Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay của thân rễ hai loài: củ gấu (cyperus rotundusl.) và củ gấu biển (cyperus stoloniferus retz.)

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

89
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nhiệm vụ của luận án: Nghiên cứu thành phần hóa học: phân lập các hợp chất sạch từ hai loài củ gấu và củ gấu biển bằng các phương pháp sắc ký, xác định cấu trúc hóa học các chất tách được bằng các phương pháp phổ kết hợp; nghiên cứu sắc ký dấu vân tay: xây dựng dữ liệu vân tay sắc ký của củ gấu, củ gấu biển trên cơ sở các chỉ thị hóa học, xác định hàm lượng một số hoạt chất chính trong các mẫu củ gấu, củ gấu biển và dược liệu Hương phụ thu thập ở những địa điểm khác nhau.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay của thân rễ hai loài: củ gấu (cyperus rotundusl.) và củ gấu biển (cyperus stoloniferus retz.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ SẮC KÝ DẤU VÂN TAY CỦA THÂN RỄ HAI LOÀI: CỦ GẤU (CYPERUS ROTUNDUS L.) VÀ CỦ GẤU BIỂN (CYPERUS STOLONIFERUS RETZ.) Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 62440114 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2016
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Trần Thượng Quảng 2. TS. Nguyễn Tiến Đạt Phản biện 1: GS. TS. Phạm Quốc Long Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Hải Nam Phản biện 3: GS.TSKH. Phan Tống Sơn Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …….. giờ, ngày ….. tháng ….. năm ……… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam
I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Mở đầu Việt Nam là một trong những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời với việc sử dụng các loại thảo dược trong phòng chữa bệnh, tăng cường sức khoẻ. Một trong những dược liệu được sử dụng rộng rãi là vị thuốc Hương phụ. Dược liệu Hương phụ được chế biến từ thân rễ của loài củ gấu (Cyperus rotundus L.). Nhưng hiện nay, để phục vụ cho nhu cầu sử dụng trong nước và xuất khẩu, vị thuốc có tên là “hương phụ” ở Việt Nam, chủ yếu được khai thác từ loài củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.). Tổ chức Y tế Thế giới và Bộ Y tế nước ta đã có các quy định về việc nhận dạng dược liệu cổ truyền từ nguyên liệu là thực vật với việc xây dựng các tiêu chuẩn từ nhận dạng cây, các bộ phận sử dụng đến việc đảm bảo chất lượng trong quá trình chuẩn bị nguyên liệu hay sản phẩm cuối cùng. Nếu không xác định được hoạt chất thì cần phải có dấu vân tay sắc ký để xác định chất hoặc hỗn hợp các chất. Chính vì vậy tác giả lựa chọn 2 loài thực vật trên làm đối tượng nghiên cứu của luận án: 2. Nhiệm vụ của luận án - Nghiên cứu thành phần hóa học: phân lập các hợp chất sạch từ hai loài củ gấu và củ gấu biển bằng các phương pháp sắc ký, xác định cấu trúc hóa học các chất tách được bằng các phương pháp phổ kết hợp. - Nghiên cứu sắc ký dấu vân tay: xây dựng dữ liệu vân tay sắc ký của củ gấu, củ gấu biển trên cơ sở các chỉ thị hóa học, xác định hàm lượng một số hoạt chất chính trong các mẫu củ gấu, củ gấu biển và dược liệu Hương phụ thu thập ở những địa điểm khác nhau. 3. Ý nghĩa khoa học và những đóng góp của luận án 3.1. Ý nghĩa khoa học Luận án đã đóng góp những hiểu biết mới về thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay của 2 loài thực vật: củ gấu, củ gấu biển ở Việt Nam. Ứng dụng những phương pháp vật lý hiện đại trong nghiên cứu cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ. 3.2. Những đóng góp mới của luận án Hai loài củ gấu và củ gấu biển ở Việt Nam lần đầu được nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và dấu vân tay sắc ký. 3.2.1. Về thành phần hóa học 1
