tỷ lệ 70% : 20% : 8,5% : 1,5%. Bò được cho uống và ăn tự do khẩu phần thực liệu (được trộn đều) thí nghiệm vào lúc 8 giờ và 15 giờ mỗi ngày. Ngay sau cho ăn, bổ sung dịch VKDC cho hai (02) bò thuộc nhóm 2 thông qua lỗ dò. Thu mẫu thức ăn th a, phân loại và cân mỗi loại thức ăn th a vào mỗi buổi sáng hôm sau lúc 8 giờ; Cân trong lượng bò; Thu mẫu phân vào các ngày thứ 15, 30, 45, 60 (ngày kết thúc mỗi giai đoạn thí nghiệm); Thu mẫu dịch dạ cỏ và bã thức ăn trong dạ cỏ của mỗi con bò ở các mốc thời gian: 0 giờ, 2 giờ, 4 giờ và 6 giờ sau khi cho bò ăn của các ngày thứ 15, 30, 45, 60. Đánh giá: Lượng thực liệu ăn vào, pH, hàm lượng NH3 trong dịch dạ cỏ, thành phần hóa học (VCK, cellulose, hemicellulose, lignin) của thực liệu được tiêu hóa, kích thước thức ăn trong dạ cỏ, thành phần hóa học trong phân bò, tỷ lệ tiêu hóa protein thô và tăng trọng của bò. 7
2.2.3. Nội dung 3: Khảo sát ảnh hƣởng của nấm men và VKDC trong quá trình lên men ehanol từ bã mía 2.2.3.1 Phối hợp nấm men với dịch VKDC đƣợc tuyển chọn ở bò Mẫu: 09 dòng nấm men D3, D7, D9, D11, D16, H6, H13, ST1 và CM4 (Phạm Thị Lê Trinh, 2014); VKDC bò BM13, BM21 và BM49 chọn t 2.2.1.3. Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố là nấm men, nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn, không bổ sung nấm men và nghiệm thức đối chứng chỉ bổ sung vi khuẩn. Tổng số nghiệm thức là 11, tổng số đơn vị thí nghiệm 33 (bảng 2.4). Đường hóa và lên men: bổ sung 6% (v/v) dịch VKDC bò có mật số 10 CFU/mL vào 100 mL môi trường có cơ chất bã mía và ủ kỵ khí ở 7 38oC trong 3 ngày; Sau đó bổ sung tiếp 10 mL (tương ứng 10% v/v) dịch nấm men với mật số 106 CFU/mL để lên men kỵ khí trong chai tối màu ở 30oC trong 7 ngày. Bảng 2.4. Bố trí lên men ethanol bằng tổ hợp VKDC bò và nấm men NT Vi khuẩn 121oC Nấm men DC1 - + - DC2 + + - NT1 + + D3 NT2 + + D7 NT3 + + D9 NT4 + + D11 NT5 + + D16 NT6 + + H6 NT7 + + H13 NT8 + + CM4 NT9 + + ST1 *Ghi chú: NT: nghiệm thức, DC: đối chứng, -: không bổ sung, +: có bổ sung. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ VCK (AOAC, 2001), CF bã mía được phân giải (Weende, 1983), số mL khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men, hàm lượng ethanol (g/L) (Lê Thanh Mai et al., 2007). 2.2.3.2. Ảnh hƣởng của tổ hợp nấm men D11 với VKDC Mẫu: Nấm men D11 và VKDC (BM13, BM21 và BM49). 8
a) Định danh nấm men D11: Dòng nấm men cho kết quả phối hợp tốt với tổ hợp 3 dòng VKDC (BM13, BM21 và BM49) trong lên men cồn được sử dụng để xác định loài với cặp mồi ITS 1 - 4 (White et al., 1990) để khuếch đại vùng gen ITS 1-4; Sản phẩm PCR tiếp tục được giải trình tự bằng đoạn mồi ITS 1 theo phương pháp giải Sanger et al. (1977). b) Ảnh hƣởng của sự phối hợp nấm men với VKDC đƣợc tuyển chọn ở bò trong lên men ethanol Mẫu: Nấm men D11 và VKDC (BM13, BM21 và BM49). Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Bảng 2.5. Bảng bố trí phối hợp nấm men và VKDC bò Nghiệm thức Vi khuẩn 121oC Nấm men DC - - - NT1 - - + NT2 + - - NT3 + - + NT4 + + + * DC: đối chứng; 121oC: khử trùng 121oC, 15 phút; -: không bổ sung; +: bổ sung. Giai đoạn đường hóa và lên men ethanol được chuẩn bị tương tự như tiểu mục 2.2.3.1. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ VCK (AOAC, 2001), CF bã mía được phân giải (Weende, 1983), số mL khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men, hàm lượng ethanol (g/L) sinh ra (Lê Thanh Mai et al., 2007). c) Ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH và thời gian đến sự lên men ethanol Mẫu: Nấm men D11 và VKDC (BM13, BM21 và BM49). Bố trí thí nghiệm theo thể thức th a số 3 nhân tố, 3 mức độ và 3 lần lặp lại. Điều kiện lên được bố trí theo thể thức th aa số 3 nhân tố nhiệt độ (25, 30 và 35oC) pH (5,6 và 7), thời gian (5, 6 và 7 ngày). Giai đoạn đường hóa được chuẩn bị tương tự như tiểu mục 2.2.3.1. Kết thúc giai đoạn này bình ủ được sử dụng trực tiếp để bổ sung thêm nấm men D11 vào để tiến hành lên men. Giai đoạn lên men ethanol được chuẩn bị tương tự như tiểu mục 2.2.3.1. Theo dõi: Số mL khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men, và hàm lượng ethanol (g/L) sinh ra (Lê Thanh Mai et al., 2007). 9
Chapter 3 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần hóa học bã mía Thành phần hóa học của bã mía lần lượt được liệt kê trong bảng 3.1. Kêt quả cho thấy bã mía là nguồn nguyên liệu xơ thực vật có năng lượng cao với hàm lượng cellulose chiếm khoảng 55,8% và tương đương với kết quả nghiên cứu của Isaias (1980) là 56,5%, nhưng khá cao hơn Hamissa et al. (1985) là 48,1%. Bảng 3.1. Thành phần hóa học nguyên liệu VCK NDF Cellulose Hemicellulose Lignin (%) (%) (%) (%) (%) 97,2 ± 1,87 93,7 ± 2,8 55,8 ± 3,44 23,8 ± 5,32 15,6 ± 1,51 3.2. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải xơ bã mía mạnh từ dịch dạ cỏ bò, trâu, cừu và dê 3.2.1. Vi khuẩn dạ cỏ bò Kết quả đã có 62 dòng vi khuẩn được phân lập t dịch dạ cỏ bò (VKDC bò). Qua phân tích hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của VKDC bò (bảng 3.2) đã tuyển chọn được 4 dòng VKDC bò trong đó BM13, BM21, BM97 có hoạt tính exoglucanase (Exgl) mạnh và BM49 có hoạt tính endoglucanase (Engl) mạnh. Bảng 3.2. Hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của VKDC bò Tên Số VKDC có VKDC có Kết quả tuyển chọn mẫu mẫu hoạt tính hoạt tính Engl Exgl VKDC 62 44 28 21 dòng VKDC bò (13: Engl + bò 12: Exgl) 21 16 BM13, BM21, BM97 và BM49 Kết quả định danh dựa vào trình tự đoạn mồi 8F và 1492R (Turner et al., 1999) để khuếch đại vùng 16S rDNA của 4 dòng vi khuẩn BM13, BM21, BM49 và BM97 bước đầu đã xác định được 4 dòng vi khuẩn này lần lượt tương đồng với Achromobacter xylosoxidans BL6 (China), Bacillus subtilis S2O (Cameroon), Uncultured Bacillus sp. Filt.171 và Uncultured bacterium lần lượt với mức đồng hình là 91%, 94%, 94%, và 95%. 10
