Luận văn : Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phương pháp marker phân tử part 1

Chia sẻ: Pkjd Opiuj | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

93
lượt xem 30
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

1 PHẦN I: GIỚI THIỆU Đặt vấn đề Hiện nay dứa là một trong 3 loại cây ăn quả hàng đầu của nước ta (chuối, dứa, cam quýt), chiếm vị trí quan trọng trong nền sản xuất rau quả. Cây dứa với ưu thế chống chịu được đều kiện ngoại cảnh, phẩm chất cao, sớm thu hồi vốn nên đang là một trong những chiến lược nhằm nâng cao đời sống cho người lao động và nền kinh tế xã hội. Với tiềm năng kinh tế cao, diện tích dứa đang được mở rộng trên phạm vi cả nước (36.541...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phương pháp marker phân tử part 1

1 PHẦN I: GIỚI THIỆU Đặt vấn đề 1.1. Hiện nay dứa là một trong 3 loại cây ăn quả hàng đầu của nước ta (chuối, dứa, cam quýt), chiếm vị trí quan trọng trong nền sản xuất rau quả. Cây dứa với ưu thế chống chịu được đều kiện ngoại cảnh, phẩm chất cao, sớm thu hồi vốn nên đang là một trong những chiến lược nhằm nâng cao đời sống cho người lao động và nền kinh tế xã hội. Với tiềm năng kinh tế cao, diện tích dứa đang được mở rộng trên phạm vi cả nước (36.541 ha năm 2002) (Tuấn và Tiến, 2002) nhằm tăng sản lượng cho ti êu dùng và nguyên liệu cho các nhà máy chế biến ở các tỉnh như: Tiền Giang, Kiên Giang, Long An, Hậu Giang, Thành Phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai.. Trước đây, dứa Queen được trồng phổ biến ở nước ta nhưng có nhiều nhược điểm không phù hợp với công nghệ cơ giới và tỉ lệ thành phần trong chế biến thấp. Chính vì thế, dứa Cayenne đang là giống được quan tâm với nhiều đặc điểm tốt và diện tích trồng đạt 3600 ha năm 2002 ở các tỉnh phía Bắc và Đông Nam Bộ (Tuấn và Tiến, 2002). Tuy nhiên, diện tích trồng mới nguồn vật liệu này vẫn còn thấp do nhu cầu giống chưa đủ và phần lớn giống là nhập ngoại. Vì vậy, trước hết cần phải tìm hiểu tính đa dạng di truyền của giống dứa Cayenne, trên cơ sở đó để thực hiện có hiệu quả việc nhân và tạo giống đồng thời xây dựng các định hướng về kiểm tra, quản lý và bảo vệ nguồn gen các giống cây trồng sẵn có trong nước cũng như du nhập từ nước ngoài. Do đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài “nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phƣơng pháp marker phân tử”. Để nghiên cứu đa dạng di truyền người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chỉ thị (marker) DNA (RFLP, RAPD, AFLP, SSR..). Tuỳ vào đối tượng, điều kiện và mục đích nghiên cứu mà người ta lựa chọn phương pháp phù hợp nhất. Trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính đa dạng về di truyền của dứa Cayenne bằng marker RAPD. Hy vọng kết quả của đề tài này sẽ đóng góp một phần nhất định vào tiền đề của công tác chọn tạo giống dứa ở Việt Nam.
2 Mục tiêu và yêu cầu 1.2. Mục tiêu 1.2.1. - Tìm hiểu và sưu tầm nguồn gen của cây dứa Cayene bằng phương pháp chỉ thị (marker) phân tử. - Tìm hiểu sự đa dạng về kiểu hình của các dòng dứa từ giống Cayenne. - Đề xuất vật liệu lai ban đầu cho công tác chọn và tạo giống dứa Cayenne. Yêu cầu 1.2.2. - Thành thạo thao tác ly trích DNA. - Nắm vững kỹ thuật PCR, hạn chế sai sót trong quá trình thực hiện. - Nắm vững các kỹ thuật sử dụng chỉ thị RAPD - Hiểu rõ về các phần mềm xử lý thống kê sinh học như NTSYS-pc, Excel, IRRISTAT ...
