Luận văn:Nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học của một số loài cây chọn lọc từ chi Schefflera, Livistona và Eriobotrya ở Việt Nam

Chia sẻ: Lang Nguyen | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

101
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

này đã làm cho Việt Nam không chỉ có khí hậu nhiệt đới gió mùa mà còn có cả khí hậu ... của Việt Nam chiếm khoảng 30% tổng số loài thực vật ở miền Bắc và chiếm ...... (Pterospermum sp), sếu (Celtis cinamomea), sơn trà (Eriobotrya poilanei), re ( ... vôi ở tỉnh Quảng Ninh còn có một loài đặc hữu là Schefflera halongensis.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn:Nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học của một số loài cây chọn lọc từ chi Schefflera, Livistona và Eriobotrya ở Việt Nam

1 B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Đ I H C ĐÀ N NG GIANG TH KIM LIÊN NGHIÊN C U THÀNH PH N VÀ HO T TÍNH SINH H C C A M T S LOÀI CÂY CH N L C T CHI SCHEFFLERA, LIVISTONA VÀ ERIOBOTRYA VI T NAM Chuyên ngành: Hóa h u cơ Mã s : 62 44 27 01 TÓM T T LU N ÁN TI N SĨ HÓA H C Đà N ng - Năm 2012
2 Công trình ñư c hoàn thành t i Đ I H C ĐÀ N NG Ngư i hư ng d n khoa h c: 1. GS. TS. ĐÀO HÙNG CƯ NG 2. PGS. TS. NGUY N TH HOÀNG ANH Ph n bi n 1: GS.TSKH Nguy n Đình Tri u Ph n bi n 2: PGS.TS Lê T H i Ph n bi n 3: TS. Nguy n Th Bích Tuy t Lu n án s ñư c b o v t i H i ñ ng ch m Lu n án ti n sĩ chuyên ngành Hóa h u cơ h p t i Đ i h c Đà N ng vào ngày 24 tháng 8 năm 2012. Có th tìm hi u lu n án t i: - Trung tâm Thông tin - H c li u, Đ i h c Đà N ng - Thư vi n trư ng Đ i h c Sư ph m, Đ i h c Đà N ng
3 I. GI I THI U LU N ÁN 1. Đ t v n ñ Nư c ta n m trong vùng nhi t ñ i m nên h th c v t r t phong phú. Trong vô s loài th c v t ñang s ng và phát tri n Vi t Nam, r t nhi u loài cây thu c các chi Schefflera, Livistona và Eriobotrya có giá tr s d ng, ñư c dùng ñ bào ch thu c ch a nhi u b nh, ñ c bi t là h tr ñi u tr nh ng b nh hi m nghèo như ung thư máu, ung thư gan... M c dù nh ng loài thu c các chi Schefflera, Livistona và Eriobotrya có nhi u giá tr s d ng như v y nhưng nư c ta các công trình nghiên c u v thành ph n hoá h c, ho t tính c a các cây thu c chi nói trên h u như r t ít và chưa có h th ng, còn các công trình nghiên c u c a nư c ngoài thì ñư c công b chưa nhi u. Vi c ti p t c nghiên c u thành ph n hóa h c, ng d ng các phương pháp hi n ñ i ñ xác ñ nh c u trúc và nghiên c u ho t tính sinh h c c a m t s h p ch t các loài cây thu c các chi nói trên Vi t Nam là m t hư ng nghiên c u có nhi u tri n v ng, ñư c nhi u nhà khoa h c trong nư c và trên th gi i quan tâm. V i nh ng lý do trên chúng tôi ch n ñ tài “Nghiên c u thành ph n và ho t tính sinh h c c a m t s loài cây ch n l c t chi Schefflera, Livistona và Eriobotrya Vi t Nam” làm lu n án ti n sĩ c a mình. 2. M c ñích nghiên c u Tìm hi u v thành ph n hóa h c c a m t s loài cây thu c các chi Chân chim - Schefflera, C - Livistona và Sơn trà - Eriobotrya và thăm dò ho t tính c a các h p ch t phân l p ñư c t chúng, góp ph n cung c p các thông tin khoa h c, hư ng t i nâng cao giá tr s d ng c a các loài cây này và có th ng d ng r ng rãi trong th c t . 3. Đ i tư ng nghiên c u c a lu n án Các b ph n t 5 loài cây thu c 3 chi nghiên c u: Chân chim b t - Schefflera farinosa (BL.) Merr., Chân chim dư i tr ng - Schefflera hypoleuca (Kurn) Hamrs. và Chân chim núi - Schefflera petelotii Merr. thu c chi Schefflera; C x - Livistona chinenis (Jacq.) R.Br. thu c chi Livistona; Sơn trà h p - Eriobotrya angustissima Hook. f. thu c chi Eriobotrya. 4. Nh ng ñóng góp m i c a lu n án Theo tra c u tài li u, ñây là công trình ñ u tiên trên th gi i và t i Vi t Nam công b k t qu nghiên c u v thành ph n hóa h c và thăm dò ho t tính sinh h c c a các loài cây: Chân chim b t, Chân chim dư i tr ng, Chân chim núi thu c chi Schefflera thu hái t i Lào Cai và cây Sơn trà h p chi Eriobotrya thu hái t i Lâm Đ ng.
