Luận văn : Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của ba giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens part 3

Chia sẻ: Pkjd Opiuj | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

116
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sau khi bảo hòa qua đêm, hạt tiếp tục được khử trùng bằng HgCl2 0,1% có vài giọt Tween 20 (thực hiện 2 lần mỗi lần 5 phút). Sau đó những hạt nứt nanh được bóc vỏ trong đều kiện vô trùng và cấy vào môi trường nảy mầm MSG (phụ lục 1) và nuôi ở nhiệt độ 28 290C, độ ẩm tương đối bằng 50%. Sau 5-7 ngày ta loại bỏ những keo bị tạp nhiễm, chọn những cây không bị tạp nhiễm làm nguồn vật liệu thí nghiệm. Từ cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của ba giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens part 3

19 Sau khi bảo hòa qua đêm, hạt tiếp tục được khử trùng bằng HgCl2 0,1% có vài giọt Tween 20 (thực hiện 2 lần mỗi lần 5 phút). Sau đó những hạt nứt nanh được bóc vỏ trong đều kiện vô trùng và cấy vào môi trường nảy mầm MSG (phụ lục 1) và nuôi ở nhiệt độ 28 - 290C, độ ẩm tương đối bằng 50%. Sau 5-7 ngày ta loại bỏ những keo bị tạp nhiễm, chọn những cây không bị tạp nhiễm làm nguồn vật liệu thí nghiệm. Từ cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi đã được nuôi cấy, các trụ hạ diệp được cắt thành những đoạn dài khoảng 0,5 cm dùng làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển nạp gen. Hình 3.1. Hạt bông vải sau khi tách vỏ và cấy vào môi trường nảy mầm Hình 3.2. Cây mần in vitro 5 ngày tuổi.
20 3.4.2. Quy trình chuyển nạp gen 3.4.2.1. Nguồn plasmid Nguồn plasmid được sử dụng để nghiên cứu là vector pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi (phosphomannose isomerase) giúp tế bào vi khuẩn biến dưỡng đường mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (Hoekema và ctv, 1983). Hình 3.3. Sơ đồ vector pManCa mang gen pmi và gen gus 3.4.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vector pManCa từ ống tồn trữ trong glycerol (50%, v/v) ở nhiệt độ -800C được nuôi cấy trên môi trường đặc ABG (Chilton và ctv, 1974) có 50 mg/l kanamycin và ủ ở 280C trong 72 giờ. Trên môi trường đặc ABG (phụ lục 4) chọn một khuẩn lạc phát triển tốt đem nuôi cấy trong 3ml môi trường lỏng YEP (An và ctv, 1988) có bổ sung 50mg/l kanamycin và nuôi qua đêm (24-28 giờ) ở 280C trên máy lắc với tốc độ 200vòng/phút. Sau khi nuôi cấy 24-28 giờ, cấy chuyền sang 50 ml môi trường YEP (phụ lục 5) có kanamycin 50mg/l và nuôi cấy khoảng 16- 18 giờ ở 280C, lắc 200 vòng/phút đến khi OD600 đạt khoảng 0,5 - 1. 3.4.2.3. Lây nhiễm (đồng nuôi cấy) Chủ yếu dựa theo quy trình của Chen và ctv, 2000 (US Patent số: WO 00/77230 A1) với một vài thay đổi: OD600 pha loãng là 0,5, thời gian ngâm mẫu trong dịch vi khuẩn là 30 phút và lây nhiễm trên môi trường không có giấy thấm (Chen và ctv tiến hành thí nghiệm với OD600 pha loãng là 0,3, thời gian 5 phút và lây nhiễm trên môi trường có giấy thấm).