Bảng 3.3. Tổ hợp VKDC bò phân giải bã mía Nghiệm thức DC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 21,7cd 16,3ef (mm) 23,7b 10,3g 17,7e 17,7e 17,7e 15,7f 22bcd halo 23bc 3,7h 2,3h ĐK 21d 18e 29a 0i Ghi chú: VKDC: vi khuẩn dạ cỏ, ĐK: đường kính, DC: đối chứng, NT: nghiệm thức. VKDC bò: 1: BM13, 2: BM21, 3: BM49, 4: BM97 NT1: 1, NT2: 2, NT3: 3, NT4: 4, NT5: 1+2, NT6: 1+3, NT7: 1+4, NT8: 2+3, NT9: 2+4, NT10: 3+4, NT11: 1+2 + 3, NT12: 1+2+4, NT13: 1+ 3+4, NT14: 2+3+4, NT15: 1+2+3+4 CVVKDC bò = 6,41% Bảng 3.3 cho thấy có thể có sự tương tác tích cực hoặc ức chế giữa các dòng vi khuẩn với nhau trong đó nghiệm thức 11 (tổ hợp vi khuẩn BM13, BM21 và BM49) phân giải bã mía và tạo đường kính vòng halo lớn nhất là 29 mm. Điều này cho thấy 2 dòng vi khuẩn BM13 và BM21 (có hoạt tính exgl mạnh) phối hợp với BM49 (có hoạt tính engl mạnh) đã hỗ trợ tích cực nhau trong quá trình phân giải bã mía. Theo Wang and McAllister (2002), hoạt động kết hợp của engl và exgl sẽ dẫn đến thay đổi đặc điểm bề mặt của phân tử cellulose t đó sẽ làm cho tỷ lệ phân giải thay đổi nhanh chóng. 3.2.2. Vi khuẩn dạ cỏ trâu Kết quả đã có 15 dòng vi khuẩn được phân lập t dịch dạ cỏ trâu (VKDC trâu). Qua phân tích hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của VKDC trâu, đã tuyển chọn được 4 dòng VKDC trâu trong đó TM11, TM9 và TM17 có cả hai hệ enzim là Engl và Exgl mạnh và dòng TM27 có hoạt tính Engl mạnh. Kết quả định danh 4 dòng VKDC trâu TM9, TM11, BM17 và BM27, đã giải được trình tự của 3 dòng vi khuẩn TM11, TM17 và TM27 và được so sánh với ngân hàng gen NCBI bước đầu cho thấy 3 dòng vi khuẩn này lần lượt tương đồng với Uncultured bacterium nbw138b09c1, Bacterium C6129 và Uncultured bacterium aab40g11 ở mức đồng hình là 88%, 94%, và 94%. Tương tự như bố trí thí nghiệm phối hợp giữa 4 dòng VKDC bò, đối với 4 dòng VKDC trâu TM9, TM11, TM17, TM27 lần lượt được ký hiệu 1, 2, 3 và 4 tổ hợp với nhau tương ứng 15 nghiệm thức. Kết quả 11
phân tích đã cho thấy tổ hợp hai dòng vi khuẩn TM9 và TM11 phân giải bã mía mạnh nhất với đường kính vòng halo phân giải bã mía tạo ra là 26,3 mm (CV=11,45%) và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (bảng 3.4). Bảng 3.4. Tổ hợp VKDC trâu phân giải bã mía Nghiệm thức DC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16,7ef 16,3ef 21,3b 26,3a 18,7c 15,3f (mm) 20bcd 18de 21bc halo 12g 12g ĐK 0h 0h 0h 0h 0h de 3.2.3. Vi khuẩn dạ cỏ cừu Kết quả đã có 25 dòng vi khuẩn được phân lập t dịch dạ cỏ c u (VKDC