4 L n ñ u tiên ch t 4',7-di-O-methylnaringenin (SF1), ch t rutin (SF8), acid 3α,29-dihydroxy-olean-12-en-23,28-dioic (SF6) và ch t 7α,29-dihydroxy-friedelan-3-on (SP4) ñư c phân l p t chi Schefflera. Đ ng th i SF6 là ch t m i. Ch t 2α,3α,19α-trihydroxy-12-ursen-28-oic (EA1) l n ñ u tiên phân l p ñư c t chi Sơn trà dư i d ng hai d n xu t axetyl hóa 1 l n và 2 l n là acid 2α-O-acetyl,3α,19α-dihydroxy-urs-12-en-28-oic (EA1b) và acid 2α,3α-di-O-acetyl,19α-hydroxy-urs-12-en-28-oic (EA1a). Theo tra c u, l n ñ u tiên Vi t Nam công b k t qu nghiên c u hoá h c và ho t tính sinh h c c a d ch chi t t qu C x , k t qu cho th y các ch t tricin (LC1), stigmast-5,22-dien-3β-O-D- glucopyranoside (LC2), salicin (LC3) và saccharose (LC4) ñư c phân l p l n ñ u tiên t chi C - Livistona. 5. B c c c a lu n án Lu n án g m 130 trang v i 4 chương, 12 b ng, 29 hình và sơ ñ , 108 tài li u tham kh o (ti ng Vi t: 18, ti ng Anh: 87 và 03 trang web) và 42 trang ph l c. Lu n án ñư c b c c như sau: m ñ u: 3 trang, t ng quan (chương 1): 38 trang, phương pháp nghiên c u (chương 2): 5 trang, th c nghi m (chương 3): 18 trang, k t qu và th o lu n (chương 4): 52 trang, k t lu n và ki n ngh : 2 trang, tài li u tham kh o: 11 trang, danh m c công trình liên quan ñ n lu n án: 1 trang. II. N I DUNG C A LU N ÁN M Đ U Ph n m ñ u ñ c p ñ n lý do ch n ñ tài, ý nghĩa khoa h c và th c ti n c a lu n án. CHƯƠNG 1. T NG QUAN Trong ph n t ng quan, lu n án ñã t ng k t các công trình nghiên c u trong nư c cũng như trên th gi i v ñ c ñi m th c v t, ng d ng trong dân gian c a m t s cây thu c ba chi nghiên c u Schefflera; Livistona và Eriobotrya. Đ ng th i ñã t ng quan v hóa h c và ho t tính sinh h c c a các l p ch t là thành ph n hóa h c ch y u c a các loài cây thu c 3 chi nghiên c u. Nh n xét v tình hình nghiên c u các loài thu c ba chi nói trên và nh ng v n ñ c n nghiên c u ti p theo. CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U Ph n này mô t chi ti t các phương pháp ng d ng nghiên c u 2.1. Phương pháp phân l p các h p ch t Các phương pháp phân l p ch y u: s c kí c t thư ng và s c kí c t
5 nhanh, ch t h p ph là silicagel; s c kí Sephadex LH–20; s c ký ngư c pha RP–18 k t h p s c kí l p m ng v i các h dung môi thích h p. 2.2. Phương pháp xác ñ nh c u trúc hóa h c c a các ch t C u trúc hóa h c c a các ch t s ch ñư c xác ñ nh b ng s k t h p gi a các phương pháp v t lý và các phương pháp ph hi n ñ i như: ph h ng ngo i (IR), ph kh i ion hóa b ng b i electron (ESI-MS), phương pháp ph c ng hư ng t h t nhân m t chi u (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chi u (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY). 2.3. Phương pháp thăm dò ho t tính sinh h c Ho t tính kháng vi sinh v t ki m ñ nh ñư c th trên 7 ch ng vi khu n và n m theo phương pháp pha loãng n ng ñ c a Hadacek F. Greger H. Ho t tính gây ñ c t bào ñư c th theo phương pháp c a Scudiero D. A. và c ng s trên 4 dòng t bào ung thư: bi u mô (KB), gan (HepG2), ph i (Lu), vú (MCF7) và ñ i chi u v i các ch t chu n. Ho t tính kháng oxi hóa ñư c th theo phương pháp DPPH c a Shela G. và c ng s . CHƯƠNG 3. TH C NGHI M 3.1. Nguyên li u, hóa ch t, thi t b Ph n này mô t chi ti t nguyên li u dùng cho nghiên c u: các m u th c v t, hóa ch t và thi t b dùng cho nghiên c u. 3.2. Phân l p các ch t t các cây thu c chi Chân chim 3.2.1. Cây Chân chim b t - Schefflera farinosa (Bl.) Merr. Mô t chi ti t quá trình chi t m u v cây Chân chim b t (hình 3.1) và phân l p các ch t t d ch chi t methanol SFM c a v cây Chân chim b t (hình 3.2). B t v cây (0,5 kg) Ngâm chi t v i n-hexane - L c l y ph n d ch n-hexane, Bã th c v t - Cô quay khô dung môi Ngâm chi t v i ethyl acetate Cao chi t n-hexane (1,4g) - L c l y d ch ethyl acetate, - Cô quay khô Bã th c v t dung môi - Ngâm chi t v i methanol - L c l y d ch methanol, Cao chi t - Cô quay khô dung môi EtOAc (6,4g) Cao chi t MeOH (33,7g) Hình 3.1. Sơ ñ chi t m u v cây Chân chim b t