21 Vi khuẩn sau khi chuẩn bị được đem li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau khi li tâm, phần lắng được pha loãng bằng môi trường lây nhiễm không có phytagel (có bổ sung AS) và lắc với tốc độ 220 vòng/phút ở 280C trong 1giờ để chuẩn bị cho lây nhiễm. Từ cây mầm in vitro đã được chuẩn bị ta cắt lấy đoạn trụ hạ diệp, sau đó đoạn cắt trụ hạ diệp được cắt thành những mẫu dài khoảng 0,5 cm rồi ngâm trong dịch vi khuẩn pha loãng (OD600 ~ 0,5) khoảng 30 phút. Sau khi lây nhiễm các mẫu cấy được chuyển vào đĩa petri có giấy thấm tuyệt trùng cho khô mẫu sau đó cấy sang đĩa petri có môi trường đồng nuôi cấy MSCo (phụ lục 2). Các đĩa mẫu sau đó được giữ trong tủ nuôi ở 210C trong đều kiện chiếu sáng liên tục khoảng 72 giờ. 3.4.2.4. Thanh lọc Sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn, mẫu cấy được rửa vi khuẩn bằng nước cất vô trùng 2 lần để loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bám trên bề mặt mẫu cấy và kháng sinh carbernicillin 500 mg/l để ức chế vi khuẩn mọc trở lại. Sau khi rửa, mẫu cấy được đặt lên đĩa petri có giấy thấm vô trùng trong vài phút cho khô mẫu. Sau đó mẫu cấy được cấy chuyền lên môi trường thanh lọc MMS1 (phụ lục 3) có tác nhân thanh lọc là đường mannose và glucose ở các nồng độ khác nhau theo sự tăng dần nồng độ mannose (2,5% w/v, 30% w/v và 35% w/v) và giảm dần nồng độ glucose (10% w/v, 5% w/v và 0% w/v) qua 3 lần thanh lọc, mỗi lần cách nhau 2 tuần. Bảng 3.1. Nồng độ đường mannose và glucose ở các lần thanh lọc Lần thanh lọc Mannose Glucose I 25g/l 10g/l II 30g/l 5g/l III 35g/l 0g/l Sau khi thanh lọc thì các mô sẹo chuyển gen giả định (biến dưỡng đường mannose) xuất hiện. Tỉ lệ mô sẹo chuyển gen giả định được theo dõi. Từ các mô sẹo sống sót sau khi thanh lọc, ta chọn ra những mô sẹo phát triển tốt, có màu xanh hơi vàng và rời rạc để tách nhỏ và cấy chuyền lên môi trường phát sinh phôi MMS2 (phụ lục 6).
22 3.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi Sự biến đổi hình thái mô sẹo trong quá trình lây nhiễm và chọn lọc: Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành theo dõi sự thay đổi hình thái mô sẹo qua các giai đoạn là sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1, thanh lọc lần 2 và thanh lọc lần 3. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo: Sau các lần thanh lọc tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo được chúng tôi theo dõi và ghi nhận. Từ tỉ lệ này chúng ta có thể so sánh được sự khác nhau giữa các giống đồng thời cũng đánh giá được hiệu quả của hệ thống thanh lọc đang thực hiện.
