Luận án tiến sĩ Y học: Nghiên cứu ứng dụng virus vaccine sởi và quai bị gây ly giải tế bào điều trị ung thu gan và đại trực tràng trên thực nghiệm

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:174

Thêm vào BST

Báo xấu

48
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm đánh giá khả năng gây độc tế bào và chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro. Đánh giá hiệu quả kháng u của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) mang khối u dòng tế bào ung thư đại trực tràng người HT-29.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Y học: Nghiên cứu ứng dụng virus vaccine sởi và quai bị gây ly giải tế bào điều trị ung thu gan và đại trực tràng trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ DUY CƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRÀNG NGƯỜI CỦA VIRUS VACCINE SỞI VÀ QUAI BỊ TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ DUY CƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRÀNG NGƯỜI CỦA VIRUS VACCINE SỞI VÀ QUAI BỊ TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Khoa học y sinh Mã số: 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Nguyễn Lĩnh Toàn 2. PGS.TS. Hồ Anh Sơn HÀ NỘI, NĂM 2019
LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc! Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám đốc Học Viện, Bộ môn Sinh lý bệnh, Viện nghiên cứu Y-Dược học quân sự, Phòng Sau đại học, Học viện Quân y đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh học tế bào, khoa Sinh học và Phòng Thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzym và Protein (KLEPT), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Hình thái, Viện 69, Bộ Tư Lệnh Lăng Chủ Tịch Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS. Nguyễn Lĩnh Toàn, PGS.TS. Hồ Anh Sơn, những người thầy đã tận tình trực tiếp dạy dỗ, dìu dắt, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng đến các thầy cô trong hội đồng chấm luận án đã dành nhiều thời gian và công sức chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên, giúp đỡ vô tư, tận tình của các anh chị đi trước, đồng nghiệp, bạn bè trong quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới công ơn nuôi dạy của cha mẹ tôi, sự quan tâm giúp đỡ, động viên của vợ, con, anh, chị, em và bạn bè thân thiết để tôi có được ngày hôm nay. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Lê Duy Cương
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong đề tài nghiên cứu có tên: “Nghiên cứu ứng dụng virus vaccine sởi và quai bị gây ly giải tế bào điều trị ung thu gan và đại trực tràng trên thực nghiệm”. Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là một thành viên chính. Tôi đã được Chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề tài này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Lê Duy Cương
MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. Giới thiệu chung ..................................................................................... 3 1.2. Ung thư đại trực tràng ............................................................................ 5 1.2.1. Tình hình ung thư đại trực tràng ...................................................... 5 1.2.2. Nguyên nhân ung thư đại trực tràng ................................................ 6 1.2.3. Cơ chế bệnh sinh của ung thư đại trực tràng .................................. 7 1.3. Liệu pháp virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư đại trực tràng người ........................................................................................................... 22 1.3.1. Sinh học virus sởi và quai bị .......................................................... 22 1.3.2. Virus vaccine sởi và quai bị lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư đại trực tràng............................................................................................ 24 1.3.3. Các cơ chế virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại trực tràng............................................................................................ 27 1.4. Các nghiên cứu virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư trên lâm sàng.............................................................................................................. 35 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 38 2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 38 2.1.1. Động vật ......................................................................................... 38 2.1.2. Chất liệu nghiên cứu ...................................................................... 38
2.1.3. Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu .......................................... 38 2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 40 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và tăng sinh các dòng tế bào .................... 40 2.2.2. Phương pháp tăng sinh và chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine ............................................................................. 42 2.2.3. Phương pháp đánh giá virus vavccine sởi và quai bị ly giải tế bào bằng thử nghiệm 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide ..................................................................................................... 45 2.2.4. Chuẩn bị mẫu tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi và quai bị đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình và tế bào hoại tử bằng phương pháp dòng chảy ........................................................................... 48 2.2.5. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo chương trình và hoại tử bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy........................................................................................................... 51 2.2.6. Phương pháp nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) ........... 