Luận văn: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG TRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN

Chia sẻ: Carol123 Carol123 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:73

Thêm vào BST

Báo xấu

151
lượt xem 40
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

-Phân tích đặc điểm hình thái, khối lượng và kích thước hạt của một số giống đậu tương trồng tại Tây Nguyên - Xác định hàm lượng protein, lipit trong hạt của các giống đậu tương nghiên cứu -Phân tích thành phần axit amin trong protein hạt của các giống đậu tương - Xác định hàm lượng protein tan, hoạt động của proteaza ở giai đoạn nảy mầm - Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương ở giai đoạn cây non trong điều kiện hạn nhân tạo - Xác định hàm lượng prolin ở giai đoạn cây non 3 lá ở...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG TRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐINH THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2008
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐINH THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC MÃ SỐ: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS CHU HOÀNG MẬU Thái Nguyên- 2008
M U 1. Lý do ch n tài ut n g (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghi p ng n ngày, có giá tr kinh t và hàm l ng dinh d ng cao. H t ut ng ch a 30 % - 56% protein, ch a nhi u lo i axit amin không thay th (lysin, tryptophan, metionin, cystein, leucin…), 12 %-25% lipit, và các vitamin (B1, B2, C,D, E, K…) c n thi t cho c th n g i và ng v t. M t c tính quan tr ng n a c a cây ut ng là có n t s n r t o kh n ng c nh nit không khí, vì v y tr ng ut ng góp ph n c i t o t và b o v môi tr ng [20]. S n xu t ut ng phát tri n m nh t i M , Brazil, Argentina, Trung Qu c và nhi u n c khác. S n l ng ut ng trên th gi i t hàng tr m tri u t n/ n m. Trong khi ó, Vi t Nam s n l ng m i ch t tr m nghìn t n/ n m, u ó ch ng t tình hình s n xu t ut ng n c ta so v i khu v c v n còn m c th p. thúc ys n xu t ut ng v n quan tr ng là ch n t o c nh ng gi ng không ch cho n ng su t cao, ph m ch t t t mà còn ph i thích h p v i u ki n a hình khí h u. c ta có h sinh thái r t a d ng, khí h u gi a các vùng, mi n l i không gi ng nhau. a hình có n 3/4 là i núi th ng có mùa khô hanh mi n B c, mùa khô nóng Tây Nguyên…Nh ng n m g n ây di n bi n khí h u ngày càng ph c t p, ng m a phân b không u gi a các vùng và gi a các th i k trong n m nên h n hán và n ng nóng kéo dài. ut ng là cây t ng im nc mv i u ki n ngo i c nh và thu c vào nhóm cây ch u h n kém, công tác ch n t o các gi ng ut n g có ki u gen ch ng ch u ngày càng c quan tâm nghiên c u [10], [18], [23]. Vi t Nam, ngu n gen c a cây ut n g r t a d ng và phong phú; ngoài nh ng gi ng nh p n i, gi ng l i t o và gi ng t bi n, còn có t p oàn các gi ng a ph n g. Nh ng gi ng ut ng a ph n g th ng có n ng su t th p, nh ng l i có ch t l ng h t t t và kh n ng ch ng ch u cao v i các u ki n b t l i c a ngo i c nh. c tính ch u nóng, ch u h n c a các gi ng ut ng này ã c nhi u nhà khoa h c quan tâm nghiên c u [18], [24], [31], [36]. Tuy nhiên, các tác gi m i ch t p trung nghiên c u các gi ng ut ng tr ng các t nh trung du, 1
ng b ng và các t nh vùng núi phía B c, trong khi ngu n gen c a cây ut ng các t n h khu v c Tây Nguyên n c ta c ng r t a d ng, có nhi u c tính quý còn ít c quan tâm. Tây Nguyên là vùng t v i hai mùa rõ r t, mùa m a và mùa khô, mùa khô th n g kéo dài gây thi u n c tr m tr n g d n n n n g su t, s n l ng cây tr ng hàng n m gi m m nh trong ó có cây ut ng. Vì v y, vi c ánh giá, tuy n ch n các gi ng ut ng có n ng su t và ch t l ng, có kh n ng ch ng ch u h n cao làm v t li u ch n gi ng là yêu c u th c ti n t ra cho ngành ch n gi ng ut ng vùng t Cao Nguyên này. T nh ng lý do trên chúng tôi ã ti n h ành tài: “Nghiên c u c m hóa sinh và phân l p gen chaperonin liên quan n tính ch u h n c a m t s g i ng ut ng a ph ng tr ng vùng Tây Nguyên” nh m ánh giá ch t l ng h t và tìm hi u gen liên quan n kh n ng ch u h n c a cây ut ng trong i u ki n sinh thái khu v c Tây Nguyên. 2. M c tiêu nghiên c u - So sánh ch t l ng h t c a m t s gi ng u t ng tr ng t i khu v c Tây Nguyên. - Nghiên c u kh n ng ch u h n, c s hóa sinh và phân l p gen liên quan n kh n ng ch u h n c a m t s gi ng ut ng tr n g t i khu v c Tây Nguyên. 