Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB TRÊN THỎ part 1

Chia sẻ: Asdfadf Adgsg | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

94
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Độc tố verotoxin VT2eB do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu và tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta. Do vậy các nghiên cứu nhằm tạo ra vaccin phòng bệnh phù đầu trên heo đang nhận được sự quan tâm rất lớn, mở ra nhiều triển vọng cho ngành chăn nuôi heo nước ta.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB TRÊN THỎ part 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP N G H I ÊN C Ứ U Đ ÁP Ứ NG M IỄ N D Ị CH ĐỐ I VỚ I P RO TE I N TÁ I TỔ H Ợ P M BP - V T2e B TR Ê N T H Ỏ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện : PHAN LÊ MAI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8-2005
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP N G H I ÊN C Ứ U Đ ÁP Ứ NG M IỄ N D Ị CH ĐỐ I VỚ I P RO TE I N TÁ I TỔ H Ợ P M BP - V T2e B TR Ê N T H Ỏ Giáo Viên Hướng Dẫn: Sinh Viên Thực Hiện: TSKH NGUYỂN NGỌC HẢI PHAN LÊ MAI PGS.TSKH NGUYỄN LÊ TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8-2005
LỜI CẢM ƠN Con luôn nhớ ơn ba mẹ sinh thành, dưỡng dục và tạo mọi điều kiện cho con tự hoàn thiện mình, cảm ơn sự quan tâm, động vịên của mọi người trong gia đình. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, người Thầy đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận. Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang, người Thầy, người bác đã dạy bảo con rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp con hoàn thành khoá luận. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thạc sỹ Nguyễn Kim Dung, người Thầy đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, chị Đỗ Thị Châm, chị Lạc Ngọc Thêm, chị Võ Thị Mỹ Duyên, chị Dương Ngọc Diễm, chị Doãn Thị Sim, Thầy Lưu Đức Lợi, anh Nguyễn Văn Thương đã tận tình giúp đỡ chỉ bảo em trong suốt thời gian thực tập khoá luận tốt nghiệp. Cảm ơn các bạn bè thân yêu của lớp DH01SH đã san sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iii
TÓM TẮT PHAN LÊ MAI, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP- VT2eB TRÊN THỎ”. Hội đồng hướng dẫn: TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang Độc tố verotoxin VT2eB do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu và tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta. Do vậy các nghiên cứu nhằm tạo ra vaccin phòng bệnh phù đầu trên heo đang nhận được sự quan tâm rất lớn, mở ra nhiều triển vọng cho ngành chăn nuôi heo nước ta. Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra được chủng E. coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch được protein này. Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ” nhằm xác định khả năng ứng dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù đầu do E. coli gây ra trên heo . Chúng tôi sử dụng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) để đánh giá sự xuất hiện của kháng thể và phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố verotoxin. Những kết quả đạt được sau 7 tháng nghiên cứu: - Cả hai quy trình gây miễn dịch dài ngày và ngắn ngày đều tạo kháng thể kháng MBP-VT2eB có hiệu quả. - Protein MBP-VT2eB có khả năng kích ứng đáp ứng miễn dịch trên thỏ tạo kháng thể trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero. - Kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có khả năng trung hoà độc tố VT2e (gây bệnh phù đầu trên heo). iv
MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. iii TÓM TẮT ....................................................................................................................iv MỤC LỤC .....................................................................................................................v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH ..........................................................................................xi DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ xii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ...................................................................................... xiii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ..................................................................................xiv PHẦN 1: MỞ ĐẦU .......................................................................................................1 1.1. Mở đầu ..............................................................................................................1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu .........................................................................................1 1.2.1. Mục tiêu.....................................................................................................1 1.2.2. Yêu cầu......................................................................................................2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................3 2.1. Kháng nguyên...................................................................................................3 2.2. Kháng thể ..........................................................................................................3 2.2.1. Chuỗi nhẹ (L) ............................................................................................4 2.2.2. Chuỗi nặng (H) ..........................................................................................4 2.3. Đáp ứng miễn dịch ...........................................................................................5 2.3.1. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc kháng nguyên lần đầu ............................6 2.3.2. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc lại kháng nguyên những lần tiếp theo....6 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch ..........................................7 2.4. Cơ chế miễn dịch dịch thể .............................................................................10 2.5. Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB ....................................................................15 2.6. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony)...................................................................15 2.6.1. Sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể ............................................15 2.6.2. Phản ứng kết tủa theo kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) ......................................17 v