23 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Sự hình thành và phát triển mô sẹo Trong nghiên cứu chuyển nạp gen với mẫu cấy là trụ hạ diệp thì sự hình thành và phát triển của mô sẹo có một ý nghĩa rất quan trọng. Từ các mô sẹo được hình thành sau khi lây nhiễm và qua quá trình thanh lọc chúng ta có thể chọn ra được các mô sẹo chuyển gen có khả năng tái sinh để tiếp tục tái sinh thành cây chuyển gen. Sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1 thì mô sẹo đều bắt đầu hình thành và phát triển ở cả mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm. Mô sẹo có màu xanh lá cây tuy nhiên ở mẫu đối chứng sự phát triển của mô sẹo đồng đều hơn so với mẫu lây nhiễm có thể là do mẫu lây nhiễm bị tổn thương do ngâm trong dịch vi khuẩn và rửa lại bằng nước và kháng sinh khi tiến hành lây nhiễm (Hình 4.2). Hình 4.1. Mẫu cấy giống Coker 312 sau khi lây nhiễm trên môi trường MSCo
24 Hình 4.2. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hai tuần trên môi trường thanh lọc lần 2, mô sẹo phát triển thành một khối to gấp 3 – 4 lần so với mô sẹo trên môi trường thanh lọc lần 1 (Hình 4.3). So sánh giữa đối chứng và mẫu lây nhiễm ta thấy ở mẫu đối chứng thì khối mô sẹo cứng, có màu xanh đậm còn ở mẫu lây nhiễm thì mô sẹo có màu xanh hơi vàng và chắc, một số mô sẹo có xu hướng rời ra khi chạm kẹp vào. Theo Mishra và ctv (2003) thì các mô sẹo này đáp ứng tốt với khả năng tái sinh. Hình 4.3. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 2. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm
25 Hình 4.4. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hình 4.5. Mẫu cấy VN36P sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3 A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm. Trên môi trường thanh lọc lần 3 chúng tôi thấy các mô sẹo tiếp tục phát triển và kích thước mô sẹo lớn hơn trên môi trường thanh lọc lần 2. Ngoài ra, chúng tôi còn thấy được sự khác biệt giữa đối chứng và mẫu lây nhiễm. Các mẫu đối chứng chuyển sang màu xanh đậm hơn, khối mô sẹo cứng và dính chặt vào nhau, trong khi đó ở mẫu lây nhiễm thì khối mô sẹo chắc, các mô sẹo rời và có màu xanh vàng rõ hơn khi quan sát dưới kính hiển vi. Một số mẫu ở đối chứng bắt đầu có hiện tượng hoá nâu và chết, tuy nhiên vẫn còn một số
26 mẫu sống sót, có thể là do trong các khối mô sẹo có sự tích lũy đường glucose (Hình 4.4, Hình 4.5 và Hình 4.6). Các mô sẹo có màu xanh vàng, chắc, rời rạc từ khối mô sẹo còn sống trong giai đoạn này được tách nhỏ và tiếp tục cấy chuyền lên môi trường thanh lọc giống như ở lần 3 (Hình 4.7). Sau 2 tuần quan sát chúng tôi thấy các mô sẹo được tách nhỏ từ mẫu đối chứng điều bị chết còn ở mẫu lây nhiễm thì một số mô sẹo tiếp tục phát triển có màu xanh vàng, rời rạc, đây là các mô sẹo đáp ứng tốt với khả năng tái sinh và có khả năng sinh phôi tốt (Mishra và ctv, 2002; Sakhanokho và ctv, 2001). Tuy nhiên số mô sẹo chuyển màu nâu đen trong nghiệm thức chuyển gen cũng rất nhiều. Ở các mô sẹo chết và trên một số mô sẹo hóa nâu chúng tôi thấy có xuất hiện các mô sẹo mới. Các mô sẹo này có thể là những mô sẹo được chuyển nạp gen (Hình 4.8). Hình 4.6. Mẫu cấy giống Coker 312 chết trên môi trường thanh lọc lần 3. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hình 4.7. Khối mô sẹo giống Coker 312 sau khi thanh lọc lần 3. A: mô sẹo được tách nhỏ và chuyển tiếp lên môi trường thanh lọc lần 3, B: mô sẹo không được tách và chuyển lên môi trường thanh lọc lần 3.
27 Hình 4.8. Mô sẹo giống VN36P được tách nhỏ sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3 A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm. 4.2. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau các lần thanh lọc Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong nuôi cấy mô thông thường và chuyển gen. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành theo dõi sự hình thành mô sẹo của các mẫu cấy sau khi kết thúc mỗi lần thanh lọc (thời gian cho mỗi lần thanh lọc là 2 tuần). Bảng 4.1. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 trên giống Coker 312 Số mẫu Số mẫu sống và tạo mô sẹo Tỉ lệ Số lần thí ban đầu sau khi thanh lọc lần 1 (%) nghiệm Đối Lây Đối chứng Lây nhiễm Đối Lây chứng nhiễm chứng nhiễm 1 38 150 38 146 100 97,3 2 34 146 34 143 100 97,9 3 36 147 36 144 100 97,9 4 34 143 34 139 100 97,2 Trung bình 100 97,6