c u). Phân tích hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của VKDC c u đã tuyển chọn được 4 dòng vi khuẩn CD15, CD11, CD21 và CD43 cho thấy là có khả năng sinh tổng hợp Exgl mạnh thể hiện với đường kính vòng halo phân giải bã mía là 49,33 - 45 - 38,33 và 39,33 mm, trong đó dòng vi khuẩn CD43 có hoạt tính Engl mạnh nhất với đường kính vòng halo phân giải CMC là 56 mm. Kết quả giải trình tự vùng 16S rDNA của 4 VKDC c u CD11, CD15, CD21 và CD43 bước đầu xác định 4 dòng vi khuẩn này lần lượt tương đồng với Betaproteobacteria, Bacterium MOBOSA51, Uncultured bacterium, Bacillus tequilensis TXJB 020 ở mức đồng hình là 79%, 93%, 93%, và 99%. Tương tự như bố trí thí nghiệm phối hợp giữa 4 dòng VKDC bò, đối với 4 dòng VKDC c u CD15, CD11, CD21, CD43 lần lượt được ký hiệu 1, 2, 3 và 4 tổ hợp với nhau tương ứng 15 nghiệm thức. Kết quả phân tích đã cho thấy tổ hợp hai dòng vi khuẩn CD11 và CD43 phân giải bã mía mạnh nhất với đường kính vòng halo phân giải bã mía tạo ra là 32 mm (CV=7,44%) và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (bảng 3.5). 12
Bảng 3.5. Tổ hợp VKDC c u phân giải bã mía Nghiệm thức DC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ĐK halo 15,3efg 16,3de 16,7de 14,3fg 14,0fg 15,7ef 13,7g 18,0d 27,7b 10,7h 20,3c 20,7c 32,0a (mm) 6,0i 7,0i 0k 3.2.4. Vi khuẩn dạ cỏ dê Kết quả đã có 19 dòng vi khuẩn được phân lập t dịch dạ cỏ dê (VKDC dê). Phân tích hoạt tính Engl và Exgl của VKDC dê đã tuyển chọn được 4 dòng VKDC dê trong đó có 3 dòng vi khuẩn DD9, DD13, DD7 có hoạt tính Exgl mạnh và 1 dòng vi khuẩn DD5 có hoạt tính Engl mạnh. Dựa vào trình tự vùng 16S rDNA của 4 dòng vi khuẩn DD5, DD7, DD9 và DD13 kết quả đã xác định được 3 trình tự của 3 dòng vi khuẩn DD5, DD7, DD9 bằng cặp mồi 8F, 1492R (Turner et al., 1999) và được so sánh với ngân hàng gen NCBI bước đầu cho thấy 3 dòng vi khuẩn này lần lượt tương đồng với Escherichia coli RW-29, Bacterium C3-3-1 và Bacillus subtilis RC24 ở mức đồng hình là 97%, 92% và 94%. Tương tự như bố trí thí nghiệm phối hợp giữa 4 dòng VKDC bò, đối với 4 dòng VKDC dê DD9, DD5, DD7 và DD13 lần lượt được ký hiệu 1, 2, 3 và 4 tổ hợp với nhau tương ứng 15 nghiệm thức. Kết quả phân tích đã cho thấy tổ hợp hai dòng vi khuẩn DD9 và DD7 phân giải bã mía mạnh nhất với đường kính vòng halo phân giải bã mía tạo ra là 26,7 mm (CV=8,80%) và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (bảng 3.6). Bảng 3.6. Tổ hợp VKDC c u phân giải bã mía Nghiệm thức DC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ĐK halo 14,3fgh 15,3efg ghl 17,3de 20,7bc 19,0cd 12,3hi 15,7ef 15,7ef 21,7b 8,67k 26,7a (mm) 12,0i 6,33l 5,33l 13,3 0 13