3 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Một số khái niệm về đa dạng sinh học 2.1. Đa dạng sinh học 2.1.1. Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên-WWF (Word Wildlife fund) (1989), đa dạng sinh học được định nghĩa như sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là các gen chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp tồn tại trong môi trường”. Do vậy đa dạng sinh học được xem xét theo 3 mức độ: - Đa dạng sinh học ở cấp độ loài bao gồm toàn bộ các sinh vật sống trên trái đất, từ vi khuẩn đến các loài thực vật, động vật và các loài nấm. - Đa dạng sinh học ở mức độ gen là sự khác biệt gen giữa các loài, giữa các quần thể sống cách ly về địa lý cũng như các cá thể cùng chung sống trong một quần thể. - Đa dạng sinh học còn bao gồm sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó các loài sinh sống và các hệ sinh thái, nơi mà các loài cũng như các quần xã sinh vật tồn tại và cả sự khác biệt của mối tương quan giữa chúng với nhau (Phạm Bình Quyền, 2002). - Ngoài ra đa dạng sinh học còn liên quan đến việc phân bố địa lý. Đây là sự phân biệt có tầm rộng và là chiến lược nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới . Đa dạng di truyền 2.1.2. Các cá thể trong một quần thể thường có genome khác nhau. Sự đa dạng về genome được biểu hiện qua sự khác nhau về gen giữa các cá thể. Những alen khác nhau của cùng một gen có thể làm cho sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá thể khác nhau là khác nhau. Những cây trồng được trồng lai ghép hay những động vật được lai tạo từ những genome khác nhau có thể tạo ra những giống cây trồng, vật nuôi cho năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt (Richard B. Primack, 1999). Trong quá trình sinh sản hữu tính, kiểu gen của các cá thể trong quần thể sẽ tăng lên do kết quả tái tổ hợp do đột biến.
4 Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong quần thể. Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể này thích nghi hơn với những thay đổi môi trường (Richard B. Primack, 1999). Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền 2.1.3. Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên và nó cũng quan trọng đối với con người. Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trường. Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con người. Giới thiệu chung về dứa Cayene 2.2. Nguồn gốc và phân loại 2.2.1. Cây dứa có tên khoa học Ananas comosus L. (Merrill), thuộc họ Bromeliaceae, chi Ananas , trong chi này có 6 loài, trong đó loài Ananas comosus là có giá trị kinh tế hơn cả. Dứa có nguồn gốc từ Nam Mỹ, theo K.F Baker và J.L.Collin thấy xuất hiện ở miền nam Braxin, bắc Achentina và Paragoay. Theo Hume và Miller, các giống dứa đang trồng hiện nay được chia làm 3 nhóm: Cayene, Queen (hay còn gọi là Nữ hoàng), Spanish (hay Tây Ban Nha). Trong đó nhóm Cayene được chia làm các giống như Smooth Cayene, Sarawak (giống có khả năng chịu ẩm, úng và chống bệnh héo), Enville, Baron roth schild, Typhone, Smooth Guatemalan... Ở Việt Nam, theo đều tra nghiên cứu của viện nghiên cứu rau quả đã tập hợp được 3 giống Cayenne được trồng ở nước ta gồm: Cayenne chân mộng trồng ở Vĩnh Phú, Cayenne Phủ Quỳ trồng ở Nghĩa Đàn - Nghệ An, Cayenne Đức Trọng trồng ở Lâm Đồng và ở Nam Bộ chủ yếu là Cayenne trơn nguồn gốc từ Pháp. Nguồn gốc của các giống Cayene trồng ở nước ta thường nhập từ nước ngoài và qua tiến hành lai tạo (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2002).