3. N i dung nghiên c u - Phân tích c m hình thái, kh i l n g và kích th chtc am ts g i ng ut ng tr n g t i Tây Nguyên. - Xác nh hàm l ng protein, lipit trong h t c a các gi ng u t ng nghiên c u. - Phân tích thành ph n axit amin trong protein h t c a các gi ng ut ng - Xác nh hàm l ng protein tan, ho t c a proteaza giai n h t n y m m. - ánh giá kh n n g ch u h n c a các gi n g ut ng giai n cây non trong i u ki n h n nhân t o. - Xác nh hàm l ng prolin giai o n cây non 3 lá th i m tr c và sau khi x lý b i h n. - Nhân, tách dòng và c trình t gen chaperonin liên quan n tính ch u h n c a m t s gi n g ut n g tr ng t i Tây Nguyên. 2
Ch ng 1 NG QUAN TÀI LI U 1.1. CÂY UT NG 1.1.1. c m sinh h c c a cây ut ng ut n g có tên khoa h c là Glycine max (L) Merrill, có b nhi m s c th 2n = 40, thu c thân th o , h u (Fabaceae), h ph cánh b m (Papilionoidea). ut n g có ngu n g c t các t nh phía B c và ông B c Trung Qu c, các vùng k c n c a C n g hòa liên bang Nga, Tri u Tiên và Nh t B n.Các gi ng ut ng ang tr n g t i n c ta c du nh p t Trung Qu c t lâu i [13]. V hình thái, cây ut n g các b ph n chính là r , thân, lá, hoa và qu R ut ng có r c c g m r cái và r bên, trên b r c a cây ut n g có nhi u n t s n ch a vi khu n Rhizobium japonicum có kh n n g c nh nit t khí tr i cung c p m cho cây, có vai trò c i t o t [9]. Thân ut n g có hình tròn, thân non có màu xanh ho c tím, khi qu chín thì thân ng sang màu vàng nâu. Lá ut ng g m 3 lo i lá: lá m m, lá n và lá kép (có 3 lá chét ôi khi có 4-5 lá chét). Hoa m c thành chùm nách lá, m i chùm hoa có t 10-15 hoa, có màu tr ng ho c tím, hoa ut ng t th ph n hoàn toàn. Qu có th th ng ho c cong có nhi u lông, m i qu ch a t 1-5 h t nh ng thông th ng là 2-3 h t. Ht ut ng không có n i nh m à ch có m t l p v bao quanh phôi và 2 lá m m. H t có hình tròn ho c hình b u d c, tròn dài, tròn d t, v h t ut ng có màu nâu, en, vàng, xanh. Kh i l ng h t r t a d ng t 20-400 mg/h t n c vào th i gian sinh tr ng c a cây ut ng ng i ta chia làm 3 lo i: Gi ng chín s m (75-85 ngày), gi ng chín trung bình (80-100 ngày), và gi ng chín mu n (110-120 ngày). Th i gian sinh tr ng là m t y u t quan tr ng l a ch n cây tr ng luân canh t ng v [28]. 3
1.1.2. Giá tr kinh t c a cây ut ng ut n g là cây tr n g có giá tr kinh t cao, là cây công nghi p , cây th c ph m, v a là cây c i c i t o t. V i u th ng n n gày, tr ng c nhi u v trong m , có th tr ng thu n, tr ng xen, luân canh g i v , tr ng c nhi u vùng sinh thái khác nhau, vì v y sau lúa và ngô, cây ut n g có m t vai trò c bi t quan tr ng trong n n nông nghi p nhi t i. V m t dinh d ng , h t ut ng có thành ph n dinh d ng cao ch a 30- 56% protein, 12-25% lipit và 20% gluxit [20], là ngu n axit amin, vitamin (B1, B2, C, D, E) r t quan tr n g iv i i s n g c a con ng i. Protein ut n g còn có tác d ng h u h i u gi m cholesterol trong máu, gi m thi u n guy c các b nh liên quan n tim m ch, chúng c ng ng n c n s phát tri n các m m ung th , ng n ng a b nh th n, b nh ti u ng, b nh x p x ng..... Trong công nghi p, s n ph m t cây ut ng c s d ng r t a d ng nh dùng tr c ti p h t khô ho c ch bi n thành u ph , ép thành d u ut n g, làm bánh k o, s a u, n c gi i khát, n c ch m ... áp ng nhu c u m trong kh u ph n n hàng ngày c a n g i c ng nh gia súc. nh ng qu c gia phát tri n, ng i ta còn dùng ut n g vào các k ngh khác nh bi n ch cao su nhân t o, m c in, s n, xà phòng, ch t t nhân t o, ch t nhiên li u l ng, d u làm tr n trong k ngh hàng không. Trong tr ng tr t, cây ut ng còn có tác d ng c i t o t, t ng n ng su t các cây tr ng khác. u này có c là do ho t ng c nh N2 c a loài vi khu n Rhizobium c ng sinh trên r cây. Nh kh n ng c nh m n ên sau m i v thu ho ch thành ph n hóa tính c a t tr n g c c i thi n rõ r t, l ng m trong t t ng và khu h vi sinh v t hi u khí trong t ng t ng. Do ó, có l i i v i cây tr ng khác và sau khi thu ho ch toàn b thân lá, r , lá ph l i b m t t v a có tác d ng che ph ch ng xói mòn, v a là ngu n h u c giàu mc it o t. 1.1.3. Tình hình s n xu t ut ng trên th gi i và Vi t Nam Trên th gi i (tính n tháng 4/ 2006), có 78 n c tr ng ut n g v i di n tích là 91,3 tri u h a; n n g su t 22,9 t / ha, s n l ng t 236,1 tri u t n . Các n c s n xu t ut ng ng u th gi i là: M , Brazil, Argentina và Trung Qu c chi m kho ng 90-95% t n g s n l ng ut ng trên toàn th gi i [45]. 4