6 Cao chi t MeOH SFM - (24g) S c ký c t silicagel, CH2Cl2/MeOH (90:10); CH2Cl2/MeOH/H2O(80:20:2-60:40:5) SFM3 SFM6 SFM9 0,5g 1,9g 5,7g SKC silicagel, Tinh th , S c ký Sephadex, H2Cl2/MeOH/H20 (70:30:5) k t tinh l i dung môi MeOH, SF1 SFM9.3 SFM6.2 SFM9.4 30 mg 1,2g ch a ch t 0,98g k t tinh S c ký Sephadex, S c ký Sephadex, dung môi MeOH dung môi MeOH K t tinh l i 60 mg SFM9.3.2 SFM9.3.3 ch t r n SF6 0,25g 0,17g 25 mg K t tinh l i K t tinh l i K t tinh l i SF8 SF7 SF4 32 mg 20 mg 25 mg Hình 3.2. Sơ ñ phân l p các ch t t v cây Chân chim b t Trình bày các s li u ph , thông s v t lý c a các ch t phân l p ñư c t d ch chi t này (5 ch t: SF1, SF6, SF8, SF7 và SF4). 3.2.2. Cây Chân chim dư i tr ng - Schefflera hypoleuca (Kurz) Hamrs Mô t chi ti t quá trình chi t m u lá cây Schefflera hypoleuca và phân l p các ch t t cao chi t ethyl acetate (hình 3.3). Trình bày các s li u ph , thông s v t lý c a các ch t phân l p ñư c t d ch chi t này (3 ch t SH1, SH2 và SH3). C n chi t EtOAc SHE (25g) 1. SKC silica gel 2. H dung môi CH2Cl2:MeOH (99:1 → 70:30), SHE3 SHE4 SHE5 (1,2g) (8,5g) (3,5g) SKC silica gel SKC silica gel SKC silica gel CH2Cl2:MeOH (99:1) CH2Cl2:MeOH (95:5) CH2Cl2:MeOH (95:5) SHE3.2 SHE4.3 SPE5.4 Ch t r n, K t t a tr ng, K t tinh l i k t tinh l i k t tinh l i SH2 SH3 SH1 125 mg 25 mg 125 mg Hình 3.3. Sơ ñ phân l p các ch t t lá cây Chân chim dư i tr ng
7 3.2.3. Cây Chân chim núi - Schefflera petelotii Merr. Mô t chi ti t quá trình chi t m u v cây Schefflera petelotii và phân l p các ch t t cao chi t ethyl acetate và methanol (hình 3.4). Trình bày các s li u ph , thông s v t lý c a các ch t phân l p ñư c t d ch chi t ethyl acetate (3 ch t: SP1, SP2 và SP3) và methanol (1 ch t: SP4) Cao chi t EtOAc Cao chi t EtOAc SPE (8 g) SPM (40 g) SKC silica gel, SKC silica gel, h CH2Cl2:MeOH h CH2Cl2:MeOH (99:1 → 70:30), (MeOH t 5-100%) SPE3 SPE4 SPE5 SPM9 (0,5 g) (0,64 g) (0,71 g) (134 mg) SKC silica gel SKC silica gel SKC silica gel SKC silica gel CH2Cl2:MeOH CH2Cl2:MeOH CH2Cl2:MeOH CH2Cl2:MeOH (99:1) (95:5) (95:5) (98:2 → 3:7) SPE3.2 SPE4.3 SPE5.4 SPM9.2 K t tinh l i K t tinh l i K t tinh l i K t tinh l i SP1 SP2 SP3 SP4 26 mg 30 mg 27 mg 27 mg (a) (b) Hình 3.4. Sơ ñ phân l p các ch t t v cây Chân chim núi a) Cao chi t EtOAc; b) Cao chi t MeOH 3.3. Thăm dò ho t tính sinh h c c a m t s ch t phân l p t chi Chân chim Các h p ch t SP2, SF4, SF6 và SF7 ñã ñư c phân l p t chi Chân chim (Schefflera) ñư c ch n ñ th các ho t tính kháng vi sinh v t ki m ñ nh và ho t tính gây ñ c t bào. 3.4. Thăm dò ho t tính sinh h c c a các d ch chi t t qu C x Các d ch chi t t qu C X (Livistona chinensis) trong các dung môi n-hexane (kí hi u LCQ.N), dung môi EtOAc (kí hi u LCQ.E) và dung môi MeOH (kí hi u LCQ.M) ñư c th các ho t tính kháng vi sinh v t ki m ñ nh, ho t tính gây ñ c t bào và ho t tính kháng oxi hoá. 3.5. Phân l p các ch t t d ch chi t methanol c a Qu C x - Livistona chinensis (Jacq.) R.Br Mô t chi ti t quá trình phân l p các ch t t cao chi t methanol (hình 3.5). Trình bày các s li u ph , thông s v t lý c a các ch t phân l p ñư c t d ch chi t này (4 ch t LC1, LC2, LC3 và LC4).