● Từ củ gấu (Cyperus rotundus L.) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 15 hợp chất là ()-3,5,6,7,8,4- hexahydroxyflavane (CR1), (+)-Catechin (CR2), Eriodictyol (CR3), Luteolin (CR4), 7,4-dihydroxy-5,3-dimethoxyflavone (CR5), Hovetrichoside C (CR6), Piceatannol (CR7), Resveratrol (CR8), trans-Scirpusin A (CR9), trans-Scirpusin B (CR10), Cassigarol E (CR11), Cyperusol C (1 ,4-dihydroxyeudesman-11- ene) (CR12), 1 ,4-dihydroxyeudesman-11-ene (CR13), 5,7- dihydroxychromone (CR14), (+)-lyoniresinol 3a-O- -D-glucoside (CR15). Trong đó, hợp chất ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (CR1) là hợp chất mới. ● Từ củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 12 hợp chất, đó là (S)-5,5,7- trihydroxy-2,4-dimethoxy-6-methylflavanone (CS1), Rengasin (CS2), -Mangostin (CS3), ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (CS4), (+)-Catechin (CS5), Eriodictyol (CS6), Luteolin (CS7), Piceatannol (CS8), Resveratrol (CS9), trans-Scirpusin A (CS10), trans-Scirpusin B (CS10), Cyperusol C (1 ,4-dihydroxyeudesman- 11-ene) (CS12). Trong số 12 hợp chất trên thì hợp chất CS1 ((S)- 5,5,7-trihydroxy-2,4-dimethoxy-6-methylflavanone) là hợp chất mới.  Trong số 12 chất phân lập từ củ gấu biển này có 9 hợp chất trùng với các chất phân lập được từ củ gấu. 3.2.2. Về sắc ký dấu vân tay: - So sánh thành phần hoá học của 2 loài C. rotundus và C. stoloniferus dựa theo kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất sạch kết hợp với phân tích trên hệ thống sắc ký HPTLC và HPLC. - Thiết lập được các điều kiện phân tích dấu vân tay sắc ký bằng HPLC. Đánh giá độ tương đồng giữa các mẫu nghiên cứu trên kỹ thuật HPLC. Kết quả cho thấy có độ tương đồng cao của các mẫu thân rễ củ gấu biển lấy từ các địa phương khác nhau (từ 0,9424 đến 0,9903). Xác định vùng trên sắc ký đồ (từ phút thứ 8 đến phút thứ 20) cho việc nhận dạng dấu vân tay sắc ký để có thể phân biệt hai loài. - Xây dựng được điều kiện định lượng 7 thành phần hoạt chất trong đối tượng nghiên cứu trên hệ thống HPLC bằng việc sử dụng các chất sạch đã phân lập được làm chất đối chứng. 2
4. Bố cục của luận án Luận án dày 146 trang với 34 bảng số liệu, 101 hình và 174 tài liệu tham khảo được trình bày như sau: Mục lục, Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt, Danh mục các bảng, Danh mục các hình ảnh, đồ thị. Mở đầu (2 trang). Chương 1: Tổng quan (33 trang). Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (4 trang). Chương 3: Thực nghiệm và Kết quả (17 trang). Chương 4: Kết quả và Bàn luận (72 trang). Kết luận và kiến nghị (2 trang). Danh mục các công trình liên quan đến luận án (1 trang) và phần tài liệu tham khảo (15 trang), ngoài ra luận án còn có phần phụ lục gồm các phổ của các hợp chất phân lập được, kết quả phân tích sắc ký dấu vân tay. II. NỘI DUNG LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Giới thiệu sơ lược về thực vật họ Cói (Cyperaceae). Giới thiệu về chi Cyperus L., các nghiên cứu về công dụng, hoạt tính sinh học, thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay của chi Cyperus L. Giới thiệu sơ lược về củ gấu và củ gấu biển. Các nghiên cứu về công dụng, hoạt tính sinh học, thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay tại Việt Nam và trên thế giới của củ gấu và củ gấu biển. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Củ gấu (Cyperus rotundus L.) được thu hái tại Đông Anh, Hà Nội và củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) được thu hái tại Tiền Hải, Thái Bình. Các mẫu được giám định bởi PGS.TS.Trần Huy Thái. Mẫu nghiên cứu dấu vân tay sắc ký bao gồm 06 mẫu củ gấu, 06 mẫu củ gấu biển và 04 mẫu dược liệu Hương phụ được thu thập vào tháng 3 năm 2015 từ các địa điểm khác nhau. 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất Mẫu thân rễ củ gấu và củ gấu biển được sơ chế, phơi khô trong bóng râm, xay nhỏ, chiết siêu âm với methanol. Dịch chiết cô cạn dưới áp suất giảm thu được cặn chiết methanol. Hòa cặn chiết với nước, chiết phân bố cặn chiết thân rễ củ gấu bằng n-hexane, cặn chiết thân rễ củ gấu biển bằng chloroform sau đó là ethyl acetate thu được các 3
