Luận văn : NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CHO CHUỘT Ở CÁC CHỦNG SALMONELLA CÓ NGUỒN GỐC TỪ BỆNH PHẨM, THỰC PHẨM part 1

Chia sẻ: Pkjd Opiuj | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

106
lượt xem 23
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

1.1. Đặt vấn đề Salmonella là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh ngộ độc thực phẩm cho người trên diện rộng và luôn là mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng. Vi sinh vật này phân bố rộng rãi trong đất, nước, gia súc, thực phẩm… trong đó thịt và các sản phẩm gia cầm là các nguồn bệnh quan trọng. Các báo cáo của Ủy Ban Châu Âu năm 1995 xác định rằng các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là Salmonella và Campylobacter là vấn đề quan trọng cho sức khỏe...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CHO CHUỘT Ở CÁC CHỦNG SALMONELLA CÓ NGUỒN GỐC TỪ BỆNH PHẨM, THỰC PHẨM part 1

1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Salmonella là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh ngộ độc thực phẩm cho người trên diện rộng và luôn là mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng. Vi sinh vật này phân bố rộng rãi trong đất, nước, gia súc, thực phẩm… trong đó thịt và các sản phẩm gia cầm là các nguồn bệnh quan trọng. Các báo cáo của Ủy Ban Châu Âu năm 1995 xác định rằng các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là Salmonella và Campylobacter là vấn đề quan trọng cho sức khỏe cộng đồng. Vì tính chất rất nguy hiểm của Salmonella, tất cả các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của các nước trên thế giới đều xếp Salmonella vào nhóm không được phép có mặt. Hiện nay, khoảng 2500 kiểu huyết thanh về Salmonella đã được xác định. Qua các nghiên cứu cho thấy không phải tất cả các chủng mà chỉ có một số ít có khả năng gây bệnh. Nếu có phương pháp phân biệt được các dòng Salmonella gây bệnh với các dòng lành tính thì sẽ tạo thuận lợi hơn trong việc mua bán và trao đổi hàng hóa thực phẩm giữa các nước. Đồng thời việc phân biệt các dòng trên còn giúp ích nhiều trong việc điều tra và kiểm soát dịch bệnh do vi khuẩn này gây ra. Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của Th.S Nguyễn Tiến Dũng, TS . Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CHO CHUỘT Ở CÁC CHỦNG SALMONELLA CÓ NGUỒN GỐC TỪ BỆNH PHẨM, THỰC PHẨM”. 1.2. Mục đích Nghiên cứu khả năng gây bệnh của các chủng Salmonella có nguồn gốc bệnh phẩm và thực phẩm. 1.3. Nội dung Khảo sát khả năng gây bệnh, gây chết ở chuột do các chủng Salmonella. Khảo sát khả năng xâm nhiễm của các chủng Salmonella vào gan và lách chuột. Nghiên cứu khả năng xâm nhiễm của các chủng Salmonella vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột gồm: dạ dày, gan, lách, ruột non và ruột già. Khảo sát khả năng tái xâm nhiễm của các chủng Salmonella vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột.
2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ SALMONELLA 2.1.1. Đặc điểm sinh vật học 2.1.1.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo Salmonella là một trong 32 giống của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae do Salmon và Smit phân lập ra đầu tiên vào năm 1885 từ lợn mắc bệnh dịch tả. Salmonella là vi khuẩn gram âm, dạng hình que, hai đầu tròn, có kích thước khoảng 0,4 - 0,6 x 1,0 - 3,0 m, không hình thành giáp mô và nha bào [1, 6, 25, 31]. Hình 2.1. Vi khuẩn Salmonella [23] Phần lớn vi khuẩn thuộc giống Salmonella có thể di động nhờ vào những tiên mao, mỗi vi khuẩn có từ 7 đến 12 tiên mao chung quanh thân, trừ S. gallinarum và S. pullorum không có lông nên không di động [6, 11, 35]. 2.1.1.2. Tính chất nuôi cấy Salmonella là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, chúng có thể sống ở nhiệt độ từ 5 – 46oC và pH từ 3,7 - 9,5 nhưng phát triển tốt nhất ở 37oC và pH từ 6,8 - 7,2. Salmonella dễ phát triển trên các môi trường dinh dưỡng thông thường khi nuôi cấy trong khoảng 24 giờ, nhưng trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulfite Agar) thì phải nuôi cấy trong 48 giờ [1, 3, 6, 11]. Trên môi trường canh sau khi nuôi cấy Salmonella từ 5 - 6 giờ thì làm đục nhẹ môi trường, sau 18 giờ làm đục đều, nếu nuôi cấy lâu hơn 24 giờ thì môi trường có lắng cặn.