8 Cao MeOH LC2 (17 gam) SKC silicagel, h dung môi EtOAc – MeOH LC2.2 LC2.4 LC2.6 LC2.9+ LC2.10 (0,78g) (0,24g) (0,58g) (1,56g) L c, r a k t t a, SKC silicagel, L c, r a k t t a, SKC silicagel, h dung môi k t tinh l i l c, r a k t t a, S c ký Sephadex CH2Cl2:MeOH: k t tinh l i dung môi MeOH H2O = 8:3:0,5 LC1 LC2 LC3 LC4 150 mg 14 mg 16 mg 25 mg Hình 3.5. Sơ ñ phân l p các ch t t qu C x 3.6. Phân l p các ch t t lá cây Sơn trà h p - Eriobotrya angustissima Hook. f. Mô t chi ti t quá trình phân l p các ch t t cao chi t n-hexane (3 ch t: EA5, EA6, EA2) và ethyl acetate (5 ch t g m EA4 và 4 ch t ñư c tách ra dư i d ng s n ph m acetyl hoá: EA1a, EA1b, EA2a, EA3a (hình 3.7). Trình bày các s li u ph , thông s v t lý c a các ch t. Cao chi t n-hexane Cao chi t EtOAc EAH (9g) EAE (19 g) SKC silica gel, h n-hexan:EtOAc SKC silica gel, h n- (t l EtOAc tăng d n t 20-100%), hexan:EtOAc (t l EtOAc tăng d n t 20-100%) EAE20 EAH6 EAH10 EAH14 EAH15+16 (1,12g) (1,1 g) - Phân tách qua c t Acetyl hoá b ng h n h p - L c l y ch t -L cl y Sephadex, dung SKC silicagel anhydrit acetic và k t tinh ch t k t tinh môi MeOH H n-hexan: pyridine trong 24h - K t tinh l i - K t tinh l i - Ti p t c tinh ch EtOAc = 95:5 trong n-hexan EA-Ac (0,95 g) b ng s c ký c t trong EtOAc pha ñ o, h MeOH:H2O=3:7 SKC silicagel, h EA5 EA6 EA2 n-hexan:EtOAc = 95:5 EA4 100 mg 12 mg 95 mg 45 mg EA1a EA1b EA2a EA3a 120 mg 55 mg 67 mg 28 mg Hình 3.7. Sơ ñ phân l p các ch t t lá cây Sơn trà h p CHƯƠNG 4. K T QU VÀ TH O LU N 4.1. K t qu nghiên c u thành ph n hóa h c và ho t tính sinh h c 3 loài ch n l c t chi Chân chim (Schefflera)
9 4.1.1. Thành ph n hóa h c 4.1.1.1. Các h p ch t phân l p t v cây Chân chim b t - Schefflera farinosa (BL.) Merr. Cao chi t methanol v cây Chân chim b t - Schefflera farinosa ñư c tinh ch b ng phương pháp s c ký c t v i các dung môi thích h p thu ñư c 5 ch t: SF1; SF6; SF8; SF7 và SF4 theo sơ ñ 3.2. SF1: 4',7-Di-O-methylnaringenin SF6: 3α,29-dihydroxy-12-oleanen (l n ñ u phân l p t chi Chân chim) -23,28-dioic acid (ch t m i) SF8: rutin SF7 (57): R1 = Caffeoyl; R2 = H SF4 (59): R1 = R2 = Caffeoyl Ch t SF1 (4',7-di-O-methylnaringenin) Ph kh i positive ESI-MS (hình 4.1) cho pic ion phân t t i m/z = 301 [M + H]+. S li u ph kh i k t h p v i ph 1H, 13C-NMR và DEPT cho bi t công th c phân t c a SF1 là C17H16O5. Ph 1H-NMR (hình 4.2) cho bi t trong phân t c a ch t SF1 có 16 proton. Đ d ch chuy n hóa h c Hình 4.1. Ph ESI-MS c a ch t SF1 và ñ b i c a các tín hi u proton
10 ñ c trưng cho h p ch t flavanon: 2 proton thơm c a vòng A δH = 6,05 và 6,04 (m i tín hi u d, 2,3Hz); 4 proton c a vòng B δH = 7,38 và 6,95 (m i tín hi u 2H, d, 8,7Hz); 3 aliphatic proton c a vòng C, trong ñó có proton c a nhóm oxygen methin δH = 5,36 (dd, 3,0 và 13,0Hz), ngoài ra còn cho th y 2 nhóm methoxy và m t nhóm hydroxy có liên k t c u hydro n i phân t 12,03ppm. Các tín hi u trong ph 13C-NMR (hình 4.3) phù h p v i các tín hi u proton, th hi n qua: 1 nhóm carbonyl 196,0 ppm; 12 carbon thơm c ng hư ng trong vùng t 94,2 ñ n 167,9ppm; m t nhóm oxygen methin 79,0ppm; m t nhóm methylen và 2 nhóm methoxy. OC H 3 OC H 3 O H3 C O O H3 C O OH O OH O Hình 4.2. Ph 1H-NMR c a ch t SF1 Hình 4.3. Ph 13C-NMR c a ch t SF1 (500 MHz, CDCl3) (125 MHz, CDCl3) Các s li u ph c a SF1 hoàn toàn ñ ng nh t v i ch t 4',7-di-O- methylnaringenin trong tài li u [31]. Cho phép k t lu n ch t SF1 là 4',7- di-O-methylnaringenin, công th c phân t là: C17H16O5. α Ch t SF6 (acid 3α,29-dihydroxy-olean-12-en-23,28-dioic) Ph h ng ngo i c a ch t SF6 (hình 4.4) cho các ñ nh h p th t i 3424 cm-1 c a nhóm hydroxy, ñ nh 1653cm-1 (carbonyl). Ph kh i positiv ESI-MS (hình 4.5) cho pic ion phân t t i m/z = 525 [M + Na]+. S li u ph kh i k t h p v i ph 13C-NMR và DEPT cho bi t công th c phân t c a SF6 là C30H46O6. 29 30 HOH2C 20 19 12 18 22 17 11 13 28 25 26 COOH 1 14 16 29 30 10 8 HOH2C 27 3 20 HO 4 19 6 HOOC 12 18 22 23 24 17 11 13 28 25 26 COOH 1 14 16 10 8 27 3 HO 4 6 HOOC 23 24 Hình 4.4. Ph IR c a ch t SF6 Hình 4.5. Ph ESI-MS c a ch t SF6