Nh v y, có th th y ut ng chi m m t v trí quan tr ng trong n n kinh t th gi i không ch do c gieo tr ng trên di n tích l n 78 n c, mà h t ut ng còn c s d ng r ng rãi làm th c ph m và nguyên li u cho công nghi p. B ng 1.1. S n l ng ut ng c a m t s n c trên th gi i niên v 2006 – 2007 (Theo Oil World); n v tính: tri u t n Th gi i 236,1 M 86,8 Brazil 59,0 Argentina 47,2 Paraguay 6,5 Trung Qu c 16,2 n 7,7 Canada 3,5 Ukraine 0,9 Liên bang Nga 0,7 Indonesia 0,8 Vi t Nam 0,3 Thái Lan 0,2 Nigeria 0,4 Các n c khác 0,8 Vi t Nam, trong vòng h n 20 n m qua (t 1985- 2006) di n tích, n ng su t và s n l ng ut n g ã không ng ng t ng, c bi t trong nh ng n m g n ây: th m 2000 di n tích tr ng ut ng là 124100 ha n n m 2005 t n g lên 203600 ha, n n g su t t t 12000 t /ha n m 2000 lên 14,300 t /ha n m 2005 và s nl ng t 147300 t n n m 2000 lên 290600 t n n m 2005 [21]. 5
B ng 1.2: Di n tích, n n g su t, s n l ng ut ng c n c qua các n m (Ngu n: T ng c c Th ng kê, 2006) m 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Ch tiêu Di n tích (1000 ha) 124,1 140,3 158,6 165,6 182,5 203,6 185,8 ng su t (t /ha) 12,0 12,4 13,0 13,3 13,3 14,3 13,9 S nl ng (1000 t n) 149,3 173,7 205,6 219,6 242,1 290,6 186,9 Hi n nay cây ut ng c tr ng c 7 vùng nông nghi p trên c n c, do i u ki n sinh thái c a m i vùng khác nhau nên có s khác bi t khá rõ v di n tích tr ng, n ng su t và s n l n g [21]. B ng 1.3. Di n tích, n ng su t và s n l ng ut ng c a 7 vùng n m 2005 Di n tích ng su t S nl ng a m (1000 ha) (Kg/ha) (1000 t n) Cn c 203,6 1430 291,5 ng b ng Sông H ng 67,3 16000 107,5 Vùng ông B c 48,4 1040 50,2 Vùng Tây B c 25,0 1150 28,7 Vùng B c Trung B 6 ,5 1220 7,9 Tây Nguyên 27,1 1570 42,5 ông Nam B 5 ,3 1060 5,6 ng b ng Sông C u long 21,2 2100 44,5 ng 3.1 cho th y Tây Nguyên là vùng có di n tích tr n g ut ng l n th 3 trong 7 vùng nông nghi p trên c.Cùng v i s ng tr ng a các lo i cây tr ng chính nh cao su, cà phê, h tiêu, ca cao….thì cây ut ng n g ang c chú tr ng và phát tri n trên vùng t này. M c dù, s n l ng ut ng n c ta có t ng nh ng so v i các n c trên th gi i và trong khu v c n ng su t c a ta v n còn th p, và c bi t trong nh ng m g n ây di n tích, n ng su t và s n l ng ut ng c a n c ta gi m i áng 6
k . N m 2005 di n tích t 203600 ha gi m xu n g ch còn 185800 ha n m 2006 và s nl ng gi m t 290600 t n n m 2005 xu ng còn 186900 t n n m 2006. Nguyên nhân chính là do u t th p, ch a có b gi n g phù h p , ch a áp d ng k th t tiên ti n . Vì v y, nghiên c u c i ti n các c m nông sinh h c c a các gi ng a ph ng và t o gi ng m i có n n g su t cao, thích nghi v i u ki n sinh thái nh n g vùng khác nhau b ng ph ng pháp truy n th ng k t h p v i hi n is áp n g c yêu c u c a th c ti n t ra và ó c ng là chi n l c quan tr ng v s phát tri n cây u n c ta. 1.1.4. Thành ph n hóa sinh h t ut ng Trong h t ut n g có các thành ph n ã bi t tính theo t l protein 30- 56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mu i khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, các vitamin A, B1, B2, D, E, F, các men, sáp, nh a, cellulose. Ngoài ra, h t ut ng còn có các axit amin c b n isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin...[20]. Protein là thành ph n ch y u trong h t ut n g. Chúng chi m kho ng 30%-55% kh i l n g khô c a h t. D a vào h s l ng, ng i ta chia protein c a h t ut ng thành 3 lo i: 11S - legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin. Nh ng lo i protein chính trong h t ut ng là: protein d tr (chi m 70% t ng s protein), các enzim, các ch t c ch proteaza và lectin. Thành ph n c a protein g m có albumin (9,5%), globulin tan trong n c (75,8%), globulin ch tan trong NaCl là 3%, glutelin - protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7% [18], [25]. Thành ph n a xit amin c a h t ut ng: Protein c a các lo i u , nh t là ut n g, c xem là protein có ch t l n g t t nh t t rong các lo i protein th c v t. Chúng có ch a t t c các axit amin không thay th . H n n a protein c a cây h u còn có hàm l ng lysin r t cao so v i protein t các lo i ng c c.Tuy v y, hàm l ng các axit amin có ch a g c SH (metionin, cystein) còn th p [8], [40]. Hàm l ng lipit trong ut n g khá cao chi m kho ng 12-25% kh i ng khô, trong ó h àm l ng các axit béo no th p, kho n g 13%, không có cholesterol, 30% là các axit béo ch a no m t n i ô i. L ng axit béo không no c n 7