3 Trên môi trường thạch thường vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S (Smooth) tròn, lồi, trơn láng, bờ đều, thường không màu hay màu trắng xám. Đôi khi tạo khuẩn lạc dạng R (Rough), kích thước khuẩn lạc thường trong khoảng 2 – 4 mm. Trên môi trường thạch Macconkey vi khuẩn Salmonella mọc thành những khuẩn lạc tròn, đường kính 2 – 3 mm, trong suốt, không màu, sáng, nhẵn bóng và hơi lồi ở giữa. Trên môi trường thạch SS (Shigella – Salmonella Agar) Salmonella hình thành những khuẩn lạc tròn, bóng không màu hay có màu hồng và có tâm đen ở giữa. Trên môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) Salmonella cho khuẩn lạc trong suốt, không màu hay có màu hơi nhuốm đỏ đôi khi có tâm đen, thường xuất hiện vùng đỏ hồng xung quanh khi khuẩn lạc Salmonella phát triển mạnh. Trên môi trường thạch BPLS (Brilliant Green Phenol Red Lactose Agar) Salmonella cho khuẩn lạc tròn, màu trắng hồng, môi trường xung quanh đỏ hồng. Trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulphite Agar) Salmonella cho khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thường có ánh kim bao quanh [3, 6, 12, 25, 34]. 2.1.1.3. Sức đề kháng Salmonella bị tiêu diệt ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 15 phút, 100oC trong 5 phút. Chúng có thể sống sót trong môi trường thạch ở nhiệt độ -10oC trong 115 ngày, sống từ 4 - 8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ 29% ở nhiệt độ 6 – 12oC. Trong xác động vật chết, đất bùn, cát khô, trong nước đóng băng Salmonella tồn tại khoảng 2 - 3 tháng, trong nước tự nhiên chúng có thể sống 1 - 2 tháng. Ánh sáng mặt trời chiếu thẳng có thể diệt vi khuẩn trong nước trong sau 5 giờ, trong nước đục sau 9 giờ. Salmonella bị diệt bởi clorua thủy ngân 1%, formol 0,5%, acid fenic 3% trong 15 - 20 phút [6, 11]. 2.1.1.4. Đặc tính sinh hóa Salmonella có những biểu hiện đặc tính sinh hóa chủ yếu như Bảng 2.1, dựa vào các đặc điểm này mà người ta có thể định hướng phân biệt với các vi khuẩn đường ruột khác [3, 6].
4 Bảng 2.1. Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella Phản ứng sinh hóa Biểu hiện Maltose + Glucose + Lactose - H2 S +/- Gas + Lysine decarboxylase + Citrate - Ure - Nitrate + Indol - Voges Proskauer - Chú thích: (-) âm tính, (+)dương tính 2.1.1.5. Đặc điểm biến dị di truyền Trong khi nuôi cấy Salmonella, đặc biệt là nuôi cấy lâu ngày trong môi trường tổng hợp thì Salmonella có thể biến dị về khuẩn lạc và kháng nguyên. Các biến dị thường gặp là: [11, 17] Biến dị S - R: Vi khuẩn mới phân lập có khuẩn lạc dạng S trơn, bóng láng, b ờ đều, có kháng nguyên O đặc hiệu. Qua một thời gian nuôi cấy, vi khuẩn phát sinh biến dị, khuẩn lạc có thể trở nên nhám, xù xì, gồ ghề, người ta gọi đó là dạng R, khi biến thành dạng này thì kháng nguyên O không còn đặc hiệu nữa. Biến dị O - H: Trong khi nuôi cấy dưới ảnh hưởng của một số hóa chất trong môi trường như acid fenic… vi khuẩn có thể bị biến dị vì mất lông, do đó chúng sẽ không di động được khi chỉ còn kháng nguyên O. Biến dị của kháng nguyên H: Vi khuẩn có lông có thể biến dị từ phase 1 sang phase 2, có nghĩa là biến dị từ phase đặc hiệu sang phase không đặc hiệu. 2.1.2. Đặc điểm phân loại Dựa vào sự lai giữa DNA - DNA, Bergey’s (1994) đã chia giống Salmonella thành 2 loài cơ bản là Salmonella enterica (hay còn gọi là S. cholerasuis) và S. bongori [10, 25, 33].