11 Ph 1H- (hình 4.6) và 13C-NMR (hình 4.7) cho th y SF6 là triterpene 12-oleanen v i 2 nhóm th hydroxy và 2 nhóm carboxylic acid, th hi n qua các tín hi u c a n i ñôi th ba l n (-CH=C
12 Như v y c u trúc c a ch t SF6 ñư c xác ñ nh là acid 3α,29- dihydroxy-olean-12-en-23,28-dioic. Các s li u ph 13C-NMR c a ch t SF6 ñư c trình bày trên b ng 4.1. 13 B ng 4.1. S li u ph C-NMR c a ch t SF6 (125 MHz, CD3OD) V trí SF6 V trí SF6 V trí SF6 C δC C δC C δC 1 41,62 t 11 24,17 t 21 33,67 t 2 29,43 t 12 123,45 d 22 33,84 t 3 73,15 13 145,52 s 23 184,93 s 4 51,66 14 42,99 s 24 18,56 q 5 48,49 15 28,86 t 25 16,28 q 6 21,97 t 16 24,34 t 26 17,82 q 7 33,22 t 17 48,18 s 27 26,57 q 8 40,9 s 18 42,10 d 28 182,70 s 9 46,98 19 41,62 t 29 74,56 t 10 36,88 20 37,88 s 30 19,56 q Ch t SF8 (rutin) Ch t SF8 có Rf = 0,75 (trên b n m ng ngư c pha RP-18, v i h dung môi MeOH:H2O = 7:3. Ph ESI-MS cho pic ion phân t : m/z = 633 [M + Na]+. S li u ph 1H-NMR c a ch t SF8 hoàn toàn trùng kh p v i s li u ph c a quercetin-3 rutinosid hay còn ñư c g i là rutin ñã công b , t ñó cho phép rút ra k t lu n ch t SF8 là rutin, CTPT: C27H30O16. Ch t SF7 (acid 3-O-caffeoylquinic) Ch t SF7 có Rf = 0,45 (h CH2Cl2/MeOH/H2O=65:35:5). Ph IR (KBr) cho các s li u ñ c trưng: νmax (cm-1): 3430 (OH); 2533; 2077; 1638 (carboxyl); 1445; 1121; 972. Ph kh i ESI-MS c a ch t SF7 cho pic ion phân t m/z = 353 [M - H]-. K t h p s li u ph 13C-NMR và DEPT có th ñưa ra công th c phân t c a ch t này là C16H18O9. Các s li u ph c a ch t này hoàn toàn ñ ng nh t v i ch t acid 3-O- caffeoylquinic (57) ñã công b trong tài li u [100]. Như v y ch t SF7 là acid 3-O-caffeoylquinic, CTPT: C16H18O9. Các ph c a ch t SF7 ñư c trình bày ph l c 4. Ch t SF4 (acid 3,5-di-O-caffeoylquinic) Ph IR (KBr) cho các ñ nh ñ c trưng νmax (cm-1): 3433 (OH); 2536; 1637 (carboxyl); 1441; 1283. Ph kh i ESI-MS c a ch t SF4 cho pic ion phân t m/z = 515 [M - H]-. Công th c phân t ñư c rút ra t s li u ph kh i và c ng hư ng t h t nhân là C25H24O12. Ph 1H- và 13C-NMR (b ng 4.2) c a nó tương t như c a ch t SF7 nhưng xu t hi n thêm m t
13 g c trans-caffeoyl th vào m t nhóm OH khác c a acid quinic. C u trúc c a SF4 ñư c xác ñ nh là acid 3,5-di-O-caffeoylquinic khi so sánh thêm v i s li u ph c a ch t (59) trong tài li u [100]. Các ph c a ch t SF4 ñư c trình bày ph l c 2. B ng 4.2. S li u ph 1H- và 13C-NMR c a ch t SF7 và SF4 (500 & 125 MHz, CD3OD) SF7 SF4 V trí δH δC δH δC 1 - 76,6 s 76,38 s 2 1,99 - 2,25 m 40,68 t 2,27 dd(3,0; 15,0) 41,06 t 3 4,20 m 72,68 d 5,38 dd (3,0; 6,2) 73,35 d 4 3,77 dd (3,0; 73,14 d 3,91 dd (3,4; 10,0) 72,51 d 5 5,47 m 75,12 d 5,54 ddd (5,0; 10,0; 74,56 d 6 1,99 - 2,25 m 39,02 t 2,09 m 37,74 t 7 - 181,3 s 181,65 s 1' - 127,86 s - 128,12 s 2' 7,13 d (2,0) 115,61d 7,08/ 7,06 d (2,0) 115,60 d 3' - 146,80 s - 149,54 s 4' - 149,52 s - 146,81 s 5' 6,86 d ( 8,0) 116,50 d 6,78/ 6,78 d (8,0) 116,46 d 6' 7,03 dd (2,0; 122,90 d 6,97/ 6,95 dd (2,0; 122,96 d 7' 7,66 d (15,9) 146,80 d 7,61/ 7,59 d (15,9) 146,77 d 8' 6,38 d (15,9) 115,10 d 6,42/ 6,31 d (15,9) 116,51 d 9' - 169,15 s - 169,01 s 4.1.1.2. Các h p ch t phân l p ñư c t lá cây Chân chim dư i tr ng - Schefflera hyploleuca (Kurn) Hamrs. T lá cây Chân chim dư i tr ng ñã phân l p ñư c 3 ch t: SH1, SH2 và SH3 theo sơ ñ 3.3. SH1: β-sitosterol SH3: β-sitosterol – glucoside SH2: Acid 3α-hydroxy-20-demethylisoaleuritolic-14(15)-en-28,30-dioic