thi t: axit linoleic 50%, và c bi t có 7% axit anpha linolenic là ngu n cung c p axit béo chu i m ch dài omega 3 quan tr ng cho c th nh DHA (Docosa Hexaenoic Acid) và EPA (Eicosa Pentaenoic Acid ) [44]. Ch t l ng lipit c a h t ut n g r t t t, cho nên nó c s d ng r ng rãi trong công nghi p ch b i n th c ph m. H t ut ng còn có các lo i vitamin tan trong lipit, c bi t là vitamin E = 200 mg/100g lipit [8], ngoài ra trong h t u ng còn ch a m t s ch t khác nh h ydrat cacbon, mu i khoáng, axit nucleic, kích thích sinh tr ng . Tóm l i, h t ut ng có giá tr dinh d n g cao.Trong ó, hàm l ng protein d tr và ch t l ng c a chúng là y u t quy t nh làm cho ut n g tr thành ngu n th c ph m quan tr ng cho ng i và th c n cho gia súc [18]. 1.2. NGHIÊN C U V C TÍNH CH U H N C A CÂY UT NG 1.2.1. Khái ni m v h n và tác ng c a h n n th c v t Hn i v i th c v t là khái ni m dùng ch s thi u n c do môi tr ng gây nên trong su t quá trình hay t ng giai n, làm nh h ng n sinh tr ng và phát tri n c a cây. Thi u n c tr c tiên nh h ng n s cân b ng n c c a cây, t ó nh ng n ch c n n g sinh lý nh quang h p, hô h p d inh d n g khoáng và cu i cùng nh n s sinh tr n g phát tri n c a th c v t. Cây s ch t non ho c gi m s c s n g, gi m n ng su t [19]. Hi n t ng m t n c có th do tác n g s c p, là k t qu c a s thi u n c trong môi tr ng, ho c là tác n g th c p c gây ra b i nhi t th p , s t nóng hay tác ng c a mu i. H n c ng nh y u t n go i c nh b t l i khác khi tác ng lên c th th c v t s gây ra ph n n g c a c th . Tùy theo t ng loài, gi ng mà m c ph n ng c a c th c ng nh thi t h i do khô h n gây ra khác nhau: m t s b ch t, m t s b t n th n g nh ng c n g có m t s khác không b nh ng. Kh n ng th c v t có th gi m thi u m c t n th n g do thi u h t n c gây ra g i là tính ch u h n [19]. 8
Vi t Nam là m t n c có a hình a d ng và di n bi n khí h u ph c t p, l ng a phân b không u gi a các vùng, mi n và gi a các th i k trong n m nên h n hán có th x y ra b t k mùa nào, vùng nào. Di n tích có t i 3/4 lãnh th là i núi, t canh tác c a các khu v c này th ng xuyên b h n nên thành ph n th nh ng c a các vùng khác nhau r t rõ r t. T t c các y u t trên chi ph i m nh m m c n c ng m và kh n ng gi n cc a t. ch ng l i khô h n cây có th gi không b m t c, gi m di n tích lá, rút ng n chu k s ng…Kh n ng duy trì áp su t th m th u n i bào có tác d ng b o v ho c duy trì s c s ng c a t bào ch t khi b m t n c [2]. Có hai lo i h n do môi t ng tác ng là h n t và h n không khí [1], [5]. Tác ng a n lên cây ch y u theo hai h ng chính là: làm t ng nhi t cây và gây m t n c trong cây. N c là y u t gi i h n i v i cây tr ng, v a là s n ph m kh i u v a là s n ph m trung gian và cu i cùng c a các quá trình chuy n hoá sinh h c. N c là môi tr ng các ph n ng trao i ch t x y ra [2]. S tác ng c a h n, gây nên hi n t ng co nguyên sinh và làm cho cây b héo. S co nguyên sinh các t b ào di n ra khi n ng n c trong môi tr n g quá cao hay do h n n c làm cho n c trong t b ào th t thoát ra ngoài nên kh i. H n h án làm gi m m nh quang h p. Khi hàm l ng n c trong lá còn kho ng 40-50% quang h p c a lá s b ình tr c n tr s sinh tr ng c a cây. Nh v y, nh h ng c c oan c a h n b tc giai n sinh tr ng nào c a cây tr ng c ng nh h ng n các y u t c u thành n ng su t và s n l ng cây tr ng. 1.2.2. C s sinh lý, sinh hóa và sinh h c phân t c a tính ch u h n 1.2.2.1. C s sinh lý, sinh hóa c a tính ch u h n Khi g p h n th c v t luôn có nh n g bi n i v m t sinh lý, sinh hóa nh m không m tn c. Có hai c ch b o v th c v t t n t i trên môi tr n g thi u c ó là vai trò c a b r và kh n n g u ch nh áp su t th m th u [2]. Vai trò c a b r : kh n ng thu nh n n c ch y u p h thu c vào b r . tránh m t n c nh ng cây ch u h n th ng có b r kh e, dài, m p, có s c xuyên sâu s hút cn c nh ng n i sâu trong t ho c r lan r ng v i s l ng l n [19]. Th c v t nói chung, và cây ut ng nói riêng, khi giai n cây non th n g ch u tác ng m nh c a h n vì b r ch a phát tri n y còn y u. 9
