Luận văn : Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường part 1

Chia sẻ: Pkjd Opiuj | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

360
lượt xem 99
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, nước ta có nhiều nhà máy đƣờng tạo ra một sản lƣợng lớn về đường kết tinh. Bên cạnh đó một lƣợng không nhỏ mật rỉ đƣờng mà các nhà máy này thải ra làm ô nhiễm môi trƣờng. Với những ứng dụng Công nghệ Sinh học đã sử dụng những phế liệu mật rỉ để lên men tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị nhƣ L-lysine, acid citric, acid glutamic.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường part 1

1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, nƣớc ta có nhiều nhà máy đƣờng tạo ra một sản lƣợng lớn về đƣờng kết tinh. Bên cạnh đó một lƣợng không nhỏ mật rỉ đƣờng mà các nhà máy này thải ra làm ô nhiễm môi trƣờng. Với những ứng dụng Công nghệ Sinh học đã sử dụng những phế liệu mật rỉ để lên men tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị nhƣ L -lysine, acid citric, acid glutamic.v.v. và đặc biệt là acid lactic đƣợc quan tâm nhiều trong những năm gần đây. Nhu cầu cung cấp acid lactic ngày càng nhiều, bởi vì chúng đƣợc ứn g dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực nhƣ bảo quản và chế biến thực phẩm, trong y học, môi trƣờng (acid polylactic thay thế các loại sản phẩm nhựa PE, PP, đĩa CD, bịch nilon), mỹ phẩm.v.v. Tổng thị trƣờng thế giới về acid lactic 86.000 tấn vào năm 2001, 500. 000 tấn vào năm 2010. Ở Việt Nam: vào năm 2006, đại diện công ti dƣợc IIdong (Hàn Quốc) xuất khẩu một số lƣợng lớn chế phẩm acid lactic sang hãng MERAP phân phối dƣợc ở Việt Nam với giá trị hợp đồng 3,7 triệu USD [38], [39], [40]. Xuất phát từ tình hình thực tế trên, đƣợc sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Sinh học trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM. Dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy Nguyễn Đức Lƣợng trƣờng Đại học Bách Khoa và Thầy Phan Vĩnh Hƣng Trƣờng Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm TP.HCM. Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường”. 1.2. Mục đích của đề tài Chọn vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic nhiều nhất để sản xuất acid lactic. 1.3. Yêu cầu - Phân lập vi khuẩn lactic - Tuyển chọn các khuẩn lạc có khả năng lên men lactic - Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình lên men - So sánh sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc - Sản xuất acid lactic từ mật rỉ
2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về acid lactic Acid lactic, 2-hydroxypropionic acid (CH3CHOHCOOH) là acid tồn tại rộng rãi trong tự nhiên, đƣợc tìm thấy ở ngƣời, động vật, thực vật và vi sinh vật. Đƣợc phát hiện vào năm 1780 do nhà hóa học Thụy Điển Sheele ở trong sữa chua. Acid lactic đƣợc chấp nhận là sản phẩm của một quá trình lên men vào năm 1847 [2], [25], [32]. Trong cấu tạo phân tử của acid lactic có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai đồng phân quang học: D - acid lactic và L - acid lactic. Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái. Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau. Loại L - acid lactic ở dạng tinh thể. Chúng có khả năng tan trong nƣớc, tan trong cồn, tan trong eter, không tan trong CHCl3, nhiệt độ nóng chảy 28o C [9]. L - acid lactic đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dƣợc phẩm. Hầu hết các sinh vật lên men lactic đồng hình đều tạo ra đƣợc các dạng đồng phân quang học [32]. Loại D - acid lactic là dạng tinh thể, tan trong nƣớc tan trong cồn. Nhiệt độ nóng chảy 28o C. Nếu D - acid lactic và L - acid lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50/50 ngƣời ta gọi là hỗn hợp Raxemic. Trong quá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có tỉ lệ lý tƣởng này mà chỉ có đƣợc hỗn hợp này khi tiến hành t ổng hợp hữu cơ. DL - acid lactic có khả năng tan trong nƣớc, trong cồn, không tan trong CHCl3 [9]. 2.2. Vi sinh vật trong lên men lactic Vi khuẩn lactic có thể đƣợc phân lập từ các cây trồng trên thế giới bao gồm hạt trái cây và rau [24]. Các loài Lactobacillus còn tìm thấy ở dạ dày, ruột non, ruột già và âm đạo [21].