54 2.2.7. Phương pháp tạo khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT- 29 trên dùi chuột thiếu hụt miễn dịch và tính kích thước khối u .............. 55 2.2.8. Phương pháp điều trị chuột nude bằng virus vaccine sởi và quai bị ....................................................................................................... 56 2.2.9. Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29..56 2.2.10. Phương pháp phẫu tích lấy mô u và lách chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị ....................................................................................................... 57 2.2.11. Đánh giá tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi và quai bị bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy ....................................... 59 2.2.12. Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị ............................................................. 61 2.2.13. Phương pháp phân tích kết quả ................................................... 62
SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ................................................................................... 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 65 3.1. Tăng sinh dòng tế bào HT-29, Vero, virus vaccine sởi và quai bị .......... 65 3.1.1. Tăng sinh các dòng tế bào HT-29 và Vero ....................................... 65 3.1.2. Tăng sinh virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine ..... 66 3.2. Chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị theo phương pháp TCID50 ........ 67 3.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro .......................................................................... 68 3.3.1. Tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi và quai bị tạo hợp bào in vitro........................................................................................................... 68 3.3.2. Kết quả đánh giá hiệu quả ly giải tế bào ung thư đại tràng người HT-29 của virus vaccine sởi và quai bị bằng nghiệm pháp 3- (4,5- Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide........................ 69 3.3.3. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo chương trình và hoại tử sau nhiễm virus vaccine sởi và quai bị in vitro.73 3.4. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch ............................... 90 3.4.1. Kết quả ghép u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 ........ 90 3.4.2. Kết quả điều trị chuột nude mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 bằng virus vaccine sởi và quai bị ....................................... 91 3.4.3. Tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột thiếu hụt miễn dịch ở các nhóm nghiên cứu sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị............. 96 3.4.4. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị ........................................................ 99 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 101 4.1. Tăng sinh các dòng tế bào Vero và tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro ........................................................................................... 101 4.1.1. Tăng sinh dòng tế bào Vero ......................................................... 101 4.1.2. Nuôi cấy, tăng sinh dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29.. 102 4.2. Tăng sing virus vaccine sởi, quai bị và Chuẩn độ TCID50 ................ 103
4.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro ........................................................................................... 107 4.3.1. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp tế bào ung thư đại tràng người HT-29 bằng cách tạo hợp bào in vitro ............................... 107 4.3.2. Đánh giá khả năng ly giải tế bào HT-29 của virus vaccine sởi và quai bị bằng nghiệm pháp 3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) - 2,5 diphenyl tetrazolium bromide ............................................................................... 109 4.3.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào HT-29 thông qua kích hoạt con đường tế bào chết theo chương trình in vitro ......................... 112 4.4. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch ....................................................... 123 4.4.1. Đánh giá độc tính của virus vaccine sởi và quai bị trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 ....... 123 4.4.2. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch .......................................... 125 4.4.3. Virus vaccine sởi và quai bị kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch.128 4.4.4. Kết quả siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị ..................................................................................................... 134 KẾT LUẬN ................................................................................................... 140 1. Phối hợp virus vaccine sởi và quai bị có hiệu quả ly giải trực tiếp và kích hoạt con đường chết tế bào apoptosis in vitro ở dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 .................................................................................... 140 2. Phối hợp virus vaccine sởi và quai bị có hiệu quả kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép trên chuột nude........................139 KHUYẾN NGHỊ ........................................................................................... 142 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI, LUẬN ÁN ............................................................................ 143 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 144
DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT APC Adenomatous polyposis coli (Coli polyp tuyến) AIF Apoptosis inducing factor (yếu tố tạo ra chết tế bào theo chương trình) CEA Carcinoembryonic Antigen (kháng nguyên ung thư biểu mô phôi) CIMP CpG island methylator phenotype (kiểu hình methyl hóa đảo CpG) CPE Cytopathic effect (hiệu ứng gây độc tế bào) CpG Cytosine – Guanine nucleotide CRC Colorectal Cancer (ung thư đại trực tràng) DAMP Damage-Associated Molecular Pattern (kiểu phân tử liên quan đến các tổn thương) DC Dedritic Cell (tế bào đuôi gai) DNA Deoxyribonucleic acid F Fusion (hòa màng) HN Hemagglutinin neuraminidase H Hemagglutinin HNPCC Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (ung thư đại trực tràng di truyền không do Polyp) IFN Interferon IL Interleukin LINE-1 (Long interspersed nuclear elements-1) yếu tố nhân kích thước dài rải rác 1 LLC Lewis Lung Cancer (ung thư phổi chuột) MeV Mealse vaccine virus (virus vaccine sởi) MHC Major Histocompatibility Complex (phức hợp tương hợp mô chính)
MMR Mismatch Repair (sửa chữa ghép đôi không xứng) MOI Multiplicity of infection MSI Microsatellite Instability (bất ổn trình tự lặp ngắn của DNA) MTT 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide MuV Mumps vaccine virus (virus vaccine quai bị) NIS Sodium-Iodine Symporter (chất mang iod natri) NK Natural Killer (giết tự nhiên) OV Oncolytic Virus (virus ly giải tế bào ung thư) PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern (kiểu phân tử liên quan đến tác nhân gây bệnh) PBS Phosphate buffered saline (dung dịch muối đệm phosphat) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) PFU Plaque forming units (Số hạt virus nhiễm vào một tế bào) RNA Ribonucleic acid ROS Reactive Oxygen Species (các gốc tự do chứa oxy hoạt động) TCID Tissue Culture Infectious Dose (liều nhiễm mô nuôi cấy) TGFβ Transforming Growth Factor β (yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β) TNF Tumor necrotic factor (yếu tố hoại tử khối u) Wnt Wingless-related integration (tên của con đường truyền tín hiệu vào nội bào thông qua các thụ thể trên bề mặt tế bào)
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Các thử nghiệm lâm sàng của MeV và MuV………………………36 3.1. Kết quả tạo khối u tế bào HT-29 trên đùi chuột nude…………...…90 3.2. Kết quả theo dõi sức khỏe chuột sau điều trị MeV và MuV ............ 92
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1. KếT quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 3 ............ 69 3.2. Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 4 ............. 70 3.3. Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 5 ............. 71 3.4. So sánh kết quả MTT các nhóm MuV+MeV ngày 3, 4 và 5 ............ 71 3.5. So sánh kết quả MTT các nhóm MeV ngày 3, 4 và 5....................... 72 3.6. So sánh kết quả MTT các nhóm nhiễm MuV ngày 3, 4 và 5 ........... 72 3.7. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV ............. 74 3.8. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV............. 74 3.9. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV .......... 75 3.10. Tỉ lệ tế bào HT-29 hoại tử ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV............. 76 3.11. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV ............. 78 3.12. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV............. 78 3.13. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV .......... 79 3.14. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 4 nhiễm MuV, MeV ........................ 80 3.15. Tỉ lệ tế bào apoptosis ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV .................... 82 3.16. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV............. 82 3.17. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV .......... 83 3.18. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV ........................ 84 3.19. So sánh tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 3, 4 và 5 nhiễm MeV, MuV ........................................................................................ 86 3.20. So sánh tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm ở ngày 3, 4 và 5 nhiễm MeV, MuV ............................................................................. 88 3.21. So sánh tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis muộn ở ngày 3, 4 và 5 nhiễm MeV, MuV ............................................................................. 89 3.22. Thay đổi trọng lượng chuột sau điều trị bằng MeV, MuV ............... 92 3.23. Kết quả kích thước khối u (mm3) sau điều trị bằng MeV, MuV ...... 93 3.24. So sánh thời gian sống trung bình ở các nhóm chuột sau điều trị bằng MeV và MuV ........................................................................... 94
Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.25. Kết quả tỉ lệ chuột còn sống sau điều trị bằng MuV, MeV .............. 95 3.26. Kết quả tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột nude sau điều trị bằng MeV và MuV. .......................................................................... 98