5 Giá trị kinh tế 2.2.2. Về mặt dinh dưỡng, dứa được xem là “hoàng hậu” trong các loại quả vì hương vị thơm ngon và giàu các chất dinh dưỡng. Wooster và Blank (1950) đã phân tích thành phần dinh dưỡng của quả dứa Cayenne ở Hawaii cho kết quả sau: - Đường 11 - 15 %, saccharose chiếm 1/3, còn lại là glucose và fructose - Acid: 0,6 % gồm 78 % acid citric, còn lại là acid malic và acid khác - Hàm lượng các loại vitamin: vitamin A - 130 đơn vị quốc tế, vitamin B1 - 0,02 mg, vitamin C - 4,2 mg / 100 g - Các chất khoáng: Ca - 16 mg, P - 11 mg, Fe - 0,3mg, Cu - 0,07 mg - Protein - 0,4 g và lipit - 0,2 g - Hydratcacbon - 13,7 g, nước 85,5 g và xenlulose - 1,4 g Ngoài ra trong quả dứa còn có men bromelin giúp cho việc tiêu hoá rất tốt. Nó được dùng trong công nghiệp thực phẩm, thuộc da, vật liệu làm phim... Về hiệu quả kinh tế: Cayenne cho quả to, sản lượng cao, có thể đạt trên diện tích lớn ở HaWaii 80 – 100 tấn / ha. Aubert cho rằng sản lượng Cayenne có thể gấp đôi dứa Queen. Đồng thời, ưu điểm lớn của Cayenne là vỏ mỏng, nước nhiều, quả hình ống, là loại hình lý tưởng để chế biến đồ hộp, dù là dứa khoanh hay nước dứa.Về mặt canh tác, nhờ quả không có gai nên thao tác thuận lợi, hiệu suất lao động tăng lên nhiều. Hiện nay ngành nông nghiệp nước ta đang có kế hoạch phát triển và mở rộ ng diện tích dứa nhằm tăng sản lượng cho các nhà máy chế biến (Vũ Công Hậu, 1999). Đặc điểm hình thái của dứa Cayenne 2.2.3. Dứa là một loại cây thảo lâu năm: sau khi thu hoạch quả các mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước, cũng cho một quả; quả thứ hai thường bé hơn quả trước. Các mầm nách của cây con lại cho phát triển và cho một quả thứ ba. Cây dứa trưởng thành cao 1,0 - 1,2 m và có hình dạng như một con cù (cù- thứ đồ chơi của trẻ em) có đường kính khoảng từ 1,3 - 1,5 m, có đáy bẹt, tán cây xoè rộng. Cấu tạo của dứa (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2002) gồm có các thành phần sau:
6 2.2.3.1. Rễ Rễ thường là bất định và mọc ngang mặt đất. Dựa vào nguồn gốc phát sinh chia thành các dạng: rễ cái, rễ nhánh và rễ bất định. Rễ dứa thuộc loại ăn nông, phần lớn do nhân giống bằng chồi (nhân giống vô tính) nên mọc từ thân ra, nhỏ và phân nhiều nhánh. Ở tầng đất dày rễ có thể ăn sâu 0,9 m. Nhưng bộ rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10 - 26 cm và phát triển rộng đến 1 m. Rễ dứa thuộc loại háo khí ưa xốp và thoáng nên trồng tốt nhất trên đất đồi feralit đỏ vàng và kém phát triển trên đất cát, đất sét. Đồng thời rễ dứa phát triển tốt trong đất có hàm lượng nước từ 10 – 20 %, độ pH thích hợp nhất từ 4.0 - 5.5, giới hạn 3.5 - 6.0. Để cho bộ rễ phát triển bình thường cần cung cấp dinh dưỡng N, P, K, Ca, Fe, Mg, S…trong đó N, P có vai trò quan trọng. Thiếu N, P rễ phát triển kém, không ra quả. Sinh trưởng và phát triển của rễ bị ảnh hưởng trực tiếp bởi nhiệt độ. Trong phạm vi 12 - 300C, nhiệt độ càng tăng bộ rễ phát triển càng mạnh và ngược lại. Nhiệt độ giới hạn 5 - 430C nếu cao hay thấp hơn trong nhiều ngày bộ rễ sẽ chết. Theo Mao Tác nghiên cứu 3 giống dứa Cayenne ở Philippin, Đài Loan và Nam Ninh năm 1960 cho biết hoạt động của bộ rễ đạt đỉnh cao vào tháng 5 và tháng 10 do nhiệt độ các tháng này tăng cao. Các nguyên liệu chồi khác nhau đem trồng đều có ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển bộ rễ dứa. 2.2.3.2. Thân Thân cây dứa chia làm hai phần: một phần trên mặt đất và một phần ở dưới đất. Hình dạng của thân biểu hiện tình trạng của cây như thân ngắn, bặm chứng tỏ cây khỏe, ngược lại thân dài bé là cây yếu. Thân cây dứa trưởng thành dài 20 - 30 cm, đường kính 3 – 7 cm, trọng lượng 200 – 400 g. Ở trung tâm thân là một mô rỗng, mềm, chứa các chất dinh dưỡng chứa nhiều tinh bột ở giữa, nối tiếp là một lớp bó mạch có nhiều xơ, và ngoài cùng được bao bọc bởi một lớp biểu bì và gốc lá. Thân mọc khỏe trong đều kiện nhiệt độ 250C trở lên, nếu dưới 50C thì ở đỉnh thân và gốc lá bị những vết cháy do rét. Nếu vừa lạnh vừa mưa kéo dài thì đỉnh thân sẽ bị thối. Trường hợp ngập nước thì cả rễ và thân đều bị thối.