3 Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dƣơng, không sinh bào tử, tỉ lệ G+C thấp, cầu khuẩn hay hình que. Chúng sản xuất ra acid lactic nhƣ là sản phẩm lên men chính. Chúng không có enzyme catalase mặc dù catalase giả có thể đƣợc tìm thấy trong những trƣờng hợp rất hiếm vì vậy không phân giải oxi già. Các thành viên của nhóm này thiếu cytochrome. Tất cả các vi khuẩn lactic phát triển trong điều kiện kị khí. Tuy nhiên, không giống nhƣ những vi khuẩn kị khí, hầu hết các vi khuẩn acid lactic không nhạy cảm với oxi và cũng có thể phát triển tốt trong điều kiện có mặt oxi cũng nhƣ không có mặt oxi. Vì thế chúng là vi khuẩn kị khí tùy ý (Madigan et al. 2000) [30]. Sự phân chia vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể phân chia thành 3 nhóm [23], [19]. - Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc có fructose-1,6-diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhƣng không có phosphoketolase. Chúng lên men đƣợc hexose để tạo acid lactic nhƣng không lên men đƣợc pentose.) - Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý (có FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase. Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose đƣợc chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid acetic). - Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc (Có phosphoketolase nhƣng không có FDP aldolase, quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình).
4 Bảng 2.1. Phân loại Lactobacillus (Sharpe, 1981; Kandler và Weiss, 1986) Đặc đểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Lên men pentose - + + Tạo CO2 từ glucose - - + +a +a Tạo CO2 từ gluconate - Sự hiện diện FDP aldolase + + - +b Sự hiện diện phosphoketolase - + Một vài đại diện L. acidophilus L. casei L. brevis L. delbrueckii L. curvatus L. buchneri L. helveticus L. plantarum L. fermentum L. salivarius L. sake L. reuteri a: Khi lên men b: Cảm ứng khi có pentose Một đặc điểm quan trọng dùng để phân biệt các giống vi khuẩn acid lactic là sự lên men glucose dƣới các điều kiện chuẩn nhƣ: nồng độ glucose và các yế u tố tăng trƣởng (các tiền chất acid amin, vitamin và acid nucleic) thì không giới hạn và giới hạn sử dụng oxi. Dƣới những điều kiện này, vi khuẩn acid lactic có thể phân thành hai nhóm: lên men lactic đồng hình thì chuyển hầu hết lƣợng glucose để tạo thành acid lactic và lên men lactic dị hình thì glucose lên men tạo thành acid lactic, ethanol, acid acetic và CO2. Thật ra việc kiểm tra sản phẩm khí từ glucose sẽ phân biệt đƣợc giữa hai nhóm này (Sharpe, 1979). 2.2.1. Vi khuẩn lactic dị hình Khi tiến hành lên men các dung dịch đƣờng, các vi khuẩn lactic dị hình thƣờng tạo ra lƣợng acid lactic không lớn lắm. Ngoài acid lactic chúng còn tạo ra hàng loạt các sản phẩm khác nhƣ acid acetic, ethanol, CO2 [3], [9]. Một số loài vi khuẩn lactic dị hình đƣợc nghiên cứu nhƣ sau: - Lactobacillus pasteurianus Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc rộng 0,5 – 1 μm; dài 7,0 – 35 μm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ, không di động. Có khả năng lên men đƣợc, glucose, fructose, galactose, maltose, saccharose, mannitol, dextrin. Trong quá trình lên men
5 tạo một số sản phẩm nhƣ CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic. Nhiệt độ thích hợp 29 - 33o C, pH thích hợp 8 [9]. - Lactobacillus brevis Thuộc trực khuẩn, gram dƣơng, không có khả năng di động, kích thƣớc rộng 0,7 - 1,0 μm, dài 2,0 - 4,0 μm. Trong thiên nhiên chúng liên kết với nhau thành chuỗi. Trong quá trình phát triển, chúng có thể sử dụng lactat canxi nhƣ nguồn cung cấp cacbon. Chúng có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose. Chúng hiếm khi lên men mannitol, glycerol, dextrin, và tinh bột. Chúng không hóa lỏng gelatin [18]. - Lactobacillus lycopessici Trực khuẩn, gram