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1. Gia đình Paramyxoviridae ................................................................ 23 1.2. MeV, MuV lây nhiễm đặc hiệu tế bào CRC ..................................... 25 1.3. MeV, MuV ly giải tế bào CRC trực tiếp và qua trung gian miễn dịch…………………………………………………………………30 1.4. Vai trò sialidase của MeV, MuV hoạt hóa tế bào lympho T gây độc tế bào u. ...................................................................................... 35 2.1. Các máy sử dụng cho nghiên cứu…………………………..………39 2.2. Nuôi cấy và tăng sinh tế bào trong phòng thí nghiệm ...................... 40 2.3. Sơ đồ nhiễm MeV, MuV để chuẩn độ TCID50 ................................. 43 2.4. Sơ đồ pha loãng nồng độ MeV, MuV ............................................... 44 2.5. Sơ đồ các nhóm nhiễm MeV, MuV làm nghiệm pháp MTT ............ 47 2.6. Bộ Kit làm nghiệm pháp MTT.......................................................... 47 2.7. Sơ đồ nhiễm MeV, MuV theo các nhóm đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis và tế bào hoại tử in vitro ................................................... 49 2.8. Mẫu xác định thông số chuẩn cho máy trên phần mềm BD FACS Diva đánh giá tỉ tế bào apoptosis và tế bào hoại tử .......................... 53 2.9. Buồng nuôi chuột nude ..................................................................... 54 2.10. Ghép u tế bào HT-29 và đo kính thước u trên đùi chuột nude ......... 56 2.11. Mẫu xác định thông số chuẩn cho máy trên phần mềm BD FACS Diva đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột nude ............. 61 3.1. Tế bào HT-29 bám đáy và phát triển……………………………….65 3.2. Tế bào Vero bám đáy và phát triển ................................................... 65 3.3. Tế bào Vero nhiễm MeV, MuV ........................................................ 66 3.4. Kết quả nhuộm xanh methylen chuẩn độ TCID50............................. 67 3.5. Hình ảnh tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV tạo hợp bào in vitro ...... 68 3.6. Biến đổi hình thái của tế bào HT-29 chết theo chương trình............ 73 3.7. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 5 ............................................ 77
Hình Tên hình Trang 3.8. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 4 ............................................ 81 3.9. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 3 ............................................ 85 3.10. Kết quả ghép u tế bào HT-29 dưới da đùi chuột nude ...................... 91 3.11. Lách và tế bào lách chuột nude ở các nhóm nghiên cứu .................. 96 3.12. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u HT-29 bình thường......................... 99 3.13. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị MeV, MuV....... 99
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer-CRC) là quá trình bệnh lý phát sinh từ đại trực tràng, gây nên bởi sự tăng bất thường các tế bào có khả năng xâm lấn hay lan rộng vào các bộ phận khác của cơ thể. Là quá trình bệnh lý phát triển qua nhiều giai đoạn, hậu quả từ sự tích lũy tăng dần của đột biến gen, đột biến ngoài gen và kết quả bất thường trong con đường tín hiệu nội bào Wnt. Số bệnh nhân bị CRC và số ca tử vong do CRC vẫn tăng theo thời gian. Những năm gần đây, đã có nhiều phương pháp mới, tiến bộ áp dụng điều trị CRC như: liệu pháp miễn dịch, gen trị liệu, điều trị đích, liệu pháp sử dụng các hạt nano, …. Mặc dù có các phương pháp điều trị mới với nhiều hứa hẹn, nhưng kết quả vẫn chỉ là kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, tiên lượng bệnh nhân CRC đã di căn sống trên 5 năm chỉ dưới 20%. Sự phát triển của sinh học phân tử đã cho chúng ta hiểu biết hơn về cơ chế bệnh ung thư và virus. Các nhà khoa học đã tạo ra các chủng virus có khả năng lây nhiễm và ly giải chọn lọc các tế bào ung thư, kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng ung thư. Sử dụng virus ly giải tế bào u (OV) điều trị ung thư là một phương thức biến sự sao chép của virus thành vũ khí tiêu diệt các tế bào ung thư và hầu như không ảnh hưởng đến các tế bào lành. OV có nhiều lợi thế hơn so với các phương pháp điều trị ung thư truyền thống như: giảm độc tính tác dụng phụ, có khả năng áp dụng rộng rãi cho nhiều loại ung thư, là một phương thức tự khuếch đại các hoạt động kháng u bằng cách virus tự nhân lên ly giải tế bào u lan rộng. Hiện nay, với sự phát triển về sinh học phân tử, các nhà khoa học có thể thiết kế bộ gen của virus nhằm tăng khả năng lây nhiễm và ly giải tế bào ung thư đặc hiệu cũng như kiểm soát được mức độ virus nhân lên trong cơ thể. Liệu pháp sử dụng các chủng virus vaccine sởi (MeV) và virus vaccine quai bị (MuV) sống, giảm độc lực điều trị ung thư người đã được chứng minh
2 có hiệu quả. Nhiều thử nghiệm lâm sàng sử dụng các virus này bằng các con đường khác nhau: tiêm nội u, tiêm tĩnh mạch, tiêm phúc mạc… điều trị nhiều loại ung thư như: u lympho tế bào T ở da, ung thư đại trực tràng, ung thư buồng trứng, u nguyên bào đệm đa dạng… đã được báo cáo là có kết quả khả quan (bảng 1.1). Trong nhiều năm qua, các chương trình tiêm chủng mở rộng với quy mô toàn cầu bằng MeV và MuV sống, giảm độc lực cũng đã rất thành công, thiết lập 1 hồ sơ an toàn rộng khắp thế giới. Các chủng MeV và MuV rất khó gây bệnh trở lại vì hầu hết mọi người đều đã được chủng ngừa. Bên cạch đó, hầu hết các nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng cũng đã chứng minh sử dụng MeV, MuV điều trị ung thư là an toàn và rất ít tác dụng phụ. Sử dụng MeV và MuV điều trị ung thư là liệu pháp có tiềm năng đang được quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước phát triển. Nhưng cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào đi sâu đánh giá hiệu quả sử dụng phối hợp MeV và MuV điều trị ung thư đại tràng người. Nghiên cứu phối hợp MeV với MuV kháng ung thư đại tràng người trên thực nghệm sẽ mở đầu cho việc đi sâu nghiên cứu, áp dụng một phương pháp mới điều trị ung thư đại tràng người. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm” với mục tiêu sau: 1. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro. 2. Đánh giá hiệu quả kháng u của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) mang khối u dòng tế bào ung thư đại trực tràng người HT-29.