Kh n ng u ch nh áp su t th m th u (ASTT): là m t c tính quan tr ng c a t bào khi b m t n c do nóng h n. Nh ng th c v t t n t i trên môi tr ng m t cân b ng v áp su t th m th u òi h i ph i có kh n ng ch ng l i u ki n kh c nghi t ó. Trong u ki n khô h n ASTT c u ch nh t ng lên giúp cho t bào thu nh n c nh ng phân t n ct t. B ng c ch nh v y, th c v t có th v t qua c tình tr ng h n c c b . Thông th ng, thi u n c gây r i lo n toàn b ph ng th c chuy n hóa th c v t, làm t ng ho c gi m hàm l ng các ch t chuy n hóa nh : ng lên v hàm ion K+, các lo i ng prolin, n ng ng, axit h u c ...[2], [4], [30]. S t ng h p và tích l y các ch t trên di n ra r t nhanh khi t bào m t n c, các ch t hòa tan s c tích l y nh m ch ng l i vi c gi m m t n c, t n g kh n n g gi n cc a ch t nguyên sinh và chúng có th t ng tác v i lipit ho c p rotein màng ng n ch n s phá h y màng và các ph c protein [24]. Quá trình này liên quan n s bi u hi n c a các gen, hàng lo t các gen ngh c ho t hóa t ng h p t o ra các ch t c n thi t ch ng l i s khô h n [1]. c ta n m trong khu v c nhi t i gió mùa h n là y u t t ng xuyên tác ng gây nh h ng n sinh tr n g, phát tri n c a cây tr ng, nh h ng x u n ng su t và ph m ch t c a chúng. Vì v y, vi c nghiên c u các c ch ch u h n s là c s cho vi c c i thi n gi ng c n g nh t o ra c các gi ng có tính ch ng ch u. Khi nghiên c u v kh n ng ch ng ch u c a các cây tr ng l y h t ng i ta th c hi n theo nhi u h n g khác nhau: phân tích hóa sinh trong h t n y m m nghiên c u a d ng enzym - amylaza và proteaza hàm l ng protein tan, thành ph n axit amim, prolin... Các proteaza óng vai trò quan tr ng trong c th s ng và nh t là trong th i k n y m m c a h t. Chúng r t a d ng. Thành ph n ph c t p c a các proteaza h t c t o ra b i s a d ng ch c n ng do chúng m nhi m trong th i k n y m m. Proteaza nói chung không ch tham gia vào phân gi i protein d tr trong h t, nh m cung c p các axit amin cho th i k phát tri n u tiên c a cây mà chúng còn tham gia vào quá trình vi x lý phân t protein. Proteaza tham gia vào phân gi i các protein l 10
ho c b bi n tính khi g p u ki n c c oan (l nh, m n, h n, tác ng c h c...) [18]. Tr n Th Ph ng Liên (1999) khi nghiên c u so sánh ph n di ho t tính proteaza c a các gi ng ut ng ch u nóng ch u h n khác nhau ã nh n xét r ng. Proteaza trong quá trình h t n y m m c a h t t t c các gi ng ut n g nghiên c u r t a d ng, có ho t tính cao, có kh n ng phân gi i hoàn toàn protein d tr t o nguyên li u t ng h p protein cho c th m i. X lý nhi t cao ch nh h ng n ho t tính proteaza m t s gi ng ch u h n, không nh h ng n gi ng ch u nóng [18]. Nguy n Th Kim Dung (2003) nghiên c u s bi n ng ho t proteaza giai o n h t n y m m c a các gi ng l c ã rút ra k t lu n, ho t c a proteaza trong giai o n h t n y m m có xu h n g t ng t 1 n 5 ngày tu i, sau ó gi m t 7 n 9 ngày tu i [6]. C ng theo h ng nghiên c u này Nguy n Th Thu Ngà (2007), cho r ng các giai n h t n y m m làm bi n i ho t c a proteaza và hàm l ng protein tan. S bi n i này tuân theo quy lu t chung : t ng các giai nt 3 n 7 ngày tu i, b t u gi m giai n 9 ngày tu i, hàm l ng protein tan và ho t p roteaza có m i t n g quan thu n ch t ch [29]. Nh n g thay i hóa sinh khác do h n gây ra c ng c nhi u tác gi quan tâm nghiên c u: nh s thay i h àm l n g prolin khi cây g p h n. Prolin là m t axit amin có vai trò quan tr ng trong s u hòa ASTT trong t bào, n g th i là m t axit amin a n c có kh n n g gi và l y n c cho t bào, ng n ch n s xâm nh p c a ion Na+ t ng tác v i protein màng, ng n ch n s phá h y c a màng và các ph c protein khác. Các k t qu nghiên c u u cho th y khi cây tr ng g p h n thì cây gi m t ng h p protein và t n g t ng h p prolin [26], [28]. Soulages và cs (2003) ã ch ng minh ngoài vai trò t ng c ng kh n ng ch u h n thì chu i axit amin L – Prolin nhóm II còn có kh n n g ch n g l i các tác ng b t l i c a nhi t i v i cây ut ng [ 38]. Theo inh Th Phòng (2001), lúa khi gây h n sinh lý b ng dung d ch sorbitol 5% hàm l ng prolin c a các dòng ch n l c t ng lên v t xa so v i i ch ng, s t ng hàm l ng prolin liên quan n kh ng ch u h n [30]. Kh o sát ch t l n g h t và kh n ng ch u h n c a m t s gi ng lúa c n a ph ng vùng núi phía B c, Chu Hoàng M u và cs ( 2005) ã nh n xét, 11