14 Ch t SH1 (β-sitosterol) Ch t SH1 thu ñư c dư i d ng k t tinh hình kim, màu tr ng. C u trúc c a ch t này ñư c xác ñ nh là β-sitosterol nh so sánh trên b n m ng phân tích và s li u ph IR v i ch t chu n, CTPT: C29H50O. Ch t SH2 (acid 3α-hydroxy-20-demethylisoaleuritolic-14(15) -en- 28,30 -dioic) T ph h ng ngo i c a SH2 (ph l c 6, hình 28) cho th y các ñ nh h p th ñ c trưng νmax 3416 cm-1 là c a nhóm OH và 1689 cm-1 là c a nhóm C=O acid. Ph kh i ESI-MS (ph l c 6, hình 29) cho pic ion phân t m/z = 486 [M]+.K t h p s li u ph kh i k t v i s li u ph NMR, ph DEPT cho phép ñưa ra công th c phân t ch t SH2 là C30H46O5. Ph 1H-NMR (500 MHz, DMSO) (ph l c 6, hình 30) c a ch t SH2 cho các tín hi u δH (ppm): 5,52 m, 1H (H-15); 4,16 br-s, 1H (H-3); 3,17 br-s, 1H (H-13), 0,87; 0,86; 0,82; 0,79; 0,78; 0,73. Ph 1H- và 13C-NMR (ph l c 6, hình 30-33) c a SH2 cho th y 6 tín hi u singlet δH (ppm): 0,87; 0,86; 0,82; 0,79; 0,78; 0,73 c a 6 nhóm methyl b c b n; m t n i ñôi b th ba l n th hi n qua các tín hi u δH = 5,52 m và δC = 125,08; 136,6; m t nhóm hydroxy methin δH = 4,16 (br-s) và δC = 73,56. Ngoài ra phân t ch t SH2 còn ch a 2 nhóm cacboxyl δC = 176,54 và 178,47. Bên c nh các tín hi u trên, ph 13C- NMR-DEPT (ph l c 6, hình 34) còn cho th y phân t có 10 nhóm CH2, 3 nhóm CH và 6 cacbon b c b n. Các s li u ph phân tích như trên cho phép d ñoán c u trúc c a SH2 là m t triterpene khung acid 14- taraxeren-28-oic. Đ d ch chuy n hóa h c c a nhóm hydroxy methin δC = 73,56 ppm ch ng t nhóm hydroxy v trí 3α khi so sánh v i các ch t khác có nhóm 3β-OH [92]. Tín hi u cacbon δC = 178,47 ppm ñ c trưng cho nhóm cacboxylic g n vào C-17, còn tín hi u δC = 176,54 ppm ñư c gán cho C-30 khi so sánh v i tài li u [67]. Các s li u ph c a SH2 hoàn toàn ñ ng nh t v i s li u c a ch t acid 3α-hydroxy-20-demethylisoaleuritolic-14(15)-en-28,30-dioic. Ch t này ñã ñư c tác gi Min Zhu và c ng s phân l p l n ñ u tiên t lá cây Schefflera bodinieri vào năm 1996. S li u 13C-NMR c a SH2 và ch t so sánh (51) trong tài li u ñư c ñưa b ng 4.3. B ng 4.3. S li u ph 13C-NMR c a ch t SH2 (125MHz, DMSO) V trí SH2 Tài li u [67] V trí SH2 Tài li u [67] C δC (DMSO) C δC (DMSO) 1 32,88 t 33,11 16 23,76 t 23,90
15 2 23,65 t 23,98 17 55,18 s 55,35 3 73,56 d 73,76 18 40,0 s 40,18 4 36,90 s 37,11 19 31,64 t 31,85 5 46,21 d 46,40 20 30,34 s 30,57 6 25,22 t 25,45 21 35,93 t 36,17 7 33,01 t 33,54 22 22,37 t 22,58 8 36,67 s 36,90 23 33,32 q 33,25 9 48,18 d 48,40 24 17,96 q 18,20 10 36,67 s 36,90 25 15,83 q 16,10 11 17,74 t 18,00 26 22,39 q 22,50 12 43,16 t 43,01 27 23,34 q 23,60 13 46,21 d 46,40 28 178,47 s 178,70 14 136,60 s 136,80 29 28,58 q 28,80 15 125,08 d 125,40 30 176,54 s 176,80 Ch t SH3 (β-sitosterol glucosid) C u trúc c a ch t SH3 ñư c xác ñ nh là β-sitosterol glucoside, CTPT: C35H60O6 nh so sánh giá tr Rf trên b n m ng và ph IR (hình 4.11) c a ch t SH3 v i β-sitosterol glucoside chu n. 4.1.1.3. Các h p ch t phân l p ñư c t v cây Chân chim núi - Schefflera petelotii Merr. T v cây Chân chim núi phân l p ñư c 4 ch t SP1, SP2, SP3 và SP4 theo sơ ñ 3.4. SH1: β-sitosterol SH3: β-sitosterol – glucoside 30 29 CH2OH 2719 21 11 17 28 1 14 10 16 8 3 5 25 26 O 7 OH 23 α SH2: Acid 3α-hydroxy-20-demethyl- SP4:7α,29-dihydroxy-friedelan-3-on, isoaleuritolic-14(15)-en-28,30-dioic l n ñ u phân l p t chi Chân chim
16 α Ch t SP1(β-sitosterol), SP2 (acid 3α-hydroxy-20-demethyl isoaleuritolic-14(15)-en-28,30-dioic) và SP3 (β-sitosterol glucoside) Các ch t SP1, SP2 và SP3 ñư c xác ñ nh tương ng là β-sitosterol; acid 3α-hydroxy-20-demethyl isoaleuritolic-14(15)-en-28,30-dioic và β- sitosterol glucosid, nh so sánh trên b n m ng v i các ch t SH1, SH2 và SH3 mà nhóm nghiên c u chúng tôi ñã tách ñư c t lá cây Chân chim dư i tr ng (m c 4.1.1.2). α Ch t SP4 (7α,29-dihydroxy-friedelan-3-on) Ph kh i (ESI-MS) c a ch t SP4 cho pic ion phân t t i m/z = 459 [M]+. S li u ph kh i k t h p