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung OV gần đây đã được công nhận là một phương pháp điều trị ung thư có nhiều hứa hẹn. OV có thể là virus tự nhiên hoặc là virus đã biến đổi gen, có khả năng nhân lên và giết chết các tế bào ung thư một cách chọn lọc mà hầu như không làm tổn hại các tế bào bình thường xung quanh. Khác với liệu pháp gen, OV không đơn thuần là một chất mang gen trị liệu, nó là tác nhân thuốc điều trị ung thư. Giả thuyết nhiễm virus có thể kháng ung thư bắt đầu bằng phát hiện khối u bị thoái triển trong và sau khi nhiễm virus [1]. Năm 1949, có 22 bệnh nhân bị bệnh Hodgkin được điều trị bằng chế phẩm chiết xuất từ huyết thanh hoặc mô có chứa virus viêm gan, kết quả cho thấy virus làm thoái triển các khối [2]. Từ năm 1950 đến 1980, các thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư được thực hiện bằng các chủng virus hoang dã hoặc các virus tự nhiên, giảm độc lực, bao gồm cả virus viêm gan, virus West Nile, virus dengue và các adenovirus… [3] Tuy nhiên, những loại virus này chưa thực sự chứng minh được hiệu quả điều trị, cũng như chưa kiểm soát được độc tính với cơ thể cũng như mức độ virus nhân lên trong tế bào ung thư. Hiện nay, OV đã được công nhận là một phương pháp điều trị ung thư. Để tăng cường cho virus nhân lên và ly giải đặc hiệu tế bào ung thư, các nhà nghiên cứu đã lựa chọn loại virus không gây bệnh cho người nhưng lại có khả năng nhằm đích các tế bào ung thư, hoặc biến đổi bộ gen virus để tăng cường khả năng nhằm đích tế bào ung thư. Đại diện cho chiến lược này là virus chủng reolysin, một biến thể của reovirus, có thuộc tính ly giải tế bào u thông qua hoạt hóa tín hiệu RAS, do đó hạn chế được mức độ gây độc cho các tế bào bình thường. Vào năm 1994, Mineta T và cộng sự đã chúng minh chủng virus herpes simplex là hrR3 đột biến mang gen lacZ của Esckerichia coli, có
4 khả năng điều trị khối u não in vivo hiệu quả hơn nhiều so với các chủng hoang dã [4]. Tác giả có thể theo dõi được chủng virus này nhân lên rất tốt trong các tế bào ung thư não và hầu như không có độc tính với tế bào lành. Phát hiện này đã mở ra một lĩnh vực mới về thiết kế và biến đổi bộ gen của OV làm tăng hiệu quả ly giải tế bào u. OV phát triển mạnh mẽ trong suốt ba thập kỷ qua, phát hiện quan trọng nhất trong quá trình hoạt động ly giải tế bào ung thư là OV có khả năng tạo ra miễn dịch đặc hiệu chống khối u [5]. Hiện nay, vấn đề này đã được công nhận đây là tính năng quan trọng của liệu pháp OV. Có hai chủng virus biến đổi gen đã được chấp thuận để tiếp thị dưới dạng thuốc: một là Oncorine (H101) hay ONYX-015, một Adenovirus bị mất đoạn gen E1B, đã được các cơ quan có thẩm quyền phê duyệt cho điều trị ung thư đầu, cổ và ung thư thực quản ở Trung Quốc năm 2005 [6]. Cho đến nay, việc sử dụng Oncorine trên lâm sàng vẫn còn hạn chế. Hai là T-Vec, 1 chủng