cặn chiết n-hexane, chloroform tương ứng, cặn chiết ethyl acetate và cặn nước. Sắc ký cột được tiến hành với pha tĩnh là Silica gel 60 hoặc pha đảo RP-18, nhựa trao đổi ion Diaion HP-20, Sephadex LH-20. 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất Sử dụng các phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI- MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), và hai chiều (HSQC, HMBC, NOESY). 2.4. Phương pháp xây dựng dấu vân tay sắc ký Sử dụng các phương pháp sắc ký lớp mỏng và phân tích trên sắc ký lỏng hiệu năng cao. CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Chiết và phân lập chất từ thân rễ củ gấu Hình 3.1. Sơ đồ chiết phân bố mẫu thân rễ củ gấu 4
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập cặn chiết n-hexane của thân rễ củ gấu. Hình 3.3. Sơ đồ phân lập cặn chiết ethyl acetate của thân rễ củ gấu. 5
Hình 3.4. Sơ đồ phân lập cặn nước của thân rễ củ gấu. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập từ củ gấu Hợp chất CR1: ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (Hợp chất mới) Chất bột màu trắng. SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol 5:1 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%. [] 25 D = 0,0 (c 0,1, MeOH). IR max(KBr): 3400, 1620, 1530, 1470, 1150 cm-1. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD):  7,23 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2',6'), 6,80 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3',5'), 4,60 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-2), 3,99 (1H, m, H-3), 2,89 (1H, dd, J = 5,5, 16,5 Hz, Hb-4), 2,52 (1H, dd, J = 8,0, 16,5 Hz, Ha-4). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD):  82,8 (C-2), 68,8 (C-3), 28,8 (C-4), 158,3 (C-5), 157,7 (C-6), 158,3 (C-7), 157,4 (C-8), 156,9 (C-9), 100,9 (C-10), 131,5 (C-1'), 129,6 (C-2'), 116,0 (C-3'), 156,9 (C-4'), 116,0 (C-5'), 129,6 (C-6'). HR-ESI-MS m/z: 307,0810 [M + H]+ (calcd. 307,0818 cho C15H15O7). 6
Hợp chất CR2: (+)-catechin Tinh thể màu trắng, mp. 173-175oC. SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroform:methanol:nước 5:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254 nm và thuốc thử H2SO4 10%. [] 25 D = +17 (c 0,1, CH3COCH3). 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6):  6,72 (1H,br s, H-2'), 6,68 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,59 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6'), 5,89 (1H, br s, H- 6), 5,70 (1H, br s, H-8), 4,48 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2), 3,83 (1H, m, H-3), 2,64 (1H, dd, J = 5,0, 16,0 Hz, Ha-4), 2,35 (1H, dd, J = 8,0, 16,0 Hz, Hb-4). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  81,1 (C-2), 66,5 (C-3), 27,9 (C- 4), 156,3 (C-5), 95,3 (C-6), 156,6 (C-7), 94,1 (C-8), 155,5 (C-9), 99,3 (C-10), 130,8 (C-1'), 114,6 (C-2'), 145,0 (C-3'), 145,0 (C-4'), 115,3 (C-5'), 118,6 (C-6'). ESI-MS (positive) m/z 291 [M+H]+. Hợp chất CR3: eriodictyol Chất bột màu vàng nhạt. SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol 4:1 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD):  6,93 (1H, s, H-2'), 6,80 (2H, m, H- 5', H-6'), 5,85 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 5,83 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- 6), 5,28 (1H, dd, J = 3,0, 12,5 Hz, H-2), 3,05 (1H, dd, J = 13,0, 17,0 Hz, Hb-3), 2,69 (1H, dd, J = 3,0, 17,0 Hz, Ha-3). 13 C-NMR (125MHz, CD3OD):  80,4 (C-2), 44,0 (C-3), 197,6 (C-4), 165,3 (C-5), 97,0 (C-6), 168,6 (C-7), 96,2 (C-8), 164,7 (C-9), 103,2 (C-10), 131,7 (C-1'), 114,7 (C-2'), 146,4 (C-3'), 146,8 (C-4'), 116,2 (C-5'), 119,2 (C-6'). ESI-MS (positive) m/z 289 [M+H]+. Hợp chất CR4: luteolin Chất bột màu vàng. SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol:nước 10:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254 nm và thuốc thử H2SO4 10%. 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6):  7,26 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6'), 7,24 (1H, br s, H-2'), 6,65 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5'), 6,38 (1H, br s, H-6), 6,19 (1H, br s, H-8), 5,93 (1H, s, H-3). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  166,4 (C-2), 102,1 (C-3), 181,2 (C-4), 161,3 (C-5), 99,3 (C-6), 163,7 (C-7), 94,1 (C-8), 157,4 (C-9), 7