v i các d li u 13C-NMR và DEPT cho phép xác ñ nh công th c phân t c a nó là C30H50O3. T s phân tích các d li u ph cho phép d ñoán SP4 là m t triterpene khung friedelan-3- on v i 2 nhóm th hydroxyl. C u trúc c a ch t SP4 ñư c kh ng ñ nh là 7α,29-dihydroxy-friedelan-3-on nh phân tích và so sánh các s li u ph v i tài li u ñã công b [69]. Các s li u ph 13C-NMR (DMSO) c a ch t SP4 và ch t so sánh trong tài li u [69] ñư c trình bày trên b ng 4.4. B ng 4.4. S li u ph 13C-NMR c a ch t SP4 (125MHz, DMSO) V trí SP4 Tài li u [69] V trí SP4 Tài li u [69] C δC (CD3OD) C δC (CD3OD) 1 21,36 t 21,90 16 36,15 t 36,10 2 40,45 t 41,20 17 29,12 s 29,70 3 211,65 s 212,30 18 41,89 d 42,40 4 56,88 d 58,30 19 29,24 t 29,50 5 41,84 s 42,60 20 33,07 s 33,50 6 51,81 t 52,30 21 27,85 t 28,00 7 66,31 d 68,80 22 38,01 t 38,30 8 57,38 d 58,70 23 6,81 q 6,90 9 38,23 s 39,10 24 15,50 q 15,90 10 57,48 d 58,90 25 18,71 q 18,90 11 35,38 t 35,90 26 19,82 q 20,80 12 29,91 t 30,40 27 18,86 q 19,00 13 38,23 s 40,10 28 31,69 q 31,90 14 41,84 s 40,40 29 69,71 t 71,40 15 33,84 t 35,40 30 29,48 q 29,10 4.1.2. K t qu th ho t tính sinh h c c a m t s ch t phân l p ñư c t chi Chân chim K t qu th ho t tính c a ch t SP2 cho bi t ch t này có ho t tính tương ñ i t t v i c 4 dòng t bào ung thư ñem th : ung thư bi u mô
17 (KB), gan (HepG2), ph i (Lu) và ung thư vú (MCF7) v i các giá tr IC50 tương ng là 17,88; 22,15; 8,0 và 3,5 µg/ml. Nhưng nó không có ho t tính kháng các ch ng vi sinh v t Gram(+), Gram(-) và n m ñã th . Các ch t SF4, SF6 và SF7 không kháng các ch ng vi sinh v t ki m ñ nh và không ñ c v i 4 dòng t bào ung thư ñem th . Nh n xét chung v k t qu nghiên c u ba loài thu c chi Chân chim Đây là l n ñ u tiên 3 loài Chân chim b t, Chân chim dư i tr ng và Chân chim núi thu c chi Chân chim ñư c nghiên c u t i Vi t Nam và trên th gi i. K t qu nghiên c u thành ph n hóa h c c a 3 loài trên cho th y, ngoài các sterol ph bi n trong th c v t như β-sitosterol (SH1) và β-sitosterol glucoside (SH3) các h p ch t phân l p ñư c ch y u thu c l p ch t flavonoid và triterpene. K t qu này hoàn toàn phù h p v i các nghiên c u trư c ñây v thành ph n hóa h c các cây thu c chi này. Trong s 9 ch t phân l p ñư c có 3 ch t l n ñ u tiên tìm th y t chi Schefflera, g m có m t flavonoid: 4',7-di-O-methylnaringenin (SF1); và hai h p ch t triterpene: 7α,29-dihydroxy-friedelan-3-on (SP4) và acid 3α,29-dihydroxy-olean-12-en-23,28-dioic (SF6), trong ñó ch t SF6 (acid 3α,29-dihydroxy-olean-12-en-23,28-dioic) là ch t m i. Các h p ch t khung flavonoid và triterpene t n t i khá ph bi n trong th gi i th c v t. Nhi u công trình nghiên c u v ho t tính sinh h c cũng như m i liên h gi a c u trúc và ho t tính sinh h c c a hai l p ch t này ñã ñư c công b . Kh năng gi i t a electron t t, nhóm carbonyl t i C4 và liên k t ñôi gi a C2 và C3 là nh ng ñ c trưng quan tr ng ñ các h p ch t flavonoit cho ho t tính ch ng oxi hóa cao. S có m t c a các nhóm phenolic trong h p ch t flavonoid t nhiên ñư c kì v ng có ho t tính ch ng vi sinh v t và s thêm vào các nhóm phenolic s tăng cư ng ho t tính này. Các h p ch t triterpene có ho t tính kháng khu n, kháng viêm, ch ng ung thư, kìm hãm s phát tri n kh i u, ch ng oxi hoá, tr các ch ng b nh v ñư ng hô h p, b nh gan, b nh th p kh p, h n ch sinh t ng h p cholesterol, ñ c bi t là kh năng ch ng l i s phát tri n c a virus HIV. Qua vi c nghiên c u tương quan gi a c u trúc và ho t tính c a các triterpene cho th y s chuy n hoá các v trí C-3, C-7 và C-28 có th t o ra các d n xu t có ho t tính kháng HIV-1 cao hơn và có tính ưu vi t hơn. Ngư i ta cũng nh n th y các d n xu t vòng ña acid C-24, C-28, C-30 có ho t tính m nh hơn các vòng ñơn acid.