3.2.5. Phân tích quan hệ di truyền của VKDC B.subtilis-JCM1465 B.subtilis-NBRC13719 B.subtilis-S2O-JQ410786.1 CD43-B.tequilensis-TXJB020 VII BM49-Unculturedbacillus-Filt.171 CD15(ST-27F)Bacterium-MOBOSA51 B.subtilis-RC24-FJ263368.1 DD7-5-Bacterium-C3.3.1 DD9-6-B.subtilis-RC24 BM21-B.subtilis-S2O B.pumilus-ST312 B.cereus-MRS1 Butyrivibrio-fibrisolvens VI Lachnospira-multipara BM13-A.xylosoxidans-BL6 CD11-3-Vi-Betaproteobacteria V A.insuavis-LMG26845 A.xylosoxidans-LMG1863 BM97-8S-Unculturedbacterium DD5-3S-E.coli-RW29 IV CD21-7S-Unculturedbacterium TM11-9S-Unculturedbacterium-nbw138b09c1 TM17-6S-Bacterium-C6129 TM27-4S-Unculturedbacterium-aab40g11 Ruminococcus-flavefaciens I, II, Bacteroides-ruminicola Fibrobacter-succinogenes III Hình 3.1. Phả hệ mô tả tương quan di truyền giữa các dòng vi khuẩn * Chỉ số Boottrap ghi ở đầu nhánh; Thanh Scale: đơn vị đo khoảng cách di truyền. Cây phả hệ (hình 3.1) gồm 7 nhánh. Nhánh I-III là 3 dòng vi khuẩn R. flavefaciens, B. ruminicola và F. succinogenes. Nhánh IV gồm các dòng vi khuẩn BM97, DD5, CD21, TM11, TM17 và TM27 với hệ số Bootstrap là 97. Điều này cho thấy những dòng vi khuẩn trong nhóm này có quan hệ di truyền gần với nhau. Nhóm V xuất hiện 02 dòng vi khuẩn BM13 và CD11 và có hệ số Bootstrap 65 so với 02 dòng vi khuẩn thuộc chi Achromobacter; Nhóm vi khuẩn thứ VI là 02 dòng vi khuẩn cũng có nguồn gốc t dạ cỏ đó là Butyrivibrio fibrisolvens và Lachnospira multipara. Nhóm thứ VII xuất hiện 6 dòng vi khuẩn CD43, BM49, CD15, DD7, DD9, và BM21 có quan hệ gần gũi với dòng vi khuẩn B. cereus MRS1 với hệ số Bootstrap là 99. 14
3.3. Tuyển chọn tổ hợp dịch VKDC phân giải xơ trong điều kiện in vitro và in vivo 3.3.1. Ảnh hƣởng của các tổ hợp VKDC giữa các loài đến sự phân giải bã mía trong điều kiện in vitro 3.3.1.1. Ảnh hƣởng của tổ hợp VKDC bò với trâu hoặc cừu hoặc dê Theo Trần C (1979) sự phân giải chất xơ chủ yếu dựa vào hoạt động của hệ vi khuẩn sống trong các cơ quan tiêu hóa. Vì vậy với kết quả phân tích thành hóa học bã mía được phân giải trong điều kiện thí nghiệm in vitro là một trong những pháp phổ biến được sử dụng trong việc đánh giá khả năng tiêu hóa của gia súc, và làm tiền đề cho việc thực hiện các phương pháp in vivo, in situ (Rine et al., 2006). Đối với trường hợp VKDC bò (BM13, BM21 và BM49) phối hợp với VKDC trâu (TM9 và TM11), kết quả bảng 3.7 cho thấy NT1 với 20% dịch dạ cỏ bò (DDC bò) và có bổ sung 6% VKDC bò (BM13:BM21:BM49 theo tỷ lệ 1:1:1) có hàm lượng VCK, cellulose, hemicellulose và lignin bã mía được phân giải nhiều nhất lần lượt là 12,27; 2,86; 0,68; 2,53% (P