5 S. bongori là một loài hiếm, trong khi đó S. enterica thì phân bố rộng khắp mọi nơi trên thế giới và phổ vật chủ của chúng rất rộng. Loài S. enterica được chia thành 6 loài phụ sau: S. enterica enterica hay còn gọi là S. enterica I S. enterica salamae hay còn gọi là S. enterica II S. enterica arizonae hay còn gọi là S. enterica IIIa S. enterica diarizonae hay còn gọi là S. enterica IIIb S. enterica houtenae hay còn gọi là S. enterica IV S. enterica indica hay còn gọi là S. enterica VI Loài phụ S. enterica I chiếm khoảng 99% trong số các dòng phân lập được, chúng được tìm thấy ở hầu hết các động vật máu nóng. Các loài phụ khác hầu như chỉ phân lập được ở các động vật máu lạnh và trong môi trường. Loài S. bongori hay còn gọi là Salmonella V Các loài phụ của Salmonella được phân biệt dựa trên các đặc điểm sinh hóa ở Bảng 2.2. Bảng 2.2. Đặc tính sinh hóa của các loài phụ thuộc Salmonella Nhóm phụ Đặc điểm sinh hóa I II IIIa IIIb IV V VI ONPG1 D3 - - + + - + (+)2 Lactose - - + - - + D3 Dulcitol + + - - - + Malonate - + - + - - - Gelatine - + - + + - + KCN - - - - + + - O-Nitrophenyl- -D-Glucoside, 2 Không sử dụng nhưng nếu kéo dài thời gian nuôi cấy thì chúng 1 có thể sử dụng, 3 Một số kiểu huyết thanh trong nhóm có thể sử dụng. 2.1.3. Phân loại dựa theo cấu trúc kháng nguyên Hiện nay, ngoài phương pháp căn cứ vào những đặc tính sinh hóa để phân loại Salmonella, việc dựa vào cấu trúc kháng nguyên để xác định các kiểu huyết thanh Salmonella cũng được sử dụng khá phổ biến. Mỗi dòng Salmonella được xác định chủ yếu thông qua 3 loại kháng nguyên sau:
6 Pili Hình 2.2. Vị trí các loại kháng nguyên trên Salmonella Kháng nguyên O (kháng nguyên màng tế bào, somatic): nằm trên màng của vi khuẩn và được phóng thích vào môi trường nuôi cấy. Kháng nguyên này đặc trưng bởi cấu trúc lypopolysaccharide - protein. Loại kháng nguyên này được coi là nội độc tố của vi khuẩn, có tác dụng ngăn cản bạch huyết cầu đi qua mao mạch và làm thay đổi tạm thời sự thẩm thấu của mao quản. Kháng nguyên này bền đối với nhiệt, chúng không bị phân hủy ở nhiệt độ 100oC trong 2 giờ. Chúng bị phân hủy trong môi trường acid tạo ra 2 thành phần cơ bản: [3, 28] Phần 1 là lipide, có cấu trúc tương tự như ở tất cả các loài vi khuẩn thuộc đường ruột khác, phần này qui định khả năng gây độc của vi khuẩn và được gọi là nội độc tố. Phần 2 là phần có nguồn gốc từ polysaccharide, gồm các nhóm hydro nằm ngoài, được dùng để phân biệt các kiểu huyết thanh của Salmonella. Nhóm polysaccharide ở bên trong có chức năng phân biệt các dạng khuẩn lạc. Do có sự khác nhau giữa các loài Salmonella về phương diện cấu tạo kháng nguyên O nên người ta đã chia Salmonella thành 34 nhóm có ký hiệu như sau: A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1 … E4, F, G1, G2, X, Y, Z, 49, 50. Mỗi