18 Ho t tính sinh h c lý thú c a m t vài ch t trong s các ch t phân l p ñư c t 3 cây thu c chi Schefflera ñã ñư c công b . Ví d như rutin, ch t SF8 phân l p t cây Chân chim b t, ñư c bi t là ch t có kh năng ch ng oxi hóa, có ho t tính kháng viêm, ch ng ngh n m ch, h huy t áp, t o ra s giãn cơ trơn trên ru t k t và tá tràng chu t. Ngoài ra, acid 3-O- caffeoylquinic (SF4) và acid 3,5-di-O-caffeoylquinic (SF7) phân l p ñư c t cây Schefflera heptaphylla (L.) Frodin ñã ñư c các nhà khoa h c Trung Qu c phát hi n là có ho t tính ch ng RSV m nh. Trong ñ tài này chúng tôi ch n các ch t SF4, SF6, SF7 và SP2 ñ thăm dò ho t tính sinh h c. K t qu th ho t tính cho th y SP2 (acid 3α- hydroxy-20-demethyl isoaleuritolic-14(15)-en-28,30-dioic) có ho t tính tương ñ i t t v i c 4 dòng t bào ung thư ñem th . T nh ng k t qu nghiên c u trên k t h p v i các tài li u ñã công b có th k t lu n các cây thu c chi Chân chim ñư c s d ng trong y h c dân gian ñ ch a các b nh các b nh v n i khoa, làm m nh gân c t, tr phong, ñau nh c xương kh p, ñau b ng, ch ng suy như c th n kinh, tăng trí nh , kháng viêm, gi m ñau, h s t... là có cơ s khoa h c. Tuy nhiên, ñ xác ñ nh các ch t có ho t tính cao trong cây và thăm dò các ho t tính sinh h c khác c n ph i ti n hành các nghiên c u ti p theo. 4.2. K t qu nghiên c u v qu C x 4.2.1. K t qu th ho t tính sinh h c c a các d ch chi t t qu C x 4.2.1.1. Ho t tính kháng vi sinh v t ki m ñ nh B ng 4.7. K t qu th ho t tính kháng vi sinh v t ki m ñ nh c a các d ch chi t t qu C x Giá tr IC50, (µg/ml) Tên Gram (+) Gram (-) N m TT m u L.f. B.s. S.au. S.ent. E.coli P.aeru C.allbi cans 1 LCQ.N > 256 > 256 209.71 > 256 > 256 > 256 > 256 2 LCQ.E > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 3 LCQ.M > 256 > 256 46.77 > 256 > 256 > 256 > 256 K t qu b ng 4.7 cho th y d ch chi t qu C x trong MeOH (LCQ.M) và d ch chi t qu C x trong n–hexan (LCQ.N) có ho t tính c ch sinh trư ng ñ i v i vi khu n Gram (+) Staphylococcus aureus v i n ng ñ c ch IC50 là 46,77 và 209,71 µg/ml tương ng. D ch chi t còn l i không có ho t tính ñ i v i các vi sinh v t ñư c th .
19 4.2.1.2. Ho t tính ch ng oxi hoá B ng 4.8. K t qu th ho t tính ch ng oxi hoá c a các d ch chi t t qu C x N ng ñ ch t th % c ch ho t ñ ng c a enzim (µg/ml) LCQ.N LCQ.E LCQ.M 128 8 7 82 32 0 4 36 8 0 0 23 2 0 0 9 0,5 0 0 0 IC50 (µg/ml) > 128 > 128 61,22 K t qu b ng 4.8 cho th y d ch chi t MeOH qu C x có ho t tính c ch ho t ñ ng c a enzim peroxydaza v i n ng ñ c ch IC50 là 61,22 µg/ml. Các d ch chi t còn l i không có ho t tính này. 4.2.1.3. Ho t tính gây ñ c t bào B ng 4.9. K t qu th ho t tính gây ñ c t bào c a các d ch chi t t qu C x S TT IC50 (µg/ml) Tên m u KB LU MCF–7 Hep. G2 1 LCQ.N > 128 > 128 > 128 > 128 2 LCQ.E > 128 > 128 > 128 > 128 3 LCQ.M 68,04 > 128 88,30 101,25 T b ng 4.9 cho th y d ch chi t qu C x trong MeOH có ho t tính v i 3 dòng t bào ung thư th nghi m là: KB (ung thư bi u mô), MCF–7 (ung thư vú) và Hep.G2 (ung thư gan) v i giá tr IC50 l n lư t là: 68,04; 88,30 và 101,25 µg/ml tương ng. Các d ch chi t còn l i không có ho t tính c ch các dòng t bào ung thư th nghi m. 4.2.2. Các h p ch t phân l p ñư c t qu cây C x Sơ ñ phân l p 4 ch t t LC1 ñ n LC4 ñư c trình bày trên hình 3.5. B n ch t này l n ñ u tiên ñư c phân l p t chi C . OCH3 3' OH 4' 2' 8 5' HO O 7 9 2 1' OCH3 6' 10 6 4 3 5 OH O LC2 : stigmast -5, 22-dien- LC1: Tricin β−O-D-glucopyranoside β− 3β−
20 LC3: Salicin LC4: Saccharose Ch t LC1 (tricin) Ch t LC1 là tinh th hình kim, màu vàng, ñi m nóng ch y 290-291oC. Ph h ng ngo i IR (hình 4.20) LC1 có ñ nh h p th c a nhóm OH t do (3597 cm-1) và OH liên k t hydro (3335 cm-1), carbonyl (1657 cm-1) và liên k t C-O-C (1172 cm-1. Ph ESI-MS (hình 4.21) có pic ion âm v i m/z [M–H]- = 329 → M = 330 phù h p v i CTPT là C17H14O7. Hình 4.20. Ph IR c a LC1 trong KBr Hình 4.21. Ph MS c a LC1 Ph H-NMR (hình 4.22) có m t singlet c a 6H t i δH = 3,88. Vùng 1 nhân thơm và olefin có 4 c m tín hi u bao g m: 1 doublet t i δH 6,20 (1H, J = 2,09 Hz); 1 doublet t i δH 6,55 (1H, J = 2,09 Hz) ch ng t có 2 proton v trí meta v i nhau trong nhân thơm, m t singlet δH 6,97 (1H); m t singlet δH 7,32 (2H) ch ng t có s ñ i x ng trong m t vòng benzen th b n l n. Ngoài ra còn có m t singlet δH 12,95 c a m t proton phenolic có liên k t c u hydro. Ph 13C-NMR (hình 4.23) cho k t qu phù h p v i s li u t ph 1H- NMR v i 17 tín hi u carbon. Ph DEPT cho th y 2 nhóm OCH3 (tín hi u trùng nhau) v i δC = 56,35; 5 nhóm CH, trong ñó có 2 nhóm tín hi u trùng nhau t i δC = 104,38; 10 carbon b c 4, trong ñó có 2 carbon có tín hi u trùng nhau t i δC = 148,17. Các s li u trên cho th y LC1 là m t flavon có vòng B th ñ i x ng và trong các nhóm th có 2 nhóm OCH3.