- DC -:20% DDC bò; DC+: 6% VKDC bò; NT1: 20% DDC bò +6% VKDC bò; NT2: 20% DDC bò +3% VKDC bò + 3% TM9/ CD43/; NT3: 20% DDCB +3% VKDC bò + 3% TM11/ CD11/ DD9; NT4: 20% DDC bò +3% VKDC bò + 1,5% TM9/ CD43/ DD9 + 1,5% TM11/ CD11/ DD7; NT5: 20% DDCB +1,5% VKDC bò + 4,5% TM9/ CD43/ DD9; NT6: 20% DDCB +1,5% VKDC bò + 4,5% TM11/ CD11/ DD7; NT7: 20% DDCB +1,5% VKDC bò + 2,25% TM9/ CD43/ DD9 + 2,25% TM11/ CD11/ DD7. - CV*VCK, cellulose, hemicellulose, lignin = 1,80; 6,93; 6,51 và 8,17%. - CV**VCK, cellulose, hemicellulose, lignin = 3,91; 4,35; 9,32 và 4,66%. - CV***VCK, cellulose, hemicellulose, lignin = 5,70; 8,28; 10,63 và 13,79%. Tương tự, với sự phối hợp thêm VKDC c u với tỷ lệ 1,5% CD43 và 1,5% CD11 bên cạnh 20% DDC bò, 3% VKDC bò đã cho thấy sự phân giải bã mía đạt hiệu quả cao với hàm lượng VCK, cellulose, hemicellulose, lignin lần lượt 13,31; 7,08; 3,33 và 1,14%. Cũng như sự phối hợp thêm 4,5% VKDC dê bên cạnh 20% DDCB, 1,5% VKDC bò đã cho thấy sự phân giải bã mía đạt hiệu quả cao với hàm lượng VCK, cellulose, hemicellulose, lignin lần lượt 21,27; 8,17; 10,81; 1,26%. 3.3.1.2. Ảnh hƣởng của tổ hợp VKDC bò, cừu và dê T kết quả phân tích VCK, hemicellulose, cellulose và lignin (hình 3.2), ta thấy t sự kết hợp 1,5% VKDC bò (BM13, BM21, BM49) và 4,5 VKDC dê (DD9), hàm lượng VCK, cellulose, hemicellulose và lignin được phân giải nhiều lần lượt là 13,81%, 2,18%, 5,29% và 2,85%. Hình 3.2. VCK, cellulose, hemicellulose và lignin BM được phân giải - DC: dịch dạ cỏ bò; VKDCB: BM13, BM21, BM49 (1:1:1), VKDCC: CD11, CD43 (1:1), VKDCD (DD9) - Các giá trị có cùng ký tự của một chỉ tiêu khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%, CV DM = 4,25%; CVcellulose = 10,91%; CVhemicellulose =3,00 % ; CVlignin = 7,76%. 16
3.3.1.3. Đặc điểm endoglucanase và exoglucanase của VKDC bò, dê * Đặc điểm endoglucanase Endoglucanase của các dòng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BM13, B. subtilis BM21, Bacillus sp. BM49 và B. subtilis DD được tinh sạch qua 2 bước là ammonium sulphate và sắc ký trao đổi ion âm bằng gel Uno sphere Q đã cho thấy hoạt tính đặc hiệu của endoglucanase lần lượt là 84,5 Umg-1, 720 Umg-1, 1645 Umg-1 và 586 Umg-1 cùng với độ tăng hoạt tính tăng lên là 7,1; 22,9; 16,0 và 7,4; Đồng thời endoglucanase của 4 dòng vi khuẩn này có khối lượng phân tử trong khoảng 72,8 đến 34 kDa. * Đặc điểm exoglucanase Exoglucanase của vi khuẩn B. subtilis BM21 cũng lần lượt được tinh sạch bằng ammonium sulphate và sắc ký trao đổi ion âm bằng gel Uno sphere Q đã cho thấy 5 phân đoạn F1 đến F5 của quá trình sắc ký đều có hoạt tính exoglucanase và trung bình hoạt tính đặc hiệu trung bình là 0,29 Umg-1, trung bình độ tăng hoạt tính đạt được 1,34 lần. exoglucanase; Đồng thời có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 81,28 - 71,69 kDa. 3.3.2. Ảnh hƣởng của VKDC bò và dê lên các chỉ tiêu khảo sát trong điều kiện in vivo 3.3.2.1. Sự phát triển của vi khuẩn dạ cỏ Hình 3.3. Đường tăng trưởng của VKDC bò và dê - VKDC: vi khuẩn dạ cỏ, VKDC bò: BM13, BM21, BM49; VKDC dê: DD9; 17