kh n ng ch u h n c a các gi ng lúa c n có liên quan n hàm l ng protein và hàm ng prolin. Khi g p h n, cây lúa c n gi m hàm l ng protein và t ng hàm l ng prolin [24]. Nguy n Th Thúy H ng ( 2006), khi nghiên c u v kh n ng ch u h n c a các gi ng ut ng a ph ng c a T nh S n La c ng ã nh n xét r ng: khi g p h n các gi ng ut ng có s gi m t ng h p protein và t ng c ng t ng h p prolin [26 ]. 1.2.2. C s phân t c a tính ch u h n Kh n ng ch ng ch u c a sinh v t nói chung và c a th c v t nói riêng liên quan n c u trúc, ch c n n g c a các thành ph n trong t b ào và các quá trình x y ra trong m i vùng liên quan n kh n n g ch u n óng, ch u h n , m n , phèn c a th c v t. Ph n ng c a th c v t tr c nh n g tác ng: nóng, h n r t a d ng nó ph thu c vào nhi u y u t khác nhau, trong ó có ki u gen, dài và tính kh c li t c a i u ki n n go i c nh. Bi u h i n c a quá trình này là vi c sinh t n g h p m t lo t các ch t trong t bào, m t s hormon ho c ch t kích thích giúp cho cây có kh n ng thích ng. Khi i sâu vào nghiên c u mc phân t c a hi n t ng nóng h n th c v t ng i ta ã có nh n g b c ti p c n khác nhau trên nhi u loài cây tr n g các giai o n phát tri n khác nhau. c n ghiên c u nhi u nh t là các protein s n ph m bi u hi n gen [19]. Nhóm các protein c c bi t quan tâm bao g m: protein s c nhi t, môi gi i phân t , LEA... Protein s c nhi t (heat shock protein- HSP): HSP có h u h t các loài th c v t nh : lúa mì, m ch, lúa g o, ngô, u nành, hành, t i…. chúng chi m kho ng 1% protein t n g s trong lá c a các loài th c v t n ày. HSP c t ng h p khi t bào g p i u ki n c c oan nh : h n, nhi t cao, mu i cao. S xu t hi n c a HSP có ch c n ng ng n c n ho c s a ch a s phá y d o stress nóng và m r ng giá tr ng ng v i s ch ng ch u nhi t cao. Trong các t bào th c v t HSP t bào ch t t p trung thành các h t s c nhi t (HSG-Heat Shock Granules). Ng i ta cho r ng các HSP g n k t trên các ARN polymeraza ng n c n s phiên mã t ng h p m ARN trong quá trình b stress nóng. Sau s c nóng các h t này phân tán và liên k t dày c v i các ribôxôm ho t n g sinh t n g h p protein [19]. 12
HSP có th chia làm 6 nhóm d a trên c s kh i l ng phân t khác nhau: 110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa. Trong ó có nhóm HSP70 và HSP 60 có nhi u i di n c a ch t môi gi i phân t (g i l à chaperonin) HSP 8,5 kDa (Ubiquitin) có ch c ng b o v cho t b ào nh n g không ph i là môi gi i phân t . Ubiquitin có ho t tính proteaza v i ch c n ng phân gi i các protein không có ho t tính enzym. Ubiquitin có MW r t th p, ít ch u nh h ng c a nhi t nên có vai trò t s a ch a c a t bào khi g p y u t c c oan, c bi t là nhi t cao [19]. Môi gi i phân t (MGPT): MGPT là m t nhóm g m n hóm g m nhi u lo i protein khác nhau, nh ng chúng u có ch c n n g tham gia t o c u trúc không gian úng cho protein trong t b ào. Ph n l n các ch t MGPT có ho t tính ATP-aza, có ch c n ng: (1) Gi n nh chu i polypeptit khi ang t ng h p và t o c u trúc không gian úng cho chúng, (2) T o l i c u trúc không gian c a protein sau khi v n chuy n qua màng t bào, (3) L p ráp các chu i polipeptit vào ph c t o c u trúc b c 4, (4) MGPT c t ng c ng nh quá trình t ng h p trong u ki n c c oan do nhu c u c p thi t c a t bào, nh t là s c nhi t. MGPT có th chia thành m t s nhóm nh sau: HSP 70 là nhóm MGPT có ho t tính ATP-aza và có tính b o th cao. Trong i u ki n c c o an HSP có th n g n ch n s co c m và k t t protein. HSP 60 (chaperonin) là lo i p rotein c u t o t các ti u n v có kh i l ng 60 kDa và c ng có ho t tính ATP-aza [24]. H CCT: Chaperonin c a t bào ch t, còn g i là chaperonin ch a polypeptit- l c a ph c t (CCT), hay còn g i là ph c vòng ch a polypeptit-l c a ph c t (TriC) là m t nhóm môi gi i phân t m i. Chúng giúp cho vi c t o c u trúc không gian úng c a protein trong khung t bào actin và tubulin trong t bào ch t. Chúng óng vai trò quan tr n g trong qua trình hình thành thoi vô s c c a giai n phân bào, c bi t là th i k p hát tri n m m t h t. Chaperonin t bào ch t là m t ph c có kh i n v có tên là α, , , , , , , ng phân t kho n g 90 kDa bao g m 8 ti u (t ng ng v i CCT1- CCT8) và hình thành nên c u trúc vòng bi kép [16]. Trong d ch chi t t bào các ti u n v trong c u trúc không gian c a vòng bi có vai trò r t 13