7 2.2.3.3. Lá Lá mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuống, hẹp ngang và dài. Mặt lá và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác dụng làm giảm độ bốc hơi nước cho lá. Hình dạng lá không có gai, trừ một vài cái gai ở ngọn, màu xanh thẩm với đốm nâu đỏ, lá dài từ 80 – 100 cm, rộng 5 – 8 cm, khi trưởng thành có khoảng 60 - 80 lá. Hình dạng lá thay đổi tuỳ theo vị trí, tuổi của chúng từ đó dẫn đến việc sắp xếp chúng thành nhiều loại khác nhau. Diện tích lá lớn thì quả thường to và ngược lại cho nên cần phải tìm cách tác động cho cây đạt được số lá tối đa. Nhiệt độ giới hạn của dứa là 5 - 400C. Trên 400C cây ngừng hoạt động, ở 80C cây cũng ngừng ra lá, 50C các hoạt động ngừng và dưới 00C cây chết rét. Sinh trưởng của lá còn bị ảnh hưởng bởi độ phì của đất. Bón phân bổ sung một cách hợp lý làm cho cây sinh trưởng khỏe, bộ lá sum xuê. Vì vậy, ta cần phải cung cấp đủ lượng dinh dưỡng và cân đối giữa NPK cùng các nguyên tố khác để đảm bảo cho bộ lá sinh trưởng tốt. 2.2.3.4. Hoa, quả, hạt Dứa trung bình có 150 hoa ,với lá bắc dưới hoa gồm có 3 lá đài, 3 cánh hoa, 6 nhị đực xếp thành 2 vòng, 1 nhị cái có 3 tâm bì và bầu hạ. Cánh hoa màu xanh mờ với biến sắc màu đỏ tía, gốc có màu trắng nhạt và trên mặt cánh hoa có những vảy. Trong một năm dứa ra hoa nhiều vụ thường vào tháng 2 – tháng 3 và thu hoạch quả vào tháng 6 – tháng 7. Cuống quả của dứa có chiều dài so với chiều dài quả tương đối ngắn, trọng lượng quả trung bình cao từ 2 - 4 kg / trái, hình trụ, mắt to và dẹt, màu đỏ da cam, khi chín ở giữa mắt hơi nhô lên. Thịt quả khi chín ít nhiều trong, không xơ, màu vàng nhạt. Vị ngọt và chua, đường kính lõi trung bình khoảng 2,5 cm.Trên ngọn quả dứa là một chồi ngọn thường to và đơn độc. Theo Cl.Py và Tissesau (1960) nhiệt độ thích hợp cho quả chín là 250C nếu quá cao sẽ làm tăng độ chua trong quả và phẩm chất kém. Dứa không có hạt nếu để tự do. Nếu đem lai các giống khác nhau thì có thể có hạt. Hạt dứa rất bé, có màu tím đen, hình trứng tròn chỉ dài độ 3 mm, mỗi quả con chỉ có vài hạt. Hạt dứa nảy mầm rất yếu cần phải xử lý mới có tỷ lệ nảy mầm cao.