dƣơng, trong thiên nhiên chúng tồn tại từng đôi một, có khả năng tạo bào tử. Trong quá trình lên men đƣờng, chúng tạo ra cồn, acid lactic, acid acetic và CO2 . - Streptococcus cumoris Thuộc loài cầu khuẩn, trong thiên nhiên chúng tồn tại thành từng chuỗi rất dài. Thuộc gram dƣơng, nhiệt độ thích hợp phát triển là 30o C, không phát triển ở nồng độ NaCl 4 %. Khi lên men đƣờng tạo ra acid acetic, diacetyl, CO2. Chúng có khả năng tạo ra những chất kháng khuẩn . - Streptolacticus lactic Thuộc chồi cầu khuẩn, gram dƣơng, nhiệt độ phát triển từ 10 – 45o C, có khả năng chịu đƣợc nồng độ NaCl 4 %. Khi lên men đƣờng glucose, maltose, lactose, xylose, saccharose, mannitol, tạo ra acid lactic, acid acetic, diacetyl, CO2. Chúng không có khả năng lên men đƣợc glycerol, sorbitol . - Streptococcus faecalis Chúng tạo thành chuỗi tế bào hình cầu, gram dƣơng. Nhiệt độ tối ƣu 37o C, nhiệt độ sinh trƣởng 10 - 45o C, có thể phát triển duới hoặc 5o C, hiếm khi phát triển ở 50o C. Có khả năng sống sót ở 62,8o C trong 30 phút. Phát triển ở pH 9,6. Chịu đƣợc nồng độ NaCl 2 %, 4 % và 6,5 %. Có khả năng lên men đƣờng glucose, maltose, lactose và luôn luôn lên men mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose, glycerol, sorbitol [18].
6 2.2.2. Vi khuẩn lactic đồng hình Khi tiến hành lên men các dung dịch đƣờng thì vi khuẩn lactic đồng hình thƣờng tạo ra acid lactic là chủ yếu [3], [9]. Một số loài vi khuẩn lactic điển hình đƣợc nghiên cứu kỹ nhƣ sau: - Lactobacillus acidophilus Lần đầu tiên đƣợc phân lập bởi Moro (1900) đƣợc phân lập từ phân của trẻ sơ sinh đã qua phẩu thuật và bê mới đẻ . Có dạng hình que, chịu nhiệt, quá trình lên men tạo ra 2,2 % acid lactic [4], [17]. Chúng có kích thƣớc rộng 0,6 - 0,9 μm, dài 1,5 - 6,0 μm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ. Đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn. Trên môi trƣờng gelatin: chúng không phát triển ở 20o C, không có khả năng hóa lỏng. Trên môi trƣờng khoai tây thì không phát triển. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn gram dƣơng và không di động. Chúng có khả năng lên men đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose, lactose, để tạo acid lactic. Chúng không có khả năng lên men glycerol, mannitol, sorbitol. Không thể phát triển đƣợc trong môi trƣờng không có carbohydrate. Nhiệt độ tối ƣu 37o C. Nó phát triển từ 20 - 22o C. Nhiệt độ phát triển tối đa 43 - 48o C [18]. - Lactobacillus bulgaricus Chúng đƣợc tìm ra do Mesnhicov ở sữa chua Bungari [14]. Thuộc loại trực khuẩn có kích thƣớc rất dài, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, gram dƣơng. Chúng không có khả năng di động, có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ glucose, lactose, galactose. Có thể hoặc không thể lên men fructose, maltose và sucrose. không lên men đƣợc xylose, mannitol, dextrin. Chúng không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate [9]. Quá trình lên men tạo 3,7 % acid lactic [14]. Trên môi trƣờng khoai tây, có khuẩn lạc trắng vàng [18]. pH thích hợp cho sự phát triển là pH = 5,2 - 5,6 [7]. Nhiệt độ tối ƣu 45 - 50o C. Tối thiểu 22o C [20]. Trong sản xuất qui mô lớn, chúng thƣờng đƣợc chọn để lên men Whey để tạo acid lactic, sau đó dùng Ca(OH)2 để trung hòa lƣợng acid lactic tạo thành. Nhiệt độ lên men 43o C, với nhiệt độ này đủ để ức chế các vi sinh vật gây nhiễm mà không ức chế L. bulgaricus [22]. - Lactobacillus bifidus Trực khuẩn rất nhỏ, kích thƣớc trung bình khoảng 4 μm, không có khả năng di động, thuộc gram dƣơng. Chúng có thể đứng riêng lẽ, cặp và chuỗi ngắn. Có khả năng