quan tr ng g n c ch t. Ch c n n g này g n li n v i s có m t c a 4 ti u nv: CCTα . Vì quá trình t o c u trúc không gian trong CCT không có s tham gia c a protein d ng GroES, nên c ch t p rotein c gi l i trong kh i hình tr nh c ch óng m c bi t theo ki u b c thang c a các vùng CCT. Ngoài CCT còn có hai nhóm nhân t cùng tác ng A và B tham gia vào c u trúc không gian úng c a protein. Trong ó nhóm nhân t A không óng vai trò trong công vi c u ch nh ho t tính c a CCT. Nó không tham gia t ng tác v i CCT nh ng l i tham gia vào t o c u trúc không gian úng c a p rotein khi gi i phóng ra kh i CCT [18]. Các nhóm HSP 100, HSP 90 u có tính b o th cao và có ho t tính ATP- aza. M t s tìm th y trong t bào bình th ng, nh ng ph n l n chúng sinh ra khi g p các u ki n ngo i c nh b t l i nh h n , nóng, l nh. Ch c n ng chính c a chúng là ng n ch n s co c m c a protein và tái ho t h oá các protein bi n tính [19]. 1.2.3. Nghiên c u v tính ch u h n cây ut ng Trong các cây tr ng l y h t thì cây ut ng có nhu c u v n c cao h n các lo i cây khác. ó chính là do trong h t và cây ut ng có hàm l ng protein và lipit r t cao, t n g h p 1kg ch t khô c n 500 - 530 kg n c. Trong quá trình n y m m thì nhu c u v n cc a ut ng c ng khá cao 50%, trong khi ó n gô ch là 30%, lúa là 26% [20 ]. Nghiên c u v các c tính ch u h n c a cây ut n g v ph n g di n sinh lý và di truy n ã cho th y r ng, các c tính này liên quan ch t ch n c m hoá keo c a n guyên sinh ch t, c m c a quá trình trao i ch t. Tính ch u h n c a cây ut ng là tính tr ng a gen. Chúng th hi n nhi u khía c nh khác nhau nh : v s phát tri n c a b r , tính chín s m t ng i, c ng nh b n ch t di truy n c a t ng gi n g có kh n n g s d ng n c ti t ki m trong quá trình sinh tr ng và phát tri n c a cây. n c vào c m n ày, ut ng c chia thành hai nhóm [18]. - Nhóm ch u cs m tn c trong t n g giai n phát tri n c a cây. - Nhóm ch u c s thi u n c trong t t c giai n phát tri n c a cây. 14
giai n cây con khi g p h n, ut n g có th d v t qua h n, còn nh ng giai n sau nh giai o n ra hoa, k t qu , h t chín s a mà g p h n thì s dn n n ng su t gi m áng k . Trong nh ng n m g n ây các nhà khoa h c ã có nhi u thành công khi nghiên c u sâu h n v tính ch u h n c a cây ut ng. Maitra và Cushman (1994) ã phân l p c cDNA c a dehydrin t lá u ng khi b m t n c, ngoài ra các tác gi còn phân l p c cDNA c a LEA nhóm D - 95 t lá và r cây ut ng khi b h n [36]. Jinn và các tác gi khác (1997) nghiên c u v sHSP nhóm 1 (15-18 kDa) ã nh n th y, chúng t ng lên l ng l n trong m m ut ng d i tác ng c a nhi t c tìm th y c u trúc d ng h t trong nguyên sinh ch t và trong nhân cùng v i protein b bi n tính.[35]. m 2004, nhóm nghiên c u g m Huang và cs c a Tr ng ihcT nhiên và K thu t Pingtung, ài Loan, ã phân l p c gen P5CS ut ng t mARN v i kích th c 2148bp [45]. Gen P5CS là nhân t gi i h n cho nh p t ng h p proline th c v t trong u ki n b t l i do h n và do m n gây nên [39]. Nghiên c u c a Porcel và Cs (2005), ã ch ra r ng, gen mã hoá protein dehydrin (LEA-DII) có vai trò v i kh n ng ch ng ch u c a ut ng. Vi t Nam ã có m t s công trình nghiên c u phân l p các gen liên quan n kh n ng ch u nóng, ch u h n c a cây ut ng. Nghiên c u phân l p và c trình t gen chaperonin t gi n g ut n g ch u nh Bonminori- Nh t n v i kích th c phân t 1 ,6 kb c a Nông V n i và cs (1997) [12]. Nghiên c u c a Tr n Th Ph n g Liên (1999) ã phân l p, xác nh trình t gen chaperonin t bào ch t CCT t gi n g ut ng t b i n M103 v i kích th c 1602 bp mã hóa cho 533 axit amin. Trình t gen này có s thay i axit amin 3 v trí 99 (Ser Thr), 280 (Ser Gly) và 308 ( Ser Ala), s thay i này tuân theo quy lu t t ng kh n ng ch u nhi t. Tác gi kh ng nh s thay i này là c n c lý gi i kh n n g ch u nóng c a gi ng t bi n M103 [18]. Tr n Th Ph ng Liên và cs (2003), ã phân l p c gen chaperonin CCTδ t gi n g ut ng a ph n g ch u n Cúc Vàng, gen này g m 15