virus herpes biến đổi gen, được cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ chấp thuận cho điều trị u tế bào hắc tố vào tháng 10 năm 2015, sau đó được phê duyệt ở Châu Âu vào tháng 1 năm 2016 và tại Úc vào tháng 5 năm 2016 [7]. Nhiều thử nghiệm T-Vec trên lâm sàng hiện đang được các công ty dược phẩm thực hiện trên toàn thế giới nhằm mở rộng ứng dụng và thị trường. Trong số các chủng virus ly giải tế bào ung thư, chủng MeV và MuV cho thấy có nhiều tiềm năng chống ung thư. Đến nay, MeV và MuV đã được chứng minh là có khả năng kháng nhiều loại tế bào ung thư trong đó có cả CRC in vitro, in vivo và cả trên lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau. Ngoài tính lựa chọn đặc hiệu tế bào ung thư, MeV và MuV còn kích hoạt mạnh đáp ứng miễn dịch của vật chủ góp phần rất quan trọng vào hiệu quả ly giải tế bào ung thư [8], [9].
5 1.2. Ung thư đại trực tràng 1.2.1. Tình hình ung thư đại trực tràng CRC vẫn là một gánh nặng sức khỏe rất lớn cho cộng đồng. Trên thế giới, nó là loại ung thư phổ biến thứ ba ở nam giới và phổ biến thứ hai ở nữ giới, là nguyên nhân đứng thứ ba gây tử vong liên quan đến ung thư. Trong năm 2017, ước tính có khoảng 95.520 trường hợp ung thư đại tràng và 39.910 trường hợp ung thư trực tràng mới được chẩn đoán tại Mỹ. Trong khi số liệu cho thấy ung thư đại tràng ở nam giới (47.700 trường hợp) và nữ giới (47.820 trường hợp) là khá bằng nhau, nhưng ung thư trực tràng ở nam giới (23.720 trường hợp) lại cao hơn nữ giới (16.190 trường hợp). Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở thổ dân Alaska (91/100.000 người), người Mỹ gốc Phi (49/100.000 người), thấp nhất ở người Mỹ gốc Á và người dân đảo Thái Bình Dương (32/100.000 người). Ước tính có 27.150 bệnh nhân nam giới và 23.110 nữ giới sẽ chết vì CRC vào năm 2017 [10]. Tỉ lệ mắc CRC rất đa dạng về tuổi, chủng tộc, sắc tộc và kiểu mắc. Ở các nước thu nhập cao, tỉ lệ ung thư đại tràng cao hơn ung thư trực tràng và tăng khởi phát sau tuổi 50 là đặc trưng của ung thư trực tràng. Tỷ lệ mắc CRC đang có xu hướng trẻ hóa người mắc. Tỉ lệ mắc CRC tiếp tục giảm ở những người từ 50 tuổi trở lên (giảm 32% kể từ năm 2000). Có được xu hướng này là do sàng lọc CRC có hiệu quả, có thể ngăn ngừa CRC sớm bằng cách phát hiện và loại bỏ polyp tiền ung thư. Tỷ lệ mắc CRC giảm nhanh nhất ở những người từ 65 tuổi trở lên và đối với các khối u nằm ở đại tràng xa. Trong khi đó tỷ lệ giảm chậm nhất ở những người từ 50-64 tuổi và đối với các khối u trực tràng (giảm 9% tỷ lệ mắc khối u trực tràng ở nam giới từ 50-64 tuổi và giảm không đáng kể ở phụ nữ trong độ tuổi này; giảm 38% ở nam giới và 41% nữ giới ở độ tuổi từ 65 tuổi trở lên). Tỷ lệ mắc CRC ở những người từ 50 tuổi trở lên đang giảm ở hầu hết các tiểu bang của Mỹ, với mức giảm hơn 5% hàng năm từ năm 2009-2013 tại bảy tiểu bang (Nebraska, Maine, Rhode