8 2.2.4. Đặc tính di truyền học Năm 1931, J.L Collins và K.R.Kern đã xác định số nhiễm sắc thể của Ananas Comosus và các loài lân cận là 2n = 50. Ở tất cả các loài A.comosus thì nhiễm sắc thể đều nhỏ và hình cầu. Một trong những đặc trưng di truyền thể hiện ở dứa là hình thái lá. Nó được phân biệt thành 3 dạng: - Lá chỉ có gai ở ngọn, đặc trưng cho Smooth Cayenne. - Lá hoàn toàn có gai, trường hợp xuất hiện hầu hết ở các loài. - Lá hoàn toàn không gai hay còn gọi với tên lá viền. Tính trạng chỉ có gai ở ngọn và gai là những đôi tính trạng trong đó chỉ có gai ở ngọn là tính trạng trội (S) và có gai là tính trạng lặn (s). Đều này chứng minh rằng Cayenne là dị hợp tử và tất cả các loại có gai là đồng hợp tử với tính (s). Mặt khác, tính trạng lá viền hay không viền là cặp tính trạng độc lập (P) và cân đối hơn với tính trạng (S) (s). Đồng thời Collins đã chứng minh sự tồn tại của những gen khác, tất cả những gen này hình như là những đôi tính trạng đối với gen „có gai‟. Số lượng trung bình của chồi cuống trên một cây cũng là một đặc trưng di truyền nhưng lại ảnh hưởng ngoại cảnh và sự phát triển sinh trưởng của dứa khi phân hoá hoa tự. Đây là một đặc trưng quan trọng cần theo dõi bởi nó là vật liệu tốt để trồng sau này và dễ xảy ra nhiều biến dị trong quá trình phát triển. Một số biến dị di truyền thường xảy ra ở dứa ảnh hưởng về phương diện kinh tế như: biến dị kéo dài ở quả, với hình dạng dài ra và đường kính bé; biến dị “quả khô” tất cả bộ phận hoa đều không đậu, trừ các lá bắc, và trở thành biến dị “cổ chai” khi cho các bộ phận hoa ở phần trên hoa tự không đậu; hay là những biến dị biểu hiện bằng những lá sinh sôi nảy nở quanh các mắt hay tại mắt (Claude Py và m.A.tisseau, 1993). Tình hình sản xuất và tiêu thụ trong nƣớc và thế giới 2.2.5. 2.2.5.1. Thế giới Theo số liệu thống kê (Anon., 2002) thu thập từ FAO (Food and Agriculture Organisation) của Hoa Kỳ, sản lượng dứa thế giới 1999 - 2001 là 13.527.149 triệu tấn và ước tính sẽ ổn định trong 3 năm. Sản lượng trên thế giới đã tăng gấp 3 lần trong 30 năm qua (3.833.137 năm 1961 đến 13.738.735 năm 2001). Những nước đứng đầu về sản lượng năm 2001 bao gồm Thái Lan (2.300.000 tấn), Philippine (1.571.904 tấn),
9 Brazil (1.442.300 tấn), Trung Quốc (1.284.000 tấn).. Những nước chiếm ưu thế về thị trường dứa tươi (khoảng 670.000 tấn) như Costa Rica, Philippine và Cote d‟Ivoire; về dứa đông lạnh là Thái Lan và Philippine (Rohrbach và ctv, 2003). Mỹ là nước nhập khẩu dứa lớn nhất từ năm 1998 - 2000 bình quân 552597 ngàn USD / năm ở các dạng dứa đóng hộp, tươi và cô đặc. Theo thống kê, sản lượng giống dứa Smooth Cayene chiếm 70 % sản lượng thế giới và hầu hết ở dạng đóng hộp (khoảng 95 %). Tuy nhiên giống này sản xuất ở dạng dứa tươi chất lượng chưa tốt nên đã trở thành áp lực cho các nhà đầu tư đòi hỏi phải cải thiện giống Cayenne để cung cấp dạng tươi tốt hơn (Sanewski and Scott, 2000). Hiện nay, một số nước đang cố gắng phát triển giống Cayenne như Đài Loan, Malaysia, Cuba, Brazil và Pháp. 2.2.5.2. Trong nƣớc Theo số liệu điều tra của viện quy hoạch và thống kê nông nghiệp, diện tích dứa Cayenne năm 2002 là 3.641 ha trồng ở 18 tỉnh, thành phố và con số này đã được gia tăng trong những năm gần đây. Các tỉnh có diện tích dứa Cayenne nhiều như Ninh Bình (700 ha), Nghệ An (695 ha), Hà Tỉnh (438 ha),(Tuấn và Tiến, 2002). Sản lượng dứa tươi sản xuất cả nước theo tổng cục thống kê Nông-Lâm-Ngư dao dộng từ 263 – 316 ngàn tấn / năm trong đó Đồng Bằng Sông Cửu Long chiếm gần 71 %. Nguyên liệu cung cấp cho các nhà máy chế biến đang trong tình trạng cung chưa đủ cầu do sự ra đời của nhiều nhà máy chế biến dứa với công suất cao và kỹ thuật hiện đại như Đồng Giao ở Tiền Giang, An Giang hay nhiều nhà máy nhỏ công suất nhỏ ở Hà Tỉnh, Hồ Chí Minh, Cần Thơ.. Nguyên tắc và ứng dụng của một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di 2.3. truyền nhờ vào chỉ thị (marker) Phƣơng pháp sử dụng các chỉ thị hình thái 2.3.1. Về mặt nguyên tắc, một tính trạng hình thái nào đó do một locus kiểm soát mà sự biểu hiện của nó không bị ảnh hưởng do tác động của môi trường, có thể được dùng làm chỉ thị hình thái trong quá trình chọn lọc (Lê Duy Thành, 2000). Chỉ thị hình thái đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu về đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng khác nhau. Trong đó, có nhiều thành công trên thực vật như: ở
10 dứa, Duval và d‟Eeckenbrugge., (1993) đã phân tích 5 nhóm dứa trồng với 18 tính trạng chất lượng và 27 tính trạng số lượng bao gồm đặc tính thực vật, hoa và trái. Kết quả đã cho thấy sự tương đồng giữa các giống Cayenne, Queen và Pernambuco, trong khi Mordilona và Spanish nằm trong nhóm khác. Ngoài ra ở lúa, Kato và cs., (1928, 1930) bằng chỉ thị hình thái đã chia lúa trồng thành 2 loài phụ Indica và Japonica. Sau này cũng bằng chỉ thị hình thái Morinaga (1954) chia thêm một loài phụ thứ 3, Javanica. Mặc dù chỉ thị hình thái rất tiện lợi, dễ xác định do đo trực tiếp trên kiểu hình nhưng chúng lại có những hạn chế nhất định: ảnh hưởng rất nhiều do tương tác kiểu gen với môi trường, số lượng marker có giới hạn chỉ ở qui mô hình thái và chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Phƣơng pháp sử dụng các chỉ thị izozyme 2.3.2. Isoenzyme hay isozyme là một nhóm enzyme xúc tác cùng một phản ứng, nhưng bị ức chế bởi những phân tử khác nhau do đó có nhiều dạng và hiệu quả xúc tác khác nhau. Isozyme có bản chất protein và là chất đa điện ly, nên trong dung dịch nó ở trạng thái phân cực. Dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử protein khác nhau về kích thước, trọng lượng phân tử, lực tích điện..sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau và sẽ phân bố ở vị trí khác nhau trên gel sau khi điện di. Các phân tử protein enzyme là do gen quy định. Trong quá trình tiến hoá, dưới tác động của môi trường bên ngoài và bên trong cơ thể, các gen biến đổi hình thành các allen khác nhau và nó mã hoá cho quá trình tổng hợp các phân tử protein khác nhau về trong lượng, kích thước, lực tích điện..Vì vậy, dùng phương pháp điện di có thể tách được các loại protein khác nhau. Trong nghiên cứu đa dạng di truyền sự khác nhau của các protein phản ánh sự khác nhau về đặc điểm di truyền giữa các cá thể. Chính vì vậy isozyme được dùng làm marker trong phân tích mức độ đa dạng về di truyền của loài. Phân tích isozyme nhìn chung là phương pháp khả thi, đồng tính trội và tương đối rẻ tiền. Khoảng 90 isozyme đã được sử sụng trên thực vật, với những vị trí (loci) isozyme đang được lập bản đồ trong nhiều lĩnh vực (Tanksley và ctv, 1991). Tuy