1602 nucleotit mã hóa cho 533 axit amin [17]. Nguy n Th Thu Hi n (2005), phân lp c gen dehydrin v i kích th c 751bp liên quan n kh n ng ch u h n t hai gi ng ut ng vàng M ng Kh ng và Cao B n g 4 [11]. 1.3. NH N XÉT CHUNG 1.3.1. ut ng là cây tr n g có giá tr kinh t cao, là cây công nghi p, cây th c ph m, v a là cây c i c i t o t. c tr ng ph b i n nhi u qu c gia trên th gi i. Vi t Nam, cây ut ng chi m m t v trí quan tr ng trong n n nông nghi p. Trong nh ng n m g n ây n ng su t và s n l ng ut ng tuy có s t ng áng k , nh ng so v i các n c trên th gi i n n g su t c a các gi ng ut ng c ta còn m c th p . 1.3.2.Trong h t ut ng có các thành ph n ã bi t tính theo t l protein 30-56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mu i khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F….Trong ó, hàm l n g protein d tr và ch t l ng c a chúng là y u t quy t nh làm cho ut ng tr thành ngu n th c p h m quan tr ng cho ng i và th c n cho gia súc. 1.3.3. ut ng là lo i cây có nhu c u v n c cao h n các lo i cây tr ng khác, thu c vào nhóm ch u h n kém. H n ã nh h ng l n n quá trình sinh tr ng, phát tri n c a cây ut ng và làm gi m n ng su t, ch t l ng. Nghiên c u v tính ch u h n c a cây ut ng ng i ta th c hi n theo nhi u h ng khác nhau: phân tích hóa sinh trong h t n y m m nghiên c u a d ng enzym - amylaza và proteaza hàm ng protein tan, thành ph n axit amin... i sâu vào nghiên c u mc phân t , c nghiên c u nhi u nh t là các protein s n ph m bi u hi n gen. Nhóm các protein c c bi t quan tâm bao g m: protein s c nhi t, môi gi i phân t , LEA... 1.3.4. Trên th gi i ã thành công trong vi c nghiên c u gen mã hóa protein ut n g và các trình t gen này ã c công b trên ngân hàng gen th gi i. T i Vi t Nam, ã có m t s tác gi n ghiên c u v tính ch u h n và ã phân l p, gi i trình t gen liên quan n tính ch u h n c a cây ut ng, trong ó có chaperonin trên các gi ng ut ng khác nhau. Tuy nhiên, vi c nghiên c u các gi ng u ng a ph n g c a các t nh khu v c Tây Nguyên còn ít c quan tâm chú ý. 16
Ch ng 2 NGUYÊN LI U VÀ PH N G PHÁP NGHIÊN C U 2.1. NGUYÊN LI U 2.1.1. Nguyên li u th c v t Các gi n g ut ng a ph n g: Az m pa- Gia Lai (AZP), Sa Th y - Kon Tum (ST), Ch mnga- k L k (CNg) do Trung tâm Tài nguyên Di truy n th c v t - Vi n Khoa h c Nông nghi p Vi t Nam cung c p. Gi n g a ph n g Duy Linh- Lâm ng (DL) và gi ng i ch n g HN9 do Trung tâm Khuy n Nông t nh k L k cung c p. B ng 2.1. Ngu n g c c a các gi ng ut ng nghiên c u TT Tên gi ng Ký hi u Ngu n g c 1 Duy Linh DL Gi ng a ph n g, Duy linh- Lâm ng 2 Sa Th y ST Gi ng a ph n g, Sa Th y- Kon Tum 3 mnga CNg Gi ng a ph n g, Ch mnga- kL k 4 HN9 HN9 Gi ng i trà c tr n g ph b i n huy n Buôn ôn- kl k 5 Az mpa AZP Gi ng a ph n g, Az mpa- Gia Lai 2.1.2. Hóa ch t, thi t b và a m nghiên c u Hóa ch t: dùng cho các thí nghi m phân tích hoá sinh và sinh h c h c phân t : g m các lo i hoá ch t mua c a các hãng Anh, c, M , Trung Qu c: EDTA, CTAB, TAE, Agarose… Các hóa ch t thông d ng khác: axit citric, NaOH, NaCl, CH3COONa, ethanol (70%, 100%), tris HCl 1M, chloroform, isoamyl alcohol, isopropanol, n c kh ion, NaH2PO4, Fe2( SO4), K3Fe( CN)6, CuSO4, ninhydrin… Thi t b : Các thi t b chính c s d ng phân tích hoá sinh và sinh h c phân t g m : - Máy quang ph UV-Vis Cintra 40 (Australia) - Máy i n di + b n gu n PowerPac 300 (Bio-Rad, M ) 17
- Máy phân tích axit amin t ng - HP amino Quan SeriesII (Hewlett Parkard, M ) - Máy phân tích trình t gen ABI 3100 Genetic Analyzer (M ) -B n nhi t (Techne, OSI, Anh) - Pipetman các lo i (Gilson, Pháp) - T s y (Anh) - Cân i n t (Thu S ) - T l nh sâu – 850C (Sanyo, Nh t B n ) - N i kh trùng (Tomy- Nh t) - Máy PCR (ABI System, M ) - Máy soi ADN (Bio-Rad, M ) - Máy li tâm l nh ( c) - Máy khu y tr n Voltex ( c) - Máy o p H (Metter Toledo, Th y S ) a m nghiên c u: Các thí nghi m c th c hi n t i Phòng thí nghi m Di truy n h c và Công ngh gen, Khoa Sinh- KTNN, Tr ng i h c S ph m - i h c Thái Nguyên. Các phân tích axit amin t ng và xác nh trình t gen c th c hi n t i Phòng thí nghi m tr n g m Công ngh gen, Vi n Công ngh sinh h c, Vi n Khoa h c và Công ngh Viêt Nam. 2.2. PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1..Ph ng pháp hoá sinh 2.2.1.1. Phân tích hóa sinh giai n h t ti m sinh (1) Xác nh hàm l ng lipit D a vào tính ch t hoà tan c a lipit trong dung môi h u c chi t rút, dung môi h u c c s d ng là petroleum ether [24]. M u em s y khô, bóc v , nghi n m n. Cân 0,05g m u cho vào m i ng Eppendorf (3 ng Eppendorf / m u). Ti p theo, cho 1,5ml petroleum ether vào m i ng n l nh 4oC trong 24 gi , em ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 ng, l c o u, 700C phút, b d ch, l p l i thí nghi m 3 l n. Sau ó, s y khô m u còn l i trong epp n khi kh i l ng không i r i cân m u. Hàm l ng lipit c tính theo công th c: 18