102,7 (C-10), 120,4 (C-1'), 112,8 (C-2'), 146,2 (C-3'), 151,2 (C-4'), 116,0 (C-5'), 118,8 (C-6'). ESI-MS (positive) m/z 287 [M+H]+. Hợp chất CR5: 7,4-dihydroxy-5,3-dimethoxyflavone Chất bột màu vàng. SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol:nước 10:1,5:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254, 366 nm và thuốc thử H2SO4 10%. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD):  7,48 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H- 6'), 7,45 (1H, d, J = 2,0, H-2'), 6,94 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,58 (1H, d, J = 2,0, H-8), 6,57 (1H, s, H-3), 6,43 (1H, d, J = 2,0, H-6), 3,97 (3H, s, OCH3), 3,91 (3H, s, OCH3). ESI-MS (positive) m/z 315 [M+H]+. Hợp chất CR6: hovetrichoside C Chất bột màu vàng. SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroform:methanol:nước 3,5:1:0,01 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%. [] 25 D = -18,0 (c 0,1, MeOH). 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6):  6,92 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2', H- 6'), 6,54 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3', H-5'), 5,99 (1H, s, H-5), 5,91 (1H, s, H-7), 4,95 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1''), 3,48-3,62 (2H, m, H-6''), 3,25 (1H, m, H-2''), 3,25 (1H, m, H-3''), 3,25 (1H, m, H-5''), 3,19 (1H, m, H-4''), 2,90 (2H, m, H-b). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  105,5 (C-2), 192,3 (C-3), 101,3 (C-3a), 156,7 (C-4), 95,1 (C-5), 169,0 (C-6), 91,5 (C-7), 171,8 (C- 7a), 40,4 (C-b), 124,1 (C-1'), 131,2 (C-2', C-6'), 114,6 (C-3', C-5'), 155,8 (C-4'), 99,5 (C-1), 72,8 (C-2), 76,7 (C-3), 69,2 (C-4), 77,1 (C-5), 60,3 (C-6). ESI-MS (positive) m/z 451 [M+H]+. Hợp chất CR7: piceatannol Chất bột màu trắng. SKLM pha thường: Rf = 0,3 (chloroform:methanol 4:1 v/v), hiện vết bằng UV 254, 366 nm và thuốc thử H2SO4 10%. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD):  6,99 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,92 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-), 6,85 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6), 6,77 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-), 6,76 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,45 (2H, d, J = 2,5 Hz, H-2, H-6), 6,17 (1H, t, J = 2,5 Hz, H-4). 8
13 C-NMR (125 MHz, CD3OD):  141,2 (C-1), 105,7 (C-2), 159,6 (C-3), 102,6 (C-4), 159,6 (C-5), 105,7 (C-6), 129,7 (C-), 127,0 (C- ), 131,0 (C-1'), 116,4 (C-2'), 146,4 (C-3'), 146,5 (C-4'), 113,8 (C- 5'), 120,1 (C-6'). ESI-MS (positive) m/z 245 [M+H]+. Hợp chất CR8: resveratrol Chất bột màu trắng đục. SKLM pha thường: Rf = 0,40 (chloroform:methanol:nước 6:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254, 366 nm và thuốc thử H2SO4 10%. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD):  7,35 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, H- 5), 6,95 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-), 6,79 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-), 6,77 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, H-6), 6,46 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, H- 6), 6,18 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4). ESI-MS (positive) m/z 229 [M+H]+. Hợp chất CR9: trans-scirpusin A Chất bột màu trắng đục. SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroform:methanol:nước 4:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254, 366 nm và thuốc thử H2SO4 10%. [] 25 D = +9,0 (c 0,1, MeOH). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD):  7,06 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, H-6), 6,83 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-7), 6,79 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-10'), 6,76 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-13'), 6,69 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, H-5), 6,67 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-14'), 6,65 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-14), 6,58 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-8), 6,28 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-12), 6,21 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-4), 6,19 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, H-6), 5,32 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-8'), 4,36 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-7'). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD):  130,3 (C-1), 128,7 (C-2), 116,3 (C-3), 158,3 (C-4), 116,3 (C-5), 128,7 (C-6), 130,4 (C-7), 123,7 (C- 8), 136,9 (C-9), 120,0 (C-10), 162,7 (C-11), 96,8 (C-12), 159,6 (C- 13), 104,4 (C-14), 147,4 (C-1'), 107,4 (C-2'), 159,9 (C-3'), 102,2 (C- 4'), 159,9 (C-5'), 107,4 (C-6'), 58,2 (C-7'), 94,8 (C-8'), 134,7 (C-9'), 113,7 (C-10'), 146,3 (C-11'), 146,4 (C-12'), 116,3 (C-13), 118,5 (C- 14), ESI-MS (positive) m/z 471 [M+H]+. 9
Hợp chất CR10: trans-scirpusin B Chất bột màu vàng nâu. SKLM pha thường: Rf = 0,33 (chloroform:methanol:nước 4:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254, 366 nm và thuốc thử H2SO4 10%. [] 25 D = +3,2 (c 0,1, MeOH). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD):  6,80 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7), 6,78 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,76 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,72 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-10'), 6,65 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-13', H-14'), 6,64 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-14), 6,59 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6), 6,55 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-8), 6,28 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-12), 6,20 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4), 6,18 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2,H-6), 5,30 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-8'), 4,36 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-7'). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD):  130,9 (C-1), 114,0 (C-2), 146,4 (C-3), 146,5 (C-4), 116,3 (C-5), 119,8 (C-6), 130,8 (C-7), 123,6 (C- 8), 136,9 (C-9), 120,0 (C-10), 162,7 (C-11), 96,8 (C-12), 159,6 (C- 13), 104,4 (C-14), 147,6 (C-1'), 107,3 (C-2'), 159,8 (C-3'), 102,2 (C-4'), 159,8 (C-5'), 107,3 (C-6'), 58,0 (C-7'), 94,8 (C-8'), 134,9 (C- 9'), 113,6 (C-10'), 146,2 (C-11'), 146,3 (C-12'), 116,2 (C-13), 118,4 (C-14). ESI-MS (positive) m/z 487 [M+H]+. Hợp chất CR11: cassigarol E Chất bột màu vàng. SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroform:methanol:nước 3,5:1:0,015 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%. [] 25 D = +14,0 (c 0,1, MeOH). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD):  7,15 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-10'), 7,08 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-14’), 6,97 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-7'), 6,95 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-13'), 6,86 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-8'), 6,67 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,66 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 6,48 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2,6), 6,48 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,19 (1H, t, J = 2,0 Hz, H- 4), 6,17 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-12), 6,12 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-10, H- 14), 4,74 (2H, d, J = 2,5 Hz, H-7, H-8). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD):  129,0 (C-1), 115,6 (C-2), 146,1 (C- 3), 146,6 (C-4), 115,8 (C-5), 120,7 (C-6), 81,8 (C-7), 82,2 (C-8), 140,1 (C-9), 107,4(C-10), 159,2 (C-11), 103,6 (C-12), 159,2 (C-13), 107,4 (C-14), 141,0 (C-1'), 105,9 (C-2'), 159,6 (C-3'), 102,9 (C-4'), 159,6 (C- 10
5'), 105,9 (C-6'), 128,4 (C-7'), 129,4 (C-8'), 132,6 (C-9'), 115,9 (C-10'), 145,4 (C-11'), 145,0 (C-12'), 118,1 (C-13), 121,0 (C-14). ESI-MS (positive) m/z 487 [M+H]+. Hợp chất CR12: cyperusol C (1 ,4-dihydroxyeudesm-11-ene) Chất bột màu trắng. SKLM pha thường: Rf = 0,3 (n-hexane:ethyl acetate 5:1 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%. [] 25 D = -42,0 (c 0,1, MeOH). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3):  4,72 (2H, m, H-12), 3,32 (1H, dd, J = 4,0, 11,0 Hz, H-1), 1,75 (3H, s, H-13), 1,13 (3H, s, H-15), 0,89 (3H, s, H-14). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3):  79,4 (C-1), 28,5 (C-2), 40,8 (C-3), 71,6 (C-4), 53,0 (C-5), 25,8 (C-6), 45,7 (C-7), 26,4 (C-8), 40,5 (C- 9), 39,0 (C-10), 150,3 (C-11), 108,3 (C-12), 21,0 (C-13), 13,0 (C- 14), 22,8 (C-15). ESI-MS (positive) m/z 239 [M + H]+. Hợp chất CR13: 1β,4β-dihydroxyeudesm-11-ene Tinh thể hình kim màu trắng, mp. 171-173oC. SKLM pha thường: Rf = 0,3 (chloroform:ethyl acetate:methanol 4:1:0,1 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%. [] 25 D = -16,0 (c 0,1, MeOH). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3):  4,73 (1H, br s, Hb-12), 4,71 (1H, br s, Ha-12), 3,26 (1H, dd, J = 4,0, 11,5 Hz, H-1), 1,75 (3H, s, H-13), 1,05 (3H, s, H-14), 1,15 (3H, s, H-15). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3):  79,6 (C-1), 25,6 (C-2), 39,3 (C-3), 71,3 (C-4), 50,4 (C-5), 26,4 (C-6), 46,1 (C-7), 26,8 (C-8), 39,3 (C- 9), 38,9 (C-10), 150,4 (C-11), 108,5 (C-12), 20,7 (C-13), 12,5 (C- 14), 29,9 (C-15). ESI-MS (positive) m/z 239 [M + H]+. Hợp chất CR14: 5,7-dihydroxychromone Chất bột màu trắng. SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform: methanol:nước 6:1,5:0,01 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%. 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6):  8,17 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-2), 6,36 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,26 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-3), 6,20 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  157,3 (C-2), 110,4 (C-3), 181,2 (C-4), 161,5 (C-5), 98,9 (C-6), 164,2 (C-7), 93,9 (C-8), 157,7 (C-9), 104,4 (C-10). ESI-MS (positive) m/z 179 [M+H]+. 11
Hợp chất CR15: (+)-lyoniresinol 3a-O- -D-glucoside Chất bột màu trắng. SKLM pha thường: Rf = 0,3 (chloroform: methanol:nước 5:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254 nm và thuốc thử H2SO4 10%. 25 [] D = +21,4 (c 0,1, MeOH). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD):  6,60 (1H, s, H-8), 6,44 (2H, s, H- 2,6), 4,43 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-4), 4,29 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1), 3,84-3,92 (2H, m, H6), 3,87 (3H, s, 7-OCH3), 3,84 (1H, m, H4), 3,76 (6H, s, 3',5'-OCH3), 3,67 (1H, m, Hb-2a), 3,66 (1H, m, H5), 3,56 (1H, m, Ha-2a), 3,47 (1H, m, Ha-3a), 3,36 (3H, s, 5-OCH3), 3,32 (1H, m, Hb-3a), 3,28 (1H, m, H3), 3,24 (1H, m, H2), 2,74 (1H, dd, J = 5,0, 15,0 Hz, Ha-1), 2,63 (1H, dd, J = 11,5, 15,0 Hz, Hb-1), 2,10 (1H, m, H-3), 1,72 (1H, m, H-2). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD):  33,8 (C-1), 40,6 (C-2), 66,2 (C- 2a), 46,6 (C-3), 71,5 (C-3a), 42,7 (C-4), 148,6 (C-5), 138,9 (C-6), 147,5 (C-7), 107,8 (C-8), 130,2 (C-9), 126,4 (C-10), 139,3 (C-1'), 106,9 (C-2'), 148,9 (C-3'), 134,5 (C-4'), 148,9 (C-5'), 106,9 (C-6'), 104,8 (C-1''), 75,1 (C-2''), 78,2 (C-3''), 71,6 (C-4''), 77,9 (C-5''), 62,8 (C-6''), 60,2 (5-OCH3), 56,6 (7-OCH3), 56,8 (3',5'-OCH3). ESI-MS (positive) m/z 583 [M+H]+. 3.2. Chiết và phân lập các hợp chất từ thân rễ củ gấu biển Hình 3.5. Sơ đồ chiết phân bố mẫu thân rễ củ gấu biển 12