2.7. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero .................18 2.7.1. Sơ lược về tế bào vero .............................................................................18 2.7.2. Độc tố VT2e ............................................................................................19 2.7.3. Nguyên tắc của phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero ....................................................................20 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ...............................21 3.1. Thời gian và địa điểm ....................................................................................21 3.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................21 3.3. Vật liệu và hoá chất........................................................................................21 3.3.1. Thú thí nghiệm .......................................................................................21 3.3.2. Vật liệu và hoá chất ................................................................................21 3.3.3. Môi trường ..............................................................................................22 3.3.4. Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................22 3.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22 3.4.1. Bố trí thí nghiệm .....................................................................................22 3.4.2. Chuẩn bị dịch tiêm .................................................................................24 3.4.3. Thu nhận kháng huyết thanh ..................................................................24 3.4.4. Xử lý kháng huyết thanh ........................................................................24 3.4.4.1. Tách kháng thể với ammonium sulfate bão hoà 100%S ........ 24 3.4.4.2. Hòa tan kháng thể ...................................................................25 3.5. Đánh giá .........................................................................................................27 3.5.1. Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) .....................................................................................................27 3.5.2. Định lượng: phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero ........................................................................................................ 28 3.5.2.1. Xác định liều TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50) .....28 3.5.2.2. Thử phản ứng trung hoà độc tố ................................................ 31 vi
3.6. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................ 33 3.7. Đánh giá kết quả và xử lý số liệu .................................................................33 PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................34 4.1. Xác định kháng thể đặc hiệu với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB bằng kỹ thuật Ouchterlony .................................................................................................. 34 4.1.1. Xác định quy trình thực hiện phản ứng ..................................................34 4.1.2. Đánh giá kết quả gây miễn dịch theo các quy trình ngắn ngày và dài ngày ......................................................................................35 4.1.2.1. Quy trình ngắn ngày ......................................................................35 4.1.2.2. Quy trình dài ngày .........................................................................36 4.1.3. Nhận xét...................................................................................................38 4.2. Xác định liều TCID50 ....................................................................................41 4.3. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero ................42 4.3.1. Kiểm tra độ an toàn của kháng huyết thanh đối với tế bào vero ..............42 4.3.1.1. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 và tế bào vero .......................43 4.3.1.2. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 và có bất hoạt .......................43 4.3.1.3. Thí nghiệm đánh giá tác động của NaN3 .............................................................. 44 4.3.1.4. Kháng huyết thanh không bổ sung NaN3 và có bất hoạt .................44 4.3.2. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero ..................46 4.3.2.1. Quy trình dài ngày ...........................................................................47 4.3.2.2. Quy trình ngắn ngày ........................................................................50 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................53 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................54 PHỤ LỤC ................................................................................................................56 vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ag Antigen Kháng nguyên ATCC American Type Culture Tổ chức sưu tầm nhân Collection giống Mỹ DAG Diacylglycerol DMEM Dulbeccos Minimal Essential Medium TCID50 Tissue culture infectious dose 50 EDTA Ethyllene diamine tetra acetic acid FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh bào thai bê Gb4 Globotetraosyl ceramide Ig Immunoglobulin Globulin miễn dịch IL2 Interleukin 2 IL4 Interleukin 4 IL5 Interleukin 5 IL6 Interleukin 6 IP3 Inositol triphosphate LB Lubria – Bertani MAF Macrophage activating Yếu tố có tác dụng hoạt factor hoá đại thực bào MBP Maltose binding protein MHC class II antigens Major histocompatibility Các kháng nguyên phù hợp complex class II antigens tổ chức chính lớp II MIF Macrophage inhibitation factor MWCBs Manufacturer's working Ngân hàng tế bào đang làm cells bank việc PCR Polymerase chain reaction viii
PBS Phosphate buffer stalin SLT Shiga-like toxin TC Cytotoxic T cell Tế bào lympho T gây độc TDTH Delayed type Tế bào lympho T gây quá hypersensitivity T cell mẫn muộn TI Inducer T cell Tế bào lympho T cảm ứng TH Helper T cell Tế bào lympho T giúp Vero Vervet Monkey Origin VT Verotoxin VT2e (SLT-IIv) SLT-II variant Độc tố Shiga-like toxin IIv VT2eB VT2e subunit B Tiểu đơn vị B của VT2e ix
DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Cấu trúc kháng thể ................................................................................5 Hình 2.1: Đáp ứng miễn dịch của thú đối với 2 lần tiêm kháng nguyên được Hình 2.2: phản ảnh qua mức độ kháng thể trong kháng huyết thanh ...................7 Quá trình biệt hoá và phân chia của tế bào lympho B ........................11 Hình 2.3: Các quá trình diễn ra khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể trên bề Hình 2.4: mặt tế bào lympho B............................................................................12 Sự kết hợp giữa tế bào lympho TH và tế bào lympho B......................13 Hình 2.5: Tế bào lympho B xử lý và trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho Hình 2.6: TH ........................................................................................................13 Tác động của các interleukin ở các giai đoạn khác nhau trong tiến trình Hình 2.7: đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho B đối với kháng nguyên .........14 Hiện tượng hai kháng nguyên: đồng nhất (A), không đồng nhất (B), Hình 2.8: đồng nhất một phần (C) được phát hiện bằng phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch ................................................................................18 Bao thẩm tích ......................................................................................26 Hình 3.1: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) ..27 Hình 3.2: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc Hình 4.1: lại 1) ....................................................................................................34 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (mũi nhắc Hình 4.2: lại 1) ....................................................................................................35 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (mũi nhắc Hình 4.3: lại 2) ....................................................................................................36 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (đối chứng Hình 4.4: + kháng huyết thanh) ..........................................................................36 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (đối chứng Hình 4.5: + kháng huyết thanh) ..........................................................................36 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc Hình 4.6: x