nhóm huyết thanh học gồm một số loài vi khuẩn có kháng nguyên O cấu tạo bởi một số thành phần nhất định. Ví dụ trong nhóm A, S. paratyphi A, kháng nguyên O gồm 3 thành phần (I), II, XII trong đó thành phần I có thể có hoặc không, thành phần II là thành phần đặc biệt không thể thiếu dùng để phân biệt về mặt huyết thanh học với các nhóm khác. Kháng nguyên H (kháng nguyên lông, flagella): có bản chất là protein rất kém bền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở 70oC hay dưới tác dụng của cồn, các enzyme phá hủy protein, nhưng không bị ảnh hưởng bởi formol 0,5%. Kháng nguyên
7 H không có tác dụng gây bệnh, không tạo miễn dịch. Salmonella chứa 2 nhóm kháng nguyên H, chúng được mã hóa bởi 2 gen khác nhau nhưng có liên quan mật thiết với nhau, tại cùng thời điểm chỉ có 1 trong 2 gen được biểu hiện thành hai nhóm k háng nguyên gọi là phase 1 và phase 2. Phase 1, phase đặc hiệu, bao gồm 28 loại kháng nguyên lông biểu thị bằng chữ La Tinh: a, b, c,…z. Phase 2, phase không đặc hiệu, nhiều dòng Salmonella chứa cùng một loại kháng nguyên, gồm 6 loại biểu thị bằng số Ả Rập 1, 2, 3… hay chữ La Tinh e, n, x… Kháng thể kháng kháng nguyên H gây ngưng kết vi khuẩn bởi các lông roi. Sự ngưng kết này sẽ tạo thành những mảng kết tụ, chúng có thể bị tách bởi các yếu tố có khả năng cắt lông roi của vi khuẩn [3, 11, 28]. Kháng nguyên Vi (kháng nguyên vỏ, capsule): Bọc ngoài kháng nguyên O gọi là kháng nguyên bề mặt có liên quan mật thiết với endotoxin. Kháng nguyên Vi của Salmonella bị biến đổi ở nhiệt độ 100oC trong 15 phút hoặc tác dụng với cồn 90%, nhưng chúng ổn định trong formol 0,5%. Kháng nguyên này thường được tìm thấy trên 3 chủng: S. typhi, S. paratyphi C và S. dublin, chúng không tham gia vào việc gây bệnh. Ngày nay, người ta có khuynh hướng không đặt tên cho các chủng Salmonella nữa mà các chủng này được biểu thị thông qua kháng nguyên O và H , một số có thêm kháng nguyên Vi. Theo hệ thống phân loại của Kaufman - White thì hiện nay có hơn 2500 kiểu huyết thanh của Salmonella đã được xác định. Mỗi kiểu huyết thanh được xác định theo một công thức gọi là công thức kiểu kháng nguyên. Đối với những kiểu huyết thanh thuộc loài phụ I thì thường đặt theo tên, ví dụ S. enteritidis, S. typhi… Căn cứ vào các kiểu cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu dựa vào kháng nguyên O thì S. enterica I được chia thành 9 nhóm: A, B, C1, C2, D, E1, E4, F, G. Trong đó, Salmonella nhóm E thường gây bệnh nhẹ với các triệu chứng như sốt, tiêu chảy, tỷ lệ bệnh diễn biến và tử vong thấp. Salmonella nhóm B và C thì gây bệnh với tỷ lệ cao và tỷ lệ chết tùy thuộc vào chủng và số lượng vi khuẩn xâm nhập vào. Thường thì bé sơ sinh có tỷ lệ bệnh và tử vong cao hơn so với các lứa tuổi khác do mất nước và các chất điện phân [3, 25, 29, 33, 35].
8 Bảng 2.3. Cấu trúc kháng nguyên của một vài Salmonella thƣờng gặp [Jay, 2000] Kháng nguyên H Loài/kiểu huyết Kháng nguyên Nhóm thanh O Phase 1 Phase 2 A S. paratyphi A 1, 2, 12 a (1, 5) B S. schottmuelleri 1, 4, (5), 12 b 1, 2 S. typhimurium 1, 4, (5), 12 i 1, 2 C1 S. hirschfeldii 6, 7, (Vi) c 1, 5 S. choleraesuis 6, 7 (c) 1, 5 S. oranienburg 6, 7 m, t - S. montevideo 6, 7 g, m, s (p) (1, 2, 7) C2 S. newport 6, 8 e, h 1, 2 D S. typhi 9, 12, (Vi) d - S. enteritidis 1, 9, 12 g, m (1, 7) S. gallinarum 1, 9, 12 - - E1 S. anatum 3, 10 e, h 1, 6 Ghi chú: - sự có mặt của yếu tố đó là do sự đảo ngược phage, ( ) có thể vắng mặt. 2.1.4. Phân loại theo mục đích miễn dịch học Về dịch tễ học, Salmonella được chia thành 3 nhóm: [29, 32] Nhóm chỉ nhiễm trên người: Gồm các kiểu huyết thanh S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi C. Chúng là tác nhân gây sốt thương hàn và phó thương hàn. Sốt thương hàn có thời gian ủ bệnh dài, thân nhiệt tăng cao và thường tỷ lệ tử vong cao. S. typhi được phân lập từ máu, thỉnh thoảng từ phân và nước tiểu bệnh nhân có vấn đề về đường ruột. Triệu chứng của bệnh phó thương hàn thì nhẹ hơn thương hàn. Nhóm gây bệnh trên thú: Gồm các kiểu huyết thanh S. gallinarum (gia cầm), S. dublin (bò), S. abortus-equi (ngựa), S. abortus-ovis (cừu), S. choleraesuis (heo). Nhóm không kí chủ đặc hiệu: gây bệnh trên người và thú, thường tìm thấy trong thức ăn. Để có biểu hiện bệnh thì mật độ vi khuẩn đưa vào cơ thể phải đạt khoảng 107- 109 CFU/g.
9 2.1.5. Phân loại độc tố: Salmonella có 2 loại nội độc tố: [7, 27, 32, 33] 2.1.5.1. Độc tố LT (Heat- labile toxin) Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1975 do Koupal và Deibel. Môi trường được tìm thấy tốt nhất để sản xuất ra độc tố này là BHI (Brain Heart Infusion Broth) có chứa 2% casamino acid. Những yếu tố dinh dưỡng như glycerol, biotin và Mn2+ làm tăng khả năng tạo ra độc tố này. Đồng thời, độc tố này tạo ra nhiều hơn ở phase ổn định của quá trình tăng trưởng, thích hợp trong khoảng pH 6 - 7 hoặc cao hơn, nhiệt độ 370C và đặc biệt phải thông khí. Độc tố LT không bền với nhiệt ở 100oC, có trọng lượng phân tử khoảng 110 kDa, và điểm đẳng điện vào khoảng 4,3 - 4,8. Cơ chế tác động: độc tố LT hoạt hóa men adenylcylase trong tế bào, làm gia tăng c-AMP (cycle-adenosin-5-monophotphate). c-AMP kích thích tăng tiết bicarbonate ra khỏi tế bào ruột đồng thời ức chế Na+ vào bên trong tế bào ruột. Kết quả cuối cùng là gây tiêu chảy, mất nước, gây xung huyết và mụn loét. 2.1.5.2. Độc tố ST (Heat- stable toxin) Vào năm 1962, các nhà nghiên cứu của Châu Âu đã chỉ ra hoạt tính của độc tố ST ly trích từ Salmonella. Độc tố này hoạt động trong khoảng pH 6 - 9, bị phá hủy khi xử lý với trypsin và protease. Độc tố này bền với nhiệt, mất hoạt tính ở 121 oC trong 15 phút, trọng lượng phân tử khoảng 32 kDa. Cơ chế tác động tương tự như LT nhưng ST hoạt hóa men guanyl cyclase làm tăng c-GMP (Guanyl-cyclase monophotphate) trong tế bào dẫn đến nước tập trung vào ruột non sau 18 - 24 giờ và dẫn đến tiêu chảy. 2.1.6. Dịch tễ học 2.1.6.1. Tác nhân truyền bệnh Salmonella hiện diện khắp nơi trong tự nhiên. Thực phẩm Salmonella thường hiện điện trong các sản phẩm có nguồn gốc từ thịt gia súc, gia cầm. Ngoài ra, Salmonella còn hiện diện trong trứng, sữa, sản phẩm thủy sản như trai ốc sống trong nước bẩn… Thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật ít khi là nguồn gây ngộ độc Salmonella trừ những rau quả ăn sống như rau diếp, cà chua… nếu bón phân tươi hoặc rửa bằng nước bẩn thì sẽ rất nguy hiểm. Kem, nước đá làm bằng nước bẩn cũng có thể