Hình 3.6. Sơ đồ phân lập cặn chiết chloroform của thân rễ củ gấu biển. Hình 3.7. Sơ đồ phân lập cặn chiết ethyl acetate của thân rễ củ gấu biển. 13
Hình 3.8. Sơ đồ phân lập cặn nước của thân rễ củ gấu biển. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ củ gấu biển. Hợp chất CS1: (S)-5,5,7-trihydroxy-2,4-dimethoxy-6- methylflavanone (Hợp chất mới) Chất bột màu vàng. SKLM pha thường: Rf = 0,5 (chloroform- methanol-nước 5:1:0,05 v/v), hiện vết bằng UV 254 nm và thuốc thử H2SO4 10%. 25 [] D = – 88,0 (c 0,1, MeOH). CD (c 1,4 × 10–3 M, MeOH): λmax(∆) nm 295 (–13,7), 345 (+2,1). IR max(KBr): 3393, 1637, 1516, 1303, 1158 cm-1. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD):  7,00 (1H, s, H-6'), 6,69 (1H, s, H-3'), 5,97 (1H, s, H-8), 5,60 (1H, dd, J = 3,0, 13,0 Hz, H-2), 3,90 (3H, s, OCH3), 3,83 (3H, s, OCH3), 2,95 (1H, dd, J = 13,0, 17,0 Hz, Hb-4), 2,68 (1H, dd, J = 3,5, 17,5 Hz, Ha-4), 1,97 (3H, s, CH3). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD):  75,2 (C-2), 43,4 (C-3), 198,0 (C- 4), 162,6 (C-5), 105,3 (C-6), 166,1 (C-7), 95,2 (C-8), 162,6 (C-9), 103,0 (C-10), 120,5 (C-1'), 151,2 (C-2'), 98,7 (C-3'), 149,5 (C-4'), 14
141,4 (C-5'), 114,5 (C-6'), 6,9 (6-CH3), 56,9 (2'-OMe), 56,6 (4'- OMe). HR-ESI-MS m/z: 347,1109 [M + H]+ (calcd. 347,1130 cho C18H19O7). Hợp chất CS2: 3,4,6-trihydroxy-4-methoxyaurone Chất bột màu vàng. SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform- methanol-nước 10:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254, 366 nm và thuốc thử H2SO4 10%. 1 H-NMR (500 MHz, acetone-d6): δ 7,52 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’), 7,27 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6’), 6,90 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’), 6,51 (1H, s, H-10), 6,40 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 6,24 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 3,89 (3H, s, 4-OCH3). 13 C-NMR (125 MHz, acetone-d6): δ 147,3 (C-2), 179,8 (C-3), 160,7 (C-4), 95,2 (C-5), 168,1 (C-6), 92,2 (C-7), 169,3 (C-8), 104,9 (C-9), 110,7 (C-10), 125,6 (C-1'), 118,4 (C-2'), 146,1 (C-3'), 147,9 (C-4'), 116,4 (C-5'), 125,1 (C-6'), 56,3 (4-OCH3). ESI-MS (positive) m/z 301 [M+H]+. Hợp chất CS3: -mangostin Chất bột màu vàng nhạt. SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroform- methanol 15:1 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%. 1 H-NMR (500 MHz, acetone-d6):  13,78 (1H, s, C-5-OH), 9,55 (2H, brs, C-2-OH, C-7-OH), 6,81 (1H, s, H-1), 6,38 (1H, s, H-8), 5,27 (1H, m, H-2, H-2), 4,11 (2H, d, J = 6,5, H-1), 3,79 (3H, s, 3-OCH3), 3,33 (2H, d, J = 7,0, H-1), 1,82 (3H, s, H-4), 1,78 (3H, s, H-4), 1,65 (3H, s, H-5), 1,64 (3H, s, H-5). 13 C-NMR (125 MHz, acetone-d6):  102,6 (C-1), 157,3 (C-1a), 156,1 (C-2), 144,4 (C-3), 138,0 (C-4), 111,9 (C-4a), 161,6 (C-5), 103,6 (C-5a), 111,0 (C-6), 162,8 (C-7), 93,1 (C-8), 155,6 (C-8a), 182,8 (C-10), 26,8 (C-1), 124,7 (C-2), 131,3 (C-3), 18,2 (C-4), 25,8 (C-5), 21,9 (C-1), 123,4 (C-2), 131,3 (C-3), 17,8 (C-4), 25,8 (C-5), 61,3 (3-OCH3). ESI-MS (positive) m/z 411 [M+H]+. Hợp chất CS4 (trùng với CR1): ()-3,5,6,7,8,4- hexahydroxyflavane Chất bột màu trắng. SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol 5:1 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%. ESI-MS m/z: 307 [M + H]+. 15
Hợp chất CS5 (trùng với CR2): (+)-catechin Tinh thể màu trắng, mp. 173-175oC. SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroform:methanol:nước 5:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254 nm và thuốc thử H2SO4 10%. ESI-MS (positive) m/z 291 [M+H]+. Hợp chất CS6 (trùng với CR3): eriodictyol Chất bột màu vàng nhạt. SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol 4:1 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%. ESI-MS (positive) m/z 289 [M+H]+. Hợp chất CS7 (trùng với CR4): luteolin Chất bột màu vàng. SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol:nước 10:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254 nm và thuốc thử H2SO4 10%. ESI-MS (positive) m/z 287 [M+H]+. Hợp chất CS8 (trùng với CR7): piceatannol Chất bột màu trắng. SKLM pha thường: Rf = 0,3 (chloroform:methanol 4:1 v/v), hiện vết bằng UV 254, 366 nm và thuốc thử H2SO4 10%. ESI-MS (positive) m/z 245 [M+H]+. Hợp chất CS9 (trùng với CR8): resveratrol Chất bột màu trắng đục. SKLM pha thường: Rf = 0,40 (chloroform:methanol:nước 6:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254, 366 nm và thuốc thử H2SO4 10%. ESI-MS (positive) m/z 229 [M+H]+. Hợp chất CS10 (trùng với CR9): trans-scirpusin A Chất bột màu trắng đục. SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroform:methanol:nước 4:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254, 366 nm và thuốc thử H2SO4 10%. ESI-MS (positive) m/z 471 [M+H]+. Hợp chất CS11 (trùng với CR10): trans-scirpusin B Chất bột màu vàng nâu. SKLM pha thường: Rf = 0,33 (chloroform:methanol:nước 4:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254, 366 nm và thuốc thử H2SO4 10%. ESI-MS (positive) m/z 487 [M+H]+. Hợp chất CS12 (trùng với CR12): cyperusol C (1 ,4- dihydroxyeudesm-11-ene) Chất bột màu trắng. SKLM pha thường: Rf = 0,3 (n-hexane:ethyl acetate 5:1 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%. ESI-MS (positive) m/z 239 [M + H]+. 16
3.3. Phân tích định tính sắc ký dấu vân tay Chuẩn bị dung dịch thử: mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi. Cân 5,00 g bột mẫu đã sấy khô, nghiền nhỏ, thêm 25ml metanol, lắc siêu âm 30 phút ở nhiệt độ 40oC, lọc (chiết 3 lần mỗi lần 25ml metanol). Gộp các dịch lọc, loại bớt dung môi bằng áp suất giảm ở nhiệt độ 50oC rồi điều chỉnh đến thể tích 50ml được dung dịch phân tích sắc ký. Chuẩn bị mẫu đối chứng: mẫu đối chứng được chuẩn bị bằng cách pha các dung dịch chất chỉ thị gốc có nồng độ 2000µg/ml trong methanol. Các chất chỉ thị gốc được phân tích sắc ký HPTLC với cùng điều kiện phân tích mẫu để xác định giá trị Rf cho từng chất chỉ thị. Từ các dung dịch chỉ thị gốc, tiến hành pha mẫu đối chứng là hỗn hợp các chất chỉ thị có nồng độ 100 µg/ml trong methanol. Kết quả phân tích đặc điểm dấu vân tay của 16 mẫu bằng HPTLC và HPLC được bàn luận trong chương 4. CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1. Các hợp chất phân lập được từ thân rễ củ gấu và củ gấu biển. Từ cặn chiết n-hexane, ethyl acetate và cặn nước của thân rễ củ gấu, sau khi tiến hành kết tinh, sắc kí cột nhiều lần trên cột silica gel, pha đảo, sephadex và diaion, thu được 15 hợp chất CR1-CR15. Các hợp chất này bao gồm: 6 hợp chất thuộc lớp chất flavonoid (CR1-CR6), 6 hợp chất thuộc lớp chất stilbenoid (CR7-CR11), 6 hợp chất khung sesquiterpen (CR12, CR13), 1 hợp chất thuộc lớp chất chromone (CR14), 1 hợp chất lignan (CR15). 17
Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ thân rễ củ gấu. Từ cặn chiết chloroform, ethyl acetate và cặn nước của thân rễ củ gấu biển, sau khi tiến hành kết tinh, sắc kí cột nhiều lần trên cột silica gel, pha đảo, sephadex và diaion, thu được 12 hợp chất CS1- CS12. Các hợp chất này bao gồm: 7 hợp chất thuộc lớp chất flavonoid (CS1-CS7), 4 hợp chất thuộc lớp chất stilbenoid (CS8-CS11), 1 hợp chất khung sesquiterpen (CR12). 18