7 lên men đƣợc các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, saccharose, dextrin, tinh bột và maltose [18]. - Lactobacillus casei Vi khuẩn đƣợc phân lập từ sữa, sản phẩm của sữa, ủ xylo- thức ăn xanh dùng trong chăn nuôi, vi khuẩn dạng hình que, kích thƣớc 0,7 - 1,1 μm; 2,0 - 4,0 μm, trực khuẩn nhỏ thƣờng gặp ở dạng chuỗi dài hay chuỗi ngắn [4]. Chúng thuộc gram dƣơng, không có khả năng lên men đƣợc các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose, lactose và mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose. Nhiệt độ phát triển tối ƣu là 30o C, thấp nhất 10o C. Tối đa 37 - 40o C và vài chủng có thể 45o C. Quá trình lên men tạo khoảng 1,5 % acid lactic [18]. - Lactobacillus causaciccus Trực khuẩn ngắn, không có khả năng di động, gram dƣơng. Chúng có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose, lactose, mannitol. Nhiệt độ phát triển tối ƣu là 48 - 55o C [9]. - Lactobacillus delbrueckii Thƣờng gặp chúng trên hạt đại mạch [14]. Vi khuẩn chịu nhiệt, đƣợc tìm thấy ở các loài hạt ngũ cốc và tinh bột, đây là một giống vi khuẩn có khả năng đồng hóa đƣợc tinh bột. Trực khuẩn dài, kích thƣớc 0,5 - 0,8 μm; 2,0 - 9,0 μm, không di động, gram dƣơng. Quá trình lên men tạo 2,5 % acid lactic. Chúng có khả năng lên men đƣợc glucose, fructose, maltose, sucrose, galactose và dextrin. Chúng không có khả năng lên men xylose, lactose, tinh bột, mannitol. Nhiệt độ tối ƣu 45o C [9], [18]. -Lactobacillus leichmannii Trực khuẩn gram dƣơng. Kích thƣớc tế bào 0,6 – 2 μm. Vi khuẩn này có khả năng tạo thành chuỗi ngắn, không di động, gram dƣơng. Nhiệt độ tối ƣu 36o C. Tối đa 40 - 46o C. Chúng không có khả năng tạo nitrit từ nitrate. Có khả năng lên men glucose, fructose, maltose, saccharose. Trong môi trƣờng khoai tây chúng tạo 1,3 % acid lactic [18]. - Lactobacillus helveticcus Thuộc trực khuẩn có kích thƣớc 0,7 - 0,9 μm; 2,0 - 6,0 μm. Trong thiên nhiên chúng có thể tồn tại riêng từng tế bào, cũng có thể tồn tại thành từng chuỗi tế bào. Nhiệt độ phát triển 40 - 42o C. Chúng có khả năng lên men đƣợc glucose, fructose, galactose, maltose và lactose [9].
8 - Lactobacillus thermophillus Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc tế bào 0,5 - 3,0 μm, không có khả năng di động. Lên men đƣợc glucose, lactose, sucrose, tinh bột và dạng glycerol. Không tạo acid từ mannitol. Lên men đƣợc fructose, galactose, maltose và dextrin. Không tạo nitrit từ nitrate. Nhiệt độ tối ƣu 50 - 62,8o C. Nhiệt độ tối thiểu 30o C, nhiệt độ tối đa 65o C. Điểm nhiệt độ chết khoảng 71o C trong 30 phút [18]. - Lactobacillus plantanrum Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc tế bào 0,7 - 1,0 μm; 3,0 - 8,0 μm. Nhiệt độ tối ƣu 30o C. Tối thiểu 10o C, tối đa 40o C. Điểm nhiệt độ chết từ 65 - 75o C trong 15 phút. Có khả năng chịu nồng độ NaCl 5,5 %. Chúng có khả năng lên men glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose và lactose. Tinh bột thì không lên men. Không tạo đƣợc nitrit từ nitrate [18]. - Lactobacillus sporogenes Thuộc giống Lactobacillus dựa trên các đặc tính bởi Nakayama và Yanoshi (1967). Chúng thuộc Gram dƣơng, có khả năng sinh bào tử, có dạng hình que, kích thƣớc 3 – 5 μm, thuộc vi khuẩn hiếu khí, là vi khuẩn lactic đồng hình sản xuất ra axít lactic L(+) - (dextrorotraytory), phát triển ở nhiệt độ dao động từ 35 - 50o C, pH tối ƣu dao động từ 5,5 - 6,5, phản ứng với catalase dƣơng tính. Tạo acid từ glucose, galactose, fructose, maltose và sucrose. Không có thủy phân tinh bột hoặc casein, không hóa lỏng gelatin. phản ứng indol âm tính và không tạo khí [31]. 2.3. Cơ chế tạo ra acid lactic [20] Kluyver chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm dựa vào sản phẩm cuối của quá trình chuyển hóa glucose. Quá trình này tạo acid lactic là sản phẩm chính từ lên men glucose đƣợc gọi là lên men đồng hình. Số lƣợng acid lactic đồng hình thu đƣợc nhiều hơn lactic dị hình khoảng 2 lần. Vi khuẩn lactic dị hình lên men từ hexose tạo số lƣợng mole lactat, CO2 và ethanol bằng nhau.
9 Bảng 2.2 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình và dị hình [20] Lên men đồng hình Lên men dị hình Sinh vật Dạng Sinh vật Dạng % G+C % G+C lactat lactat Lactobacillus Lactobacillus L. acidophilus DL 36,7 L. brevis DL 42,7 - 46,4 L. bulgaricus D(-) 50,3 L. buchneri DL 44,8 L. casei L(+) 46,4 L. cellobiosus DL 53 L. coryniformis DL 45 L. coprophilus DL 41,0 L. curvatus DL 43,9 L. fermentum DL 53,4 L. delbrueckii D(-) 50 L. hilgardii DL 40,3 L. helveticus DL 39,3 L. sanfrancisco DL 38,1 - 39,7 L. jugurti DL 36,5-39,0 L. trichoides DL 42,7 L. jensenii D(-) 36,1 L. fructivorans DL 38 - 41 L. lactis D(-) 50,3 L. pontis DL 53 - 56 L. leichmannii D(-) 50,8 Leuconostoc L. plantarum DL 45 L.cremoris D(-) 39 - 42 L. salivarius L(+) 34,7 L.dextranicum D(-) 38 - 39 Pediococcus L.lactis D(-) 43 - 44 P.acidilactici DL 44,0 L.mesenteroides D(-) 39 - 42 P.cerevisiae DL L.gelidum D(-) 37 P.pentosaceus DL 38 L.carnosum D(-) 39 Streptococcus Carnobaterium 38 – 42 S.bovis D(-) C.divergens 33,0 - 36,4 S.thermophilus D(-) 40 C.mobile 35,5 - 37,2 Lactococcus C.gallinarum 34,3 - 36,4 L.lactis subsp. lactis D(-) 38,4 - 38,6 C.piscicola 33,7 - 36,4 L.lactissubsp.cremoris D(-) 38,0 - 40,0 Weissella L.lactissubsp.hordniae 35,2 W.confusa DL 44,5 - 45,0 L.garvieae 38,3 - 38,7 W.hellenica D(-) 37 - 47 L.plantarum 36,9 - 38,1 W.halotolerans DL 45 L.raffinolactis 40,0 - 43 W.kandler DL 39 Vagococcus W.minor DL 44 V.fluvialis 33,6 W.paramesenteroides D(-) 38 - 39 V.salmoninarum 36,0 - 36,5 W.viridescens DL 43 Oenococcus O.oeni DL 38 - 42
10 2.3.1. Vi khuẩn lactic dị hình [9] Tất cả các vi khuẩn lactic dị hình thƣờng thiếu hai loại enzym quan trọng đó là aldolase và hexose isomerase. Do đó trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, chúng thƣờng đƣợc tiến hành theo con đƣờng hexose monophosphate hay gọi là con đƣờng pentose phosphate (PP ) . Quá trình chuyển hóa đƣờng đƣợc trình bày nhƣ sau: 2.3.2.Vi khuẩn lactic đồng hình Quá trình lên men lactic đồng hình nhờ có enzyme aldolase và hexose isomerase nhƣng thiếu phosphoketolase. Chúng sử dụng con đƣờng Emb den-Meyerhof-Parnas (EMP) để tạo 2 phân tử lactat từ 1 phân tử glucose [9], [19], [20]. Quá trình chuyển hóa đƣợc trình bày nhƣ sau: