Luận văn : PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR part 2

Chia sẻ: Sadfaf Asfsggs | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:18

Thêm vào BST

Báo xấu

196
lượt xem 47
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Vì vậy, ngƣời trồng lan phải luôn luôn theo dõi, phát hiện kịp thời và có biện pháp phòng trừ thì mới thu được sản lượng và chất lƣợng tốt (Nguyễn Văn Tới, 2003). 2.2.5. Tình hình sản xuất lan Cymbidium của TP. Đà Lạt và trên thế giới Tại Đà Lạt: Từ năm 1978, Cymbidium Đà Lạt bắt đầu tham gia xuất khẩu sang thị trƣờng Liên Xô, một ít qua Tiệp Khắc.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR part 2

19 Ngoài ra, trên cây hoa lan còn có một số dạng bệnh khác nhƣ bệnh tàn cánh hoa, bệnh thối trắng rễ, bệnh đốm vàng, bệnh thối đen ngọn, bệnh thối hạch, bệnh đốm vòng trên cánh hoa, bệnh đốm nâu trên cánh hoa… Côn trùng gây hại: chủ yếu có mấy loại bao gồm bọ trĩ (Thrips palmi và Dichromothrips Corbetti), nhện đỏ, rệp, sâu hại, ốc sên, nhớt. Côn trùng gây hại thƣờng phát sinh và phát triển trong suốt quá trình nuôi trồng. Vì vậy, ngƣời trồng lan phải luôn luôn theo dõi, phát hiện kịp thời và có biện pháp phòng trừ thì mới thu đƣợc sản lƣợng và chất lƣợng tốt (Nguyễn Văn Tới, 2003). 2.2.5. Tình hình sản xuất lan Cymbidium của TP. Đà Lạt và trên thế giới Tại Đà Lạt: Từ năm 1978, Cymbidium Đà Lạt bắt đầu tham gia xuất khẩu sang thị trƣờng Liên Xô, một ít qua Tiệp Khắc và Singapore, bƣớc đầu 3.000 cành (1978). Có những năm cao điểm lên trên 32.000 cành (1989 – 1990) trên tổng sản lƣợng 65.000 cành. Đến năm 1990, do tình hình biến động ở Đông Âu và Liên Xô, thị trƣờng hoa lan Đà Lạt bị chững lại, chỉ tiêu thụ nội địa và một ít xuất sang thị trƣờng châu Á. Từ năm 1992 – 1998, ngành trồng hoa ở Đà Lạt giảm dần. Số lƣợng hoa lan chỉ còn đủ để tiêu thụ trong nƣớc. Từ năm 1999 đến nay, ngành trồng lan Cymbidium của Đà Lạt mới dần dần hồi phục nhƣng vẫn chƣa đủ để đáp ứng nhu cầu xuất khẩu. Cuối năm 2004, những bông hoa cắt cành đầu tiên của Việt Nam đã bắt đầu xâm nhập thị trƣờng Mỹ thông qua một tập đoàn nhập khẩu hoa National Wide Wholesale, mỗi tuần từ 1.300 – 1.500 cành chủ yếu đến các siêu thị hoa cao cấp ở bang Massachusetts và Ohio. Tuy nhiên bên môi giới vẫn chƣa ký hợp đồng chính thức với công ty trên vì chƣa đánh giá đƣợc nguồn địa lan mà Đà Lạt có thể cung cấp ổn định so với yêu cầu rất lớn từ phía Mỹ. Trên thế giới: Nhu cầu về hoa lan trên thị trƣờng thế giới rất lớn, ngày càng tăng. Năm 1994, Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu cành, từ Singapore 289.000 cành. Hà Lan là quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu. Do trồng trong nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm nhất là Cymbidium. Italia là quốc gia nhập khẩu hoa lan lớn nhất Châu Âu. Năm 1993, Italia nhập 75,3 triệu cành chủ yếu là từ các nƣớc: Thái Lan 64 triệu cành, Hà Lan 10 triệu cành, Singapore 0,75 triệu cành. Đức và Pháp là 2 quốc gia nhập khẩu lan đứng thứ 2 và 3 Châu Âu. Ở Châu Á, Nhật là quốc
20 gia nhập khẩu hoa lan đứng đầu. Theo thống kê tại Thái Lan, Singapore, Malaysia dành 600 ha đất trồng lan để xuất khẩu sang Nhật chủ yếu là Dendrobium, Cymbidium. Thái Lan là nƣớc xuất khẩu hoa lan đứng đầu thế giới, xuất khẩu hơn 50 quốc gia trên thế giới với giá từ 3 – 5 USD/cành, có khi tới 80 – 100 USD/ cành, những giống quý có thể lên tới hàng ngàn USD (Trích Lê Hữu Quang, 2005). 2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora và tác hại của nó 2.3.1. Phân loại: Theo Winslow và ctv (1920), loài Erwinia thuộc: Giới (Kingdom) : Bacteria Ngành (Phylum) : Proteobacteria Lớp (Class) : - Proteobacteria Bộ (Order) : Enterobacteriales Họ (Family) : Enterobacteriaceae Giống (Genus) : Erwinia (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Erwinia ). a b Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Erwinia carotovora. a. Vi khuẩn có dạng hình gậy. b. Lông roi bao quanh thân. (Nguồn: http://www.soc.nii.ac.jp/jssm/Erwinia%20carotovora.jpg ) Loài Erwinia là một thành viên của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, đƣợc chia thành 2 nhóm: nhóm gây thối mềm (soft rot) hay “carotovora” và nhóm gây bệnh héo hoặc tàn rụi cây trồng “non – soft rot” hay “amylovora”. 2.3.2. Erwinia carotovora Erwinia carotovora là tác nhân gây ra bệnh thối mềm (soft rot), một bệnh rất nguy hiểm và tàn phá cây trồng. Nhiều loại thực phẩm có giá trị kinh tế nhƣ khoai tây, cà chua, cải thìa (Chinese cabbages) có thể bị ảnh hƣởng bởi bệnh này. Loài Erwinia carotovora là
21 một đơn vị phân loại phức tạp mà những dòng này thì đa dạng ở những mức độ khác nhau (sinh lý, huyết thanh học, đặc tính di truyền và dãy kí chủ). Erwinia carotovora đƣợc chia thành 5 nhóm phụ (subspecies) gồm: E. c. atroseptica (Eca), E. c. carotovora (Ecc), E. c. betavasculorum (Ecb), E. c. wasabiae (Ecw), E. c. odorifera (Eco) (Seo và ctv, 2001). 2.3.3. Erwinia carotovora subsp. carotovora Phân bố địa lý: Erwinia carotovora subsp. carotovora là một loại vi khuẩn phân bố rộng khắp mà nó là nguyên nhân gây ra bệnh thối mềm trên các loại cây cảnh (ornamental) và cây nông nghiệp (horticultural) khác nhau. Erwinia carotovora subsp. carotovora phân bố rộng khắp cả vùng nhiệt đới và ôn đới, có phổ kí chủ rộng hơn những nhóm phụ khác (Fiori và Schiaffino, 2003). Đặc điểm: hình thái tế bào vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử: vi khuẩn có dạng hình gậy, đơn lẻ hoặc thành từng cặp, có khả năng di động do có lông roi bao quanh và có kích thƣớc trung bình từ 0,6 – 0,7 2 – 2,5 μm. Bằng phƣơng pháp thử các phản ứng sinh hóa đã xác định đƣợc Erwinia carotovora subsp. carotovora: vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi (facultative anaerobe), catalase (+), oxidase (-), Indole (-), hóa lỏng pectate (liquefied pectate) trên môi trƣờng CVP, khử nitrate thành nitrite, không phát sáng trên môi trƣờng KB, phân giải esculine và gelatine nhƣng không phân giải tinh bột, tạo acetoin và H2S nhƣng không tạo urease, tạo phản ứng quỳ sữa (acidized litmus milk), không có khả năng thủy giải arginine hoặc khử sucrose, kháng erythromycin, lên men glucose, chịu đựng đƣợc 5% NaCl và có thể phát triển đƣợc ở 370C, tạo acid từ arabinose, cellobiose, galactose, lactose, mannose, melibiose, ramnose, salicin, threalose, xylose, inositol, manitol và sorbitol. Đối với maltose, - methyl glucoside và adonitol vi khuẩn không tạo acid, có khả năng sử dụng asparagine, acetate, citrate, fumarate, lactate và malate. Đối với alanine, arginine, threonine, valine, glycolate, gluconate, levulinate, nicotinate, adipate, caprate, citraconate, formate, glutarate, malonate và tartrate thì không (Fiori và Schiaffino, 2003). Đƣờng lây nhiễm: Erwinia xâm nhập vào cây thông qua con đƣờng tự nhiên nhƣ khí khổng (stomata) và lỗ vỏ, thân, rễ (lenticles) hoặc thông qua vết thƣơng gây ra bởi côn trùng, động vật ăn cỏ (herbivorus), gió…(Marcos Montesano, 2002).
22 Khả năng gây bệnh: Erwinia carotovora subsp. carotovora là tác nhân gây bệnh cơ hội mà tính độc của nó phụ thuộc vào sự tƣơng tác giữa nó với ký chủ và môi trƣờng. Trong những điều kiện thuận lợi, tác nhân gây bệnh cây biểu hiện những nhân tố độc nhƣ các enzyme ngoại bào (extracellular enzymes). Sự sản xuất các enzyme phân hủy thành tế bào bao gồm: protease, pectinolytic enzymes là enzyme ngoại bào chính liên quan đến sự phát triển của bệnh. Pectinases bao gồm pectate lyase (Pel), pectin lyases (Pnl), polygalacturonases (Peh) và pectin methylesterases (Pme), phá vỡ và sử dụng pectins, gây hƣ hại tế bào và làm mô suy yếu. Theo Darrasse và ctv (1994), một vài pel gen mã hóa pectate lyase đã biết trình tự. Có 3 họ đã đƣợc xác định và giữa chúng có tính tƣơng đồng cao: họ BC (BC family) chứa gen pel chung cho cả Erwinia carotovora và Erwinia chrysanthemi, họ ADE (ADE family) bao gồm những gen chỉ hiện diện trong Erwinia chrysanthemi, nhóm thứ ba tƣơng ứng với gen đƣợc tìm thấy trên một vài dòng Erwinia carotovora và trên vi khuẩn Yersinia pseudotuberculosis (Y family). Cellulases hoạt động trên thành tế bào cây bằng sự thủy phân trong (endohydrolysis) của liên kết 1,4 -β-D- glucosidic trong cellulose, lichenin, β-D-glucan trong ngũ cốc. pH tối ƣu gần bằng 7, cellulases phối hợp với các enzyme ngoại bào khác tấn công thành tế bào sơ cấp và thứ cấp của cây trồng. Tuy nhiên, ngoài các enzyme phân hủy thành tế bào, các nhân tố khác cũng ảnh hƣởng ở giai đoạn sớm, thành lập và xúc tiến sự lây nhiễm, đáp ứng tốt với cơ chế kháng của ký chủ. Các nhân tố này bao gồm tính di động (motility), LPS (lipopolysaccharides), kị sắt (siderophores), gen hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity), NLPs (Nep-1 like protein) (Nep: necrosis and ethylene inducing peptide) và những nhân tố chống lại sự phá hủy của oxy (oxygen damage) hoặc những peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides) (Heidi Hyytiainen, 2005). Triệu chứng: triệu chứng phổ biến rất đặc trƣng cho các loài vi khuẩn Erwinia carotovora là hiện tƣợng thối nhũn củ khoai tây, cà rốt, bắp cải, hành tây,…Hiện tƣợng thối hỏng là hậu quả của quá trình phá vỡ cấu trúc mô tế bào của cây do tác động chủ yếu của các enzyme phân giải của vi khuẩn. Toàn bộ thịt củ, quả bị thối biến thành một khối nhão, có mùi (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
23 Mức độ gây hại của vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora: bệnh thối mềm là một bệnh rất nguy hiểm bởi vì vi khuẩn này có khả năng kí sinh, chọn lọc phạm vi kí chủ rất rộng bao gồm nhiều loại cây trong nhiều họ thực vật khác nhau. Hiện nay chƣa có cách phòng trị hiệu quả, thiệt hại do vi khuẩn này gây ra là rất lớn. Năm 1995, tại Argentina, trái và cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill. hybrid Tommy) từ các nhà kính thƣơng mại (commercial greenhouses) gần La Plata và gần Chacabuco xuất hiện những triệu chứng bệnh gây ra bởi Erwinia carotovora subsp. carotovora. Tỉ lệ bệnh 2% là phổ biến và gần 10% cây ở vùng ẩm ƣớt trong nhà kính thì bị nhiễm bệnh. Năm 1994, tại Thổ Nhĩ Kỳ, bệnh thối thân cây cà chua gây ra bởi Erwinia carotovora subsp. carotovora và Erwinia chrysanthemi đƣợc phát hiện lần đầu tiên trong nhà kính ở vùng phía đông Địa Trung Hải (eastern Mediterrean region). Từ năm 1999, bệnh bùng phát nghiêm trọng trong nhiều nhà kính trồng cà chua ở vùng Địa Trung Hải và Aegean của Thổ Nhĩ Kỳ. Năm 2003, phạm vi tác động của bệnh hơn 25% ở vùng Địa Trung Hải và Aegean của Thổ Nhĩ Kỳ (Aysan và ctv). Vụ đông và đông xuân năm 2002, xuất hiện bệnh trong một vài nhà kính thƣơng mại (several commercial plastic- covered greenhouses) ở Mersin và Antakya, vùng phía đông Địa Trung Hải của Thổ Nhĩ Kỳ. Phạm vi tác động của bệnh này khoảng 20 – 25% và 80 – 90% nhà kính ở Mersin và Antakya. Sau khi quan sát các triệu chứng, phân lập, mô tả về mặt hình thái học, sinh lý, sinh hóa, kiểm tra tính gây bệnh và phân tích FAME (fatty acid methyl ester) ngƣời ta đã xác định đƣợc nguyên nhân gây bệnh do vi khuẩn Pseudomonas viridiflava, Erwinia carotovora subsp. carotovora và Erwinia chrysanthemi (Aysan và ctv). Tại Canada, thiệt hại do vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây ra là 12% và 20% vào năm 1996 và 1997 tại các nhà kính trồng tiêu (Capsicum annuum) tại St. David's, Ontario. Bệnh cũng đƣợc quan sát trên cánh đồng trồng tiêu gần Harrow năm 1996 – 1997. Đây là báo cáo đầu tiên về vi khuẩn gây thối thân (bacterial stem canker) tại các nhà kính trồng tiêu ở Canada (Cerkauskas và Brown, 2001).
24 Ở New Zealand, một loại vi khuẩn đƣợc phân lập từ những củ cala (Zantedeschia spp. ) bị nhiễm bệnh đƣợc xác định là Erwinia carotovora subsp. carotovora. Báo cáo này cho thấy Erwinia carotovora subsp. carotovora là nguyên nhân gây ra bệnh thối mềm trên cây hoa kiểng quan trọng ở New Zealand (Wright, 1998). Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora Trên thế giới: trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau.Với sự phát triển vƣợt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử ra đời nhƣ PCR (Polymerase Chain Reaction), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplif ied Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),… đã tạo nên một sự chuyển biến mới trong công tác bảo vệ thực vật. Một nhóm các nhà nghiên cứu Thái Lan sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện và phân loại vi khuẩn gây bệnh thối mềm Erwinia trên thực vật ở Thái Lan. Bằng cách sử dụng cặp primer Y1 và Y2 để khuếch đại đoạn 434 bp trong khung đọc mở (open reading frame) của pectate lyase (Pel) gen của Erwinia carotovora, cặp primer ADE1và ADE2 để khuếch đại đoạn 420 bp trong khung đọc mở của pectate lyase gen của Erwinia chrysanthemi. Kết quả chỉ có cặp primer Y1 và Y2 khuếch đại đƣợc đoạn gen mong muốn của tất cả các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc (Phokum và ctv). Darrasse và ctv, (1994) sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP trên gen pel (mã hóa pectate lyases) để xác định mối quan hệ giữa Erwinia carotovora với bệnh trên cây khoai tây. Bằng cách sử dụng cặp primer Y1 và Y2 cho phép khuếch đại một đoạn 434 bp của những dòng Erwinia carotovora. Trong 89 dòng Erwinia carotovora đƣợc kiểm tra, chỉ những dòng Erwinia carotovora subsp. betavasculorum là không phát hiện thấy. RFLP đƣợc thực hiện trên đoạn đƣợc khuếch đại với 7 enzyme endonuclease: TaqI, HaeIII, HhaI, AluI, HaeII, Sau3AI, HpaII thì thấy có sự đa hình giữa các dòng. Seo và ctv, (2001) đã sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP nghiên cứu về kiểu hình và đa dạng di truyền trên 87 dòng vi khuẩn Erwinia carotovora ssp. carotovora (Ecc) phân lập từ các cây kí chủ khác nhau ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Thái Lan. Thí nghiệm tiến
25 hành phân tích PCR – RFLP của gen 16S ribosomol DNA (rDNA) với cặp primer fD1 và rP2, 16S – 23S rDNA intergenic spacer regions (ISRs) với cặp primer R16 - 1, R23 – 2R, gen pel mã hóa pectate lyase với cặp primer Y1và Y2. Bằng phân tích RFLP trên sản phẩm khuếch đại với các enzyme cắt giới hạn HinfI, MboI, Sau3AI, kết quả cho thấy sự đa hình giữa các dòng nghiên cứu. Năm 2003, nhóm các nhà nghiên cứu này cũng đã sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP và RAPD để nghiên cứu về mặt kiểu hình và đặc tính di truyền của vi khuẩn Erwinia carotovora trên cây dâu tằm (mulberry) (Morus spp.). Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên 9 dòng vi khuẩn đƣợc phân lập từ cây dâu tằm. Bằng phƣơng pháp thử các phản ứng sinh hóa, những dòng vi khuẩn này đƣợc chia thành 2 loại: type 1 và type 2. Hai dòng thuộc type 1 giống với Ecc trong khi 7 dòng thuộc type 2 thì khác biệt với Ecc. Bằng nghiên cứu qua nhiều giai đoạn bao gồm thử nghiệm huyết thanh học (serological assay), PCR chuyên biệt cho Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), PCR – RFLP với pectate lyase (Pel) gen và PCR – RAPD cho thấy những dòng vi khuẩn thuộc type 2 thuộc về những nhóm phụ Erwinia carotovora khác hơn là Ecc và Eca. Fiori và Schiaffino, (2003) cũng sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP để nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối mềm thân cây hồ tiêu (Capsicum annuum L.): Erwinia carotovora subsp. carotovora tại các nhà kính ở Sardinia, Italia. Phản ứng PCR với cặp mồi Y1 và Y2 cho phép khuếch đại một trình tự có kích thƣớc 434bp. Phân tích RFLP trên sản phẩm PCR đƣợc tiến hành với 4 enzyme endonuclase giới hạn AluI, HaeII, HpaII, Sau3AI thì thấy có sự đa hình giữa các dòng. Tại Việt Nam: hiện tại, theo chúng tôi tìm hiểu thì chƣa thấy có tài liệu nào nói về việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây bệnh trên địa lan (Cymbidium). 2.3.4. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra Hàng loạt các kỹ thuật truyền thống và hiện đại đƣợc sử dụng để phát hiện sự tồn tại của vi khuẩn gây bệnh trong hạt giống, tàn dƣ cây trồng, trong đất, nƣớc và các vector truyền khác. Phần lớn vi khuẩn gây bệnh cây trồng đƣợc truyền thông qua hạt giống hoặc các vật liệu nhân giống bị nhiễm bệnh. Do đó, phát hiện tác nhân gây ra bệnh trên cây
26 trồng có tầm quan trọng sống còn để đảm bảo một nền nông nghiệp an toàn và bền vững (Yeshitila và ctv, 2006). Chẩn đoán theo triệu chứng: một loài vi khuẩn hoặc một nhóm vi khuẩn hại cây có thể gây ra những loại triệu chứng bệnh đặc trƣng. Tuy nhiên, dựa vào triệu chứng bệnh chỉ có thể xác định chẩn đoán đúng trong rất ít trƣờng hợp.Trên một loài cây, nhiều loài vi khuẩn khác nhau và nhiều loại vi sinh vật khác nhau có thể tạo ra các triệu chứng bệnh tƣơng tự giống nhau rất khó phân biệt nhƣ các loại bệnh héo rũ, bệnh thối hỏng…(Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp vi sinh: để xác định bệnh do vi khuẩn gây ra, cần thiết phải khẳng định sự có mặt của vi khuẩn trong mô bệnh, phân lập từ mô bệnh để nuôi cấy vi khuẩn thuần khiết, sau đó lây bệnh nhân tạo để xác định tính gây bệnh của chúng trên cây kí chủ theo quy tắc Koch. Tiếp tục nghiên cứu xác định rõ đặc tính hình thái, sinh trƣởng (khuẩn lạc) và phản ứng sinh hóa để có cơ sở phân loại, giám định loại (giống) và loài vi khuẩn cần chẩn đoán (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp sinh hóa: một số chỉ tiêu cần thiết để giám định loài vi khuẩn cần chẩn đoán phải đƣợc khảo sát nghiên cứu bằng phƣơng pháp thử các phản ứng sinh hóa riêng biệt. Các loại (giống) vi khuẩn khác nhau phân biệt về nhu cầu, khả năng sử dụng các chất dinh dƣỡng và về kiểu trao đổi chất (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp huyết thanh: là một phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bệnh vi khuẩn đƣợc ứng dụng trong bệnh cây nhất là trong việc kiểm tra, chọn lọc giống, vật liệu làm giống sạch bệnh và trong kiểm dịch thực vật. Phƣơng pháp huyết thanh chẩn đoán vi khuẩn dựa trên cơ sở phản ứng có tính đặc hiệu cao giữa kháng nguyên và kháng thể tƣơng ứng. Tế bào vi khuẩn là những kháng nguyên, là một khảm kháng nguyên trong đó kháng nguyên O (ở tế bào) và kháng nguyên H (lông roi) có ý nghĩa lớn trong việc ứng dụng phƣơng pháp huyết thanh để chẩn đoán, xác định loài vi khuẩn gây bệnh một cách nhanh chóng và khá chính xác. Ngƣời ta đƣa kháng nguyên vi khuẩn vào trong cơ thể động vật rồi lấy kháng huyết thanh để thực hiện việc chẩn đoán.
27 Để tăng độ nhạy phản ứng của kháng huyết thanh nhất là trong trƣờng hợp số lƣợng tế bào vi khuẩn trong mô bệnh quá thấp, cần áp dụng các phƣơng pháp thử phản ứng theo phƣơng pháp miễn dịch khuếch tán trên gel hoặc phƣơng pháp miễn dịch liên kết men (ELISA) (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp sinh học phân tử: Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền thống là nuôi cấy trên một vài môi trƣờng chọn lọc. Phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian và không đủ nhạy (sensitive) (So Young Yoo và ctv, 2002). Do đó, yêu cầu có một kỹ thuật chẩn đoán, phát hiện bệnh một cách nhanh chóng, chính xác và hiệu quả. Các phƣơng pháp sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ và mang lại nhiều thành tựu to lớn cho việc chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn gây bệnh cây trồng nhƣ DNA probe, PCR, RFLP, RAPD,…Phƣơng pháp PCR là một trong những công cụ hữu hiệu trong việc xác định tác nhân gây bệnh cây trồng. Theo Kang và ctv ( 2003), kỹ thuật PCR cho phé p phát hiện nhanh, nhạy, dễ dàng khi so sánh với lai probe (probe hybridization) và nó khuếch đại đặc hiệu một trình tự gen mục tiêu chỉ hiện diện trong genome của một loại vi khuẩn. Kỹ thuật PCR có thể đƣợc sử dụng để phát hiện tác nhân gây bệnh hiện diện với mật độ thấp trên mô cây bị nhiễm bệnh. Trên vi khuẩn ngƣời ta thƣờng nghiên cứu vùng 16S ribosomal DNA (rDNA), 16S – 23S rDNA intergenic spacer regions (ISRs). Theo Subandiyah và ctv (2000), 16S rDNA là một công cụ hữu dụng để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài và sự tiến hóa giữa vi khuẩn và các sinh vật prokaryote khác, trình tự 16S rRNA và vùng hoạt động (intergenic region) giữa 16S rRNA và 23S rRNA đƣợc xem nhƣ có thể biến đổi giữa các dòng trong một loài. Theo Christopher và David (1999), khi xem xét mối quan hệ thân cận trong loài, 23S rDNA thƣờng cho phép phân tích tốt hơn 16S rDNA bởi vì nó lớn hơn (khoảng 2,5 kb trong khi 16S rDNA khoảng 1,5 kb) và nó chứa trình tự biến đổi ở mức độ cao hơn. Ngoài ra, nhiều gen mục tiêu khác cũng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu xác định mối quan hệ phát sinh loài và phân loại tác nhân lây nhiễm nhƣ gen mã hóa protein heat - shock 65 (hsp65) trên loài Mycobacterial, trình tự 23S rDNA và gen mã hóa protein bề mặt A (ospA) và gen flagellin (fla) trên loài Borrelia. So Young Yoo và ctv, (2002) đã đề
28 xuất một hƣớng mới trong nghiên cứu xác định vi khuẩn gây bệnh dựa trên trình tự vùng ITS và 23S rDNA. Vùng ITS (Internal transcribed spacer) là một đoạn (stretch) DNA nằm giữa tiểu đơn vị ribosom nhỏ (16S) và tiểu đơn vị ribosom lớn (23S). Việc thiết kế probe dựa trên trình tự vùng ITS và 23S rDNA mà nó thích hợp với kỹ thuật microarray để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra. Kết quả là đã tạo ra chip DNA chứa những probe đặc hiệu cho việc phát hiện nhiều loại vi khuẩn và nấm gây bệnh với tên thƣơng mại là Pathochip.
29 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu thí nghiệm 3.1.1. Thời gian - địa điểm nghiên cứu Thời gian: đề tài đƣợc tiến hành từ 15/02/2006 đến 30/07/2006. Địa điểm nghiên cứu: - Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. - Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 3.1.2. Vật liệu Chủng vi sinh vật: các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây hại trên địa lan. Môi trƣờng Môi trƣờng PGA Môi trƣờng LB Khoai tây 200 g Bacto - tryptone 10 g Bacto – yeast extract Glucose 20 g 5g Agar 20 g NaCl 10 g H2 O 1.000 ml H2 O 1.000 ml Môi trƣờng KB Môi trƣờng YDC Proteose peptone 20 g Yeast extract 10 g K2HPO4 1,5g Dextrose (Glucose) 20 g MgSO4.7H2O 1,5 g Calcium carbonate 20 g Glycerol 15 ml Agar 15 g Agar 15 g H2 O 1.000 ml H2 O 1.000ml
30 Các thiết bị, dụng cụ thƣờng sử dụng Các thiết bị Dụng cụ Máy Vortex Ống nghiệm Lò Viba Micropipette các loại Máy điện di (Bio-Rad) Đầu típ các loại Máy chụp gel (Gel Doc 2000) Eppendoft 0,2 ml, 1,5 ml Máy ly tâm (Sigma) Máy PCR (Thermus cycle) (Eppendoft) Các hóa chất sử dụng Hóa chất để ly trích DNA Hóa chất để thực hiện phản ứng PCR TE 1X 10X buffer PCR (Bio-Rad) SDS 10% MgCl2 50 mM (Bio-Rad) NaCl dNTP's mix 25 mM (Bio-Rad) Primer Xan1330, Xan322 và Erw1, Erw2 CTAB/NaCl Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) Taq DNA polymerase Isopropanol Ethanol 70% Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chết cây địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng Tiến hành điều tra tình hình bệnh hại trên địa lan tại một số hộ trồng địa lan trên địa bàn TP. Đà Lạt từ đó xác định đƣợc tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra. Hình thức điều tra: phỏng vấn, trao đổi, trò chuyện với từng hộ sản xuất. 3.2.2. Phân lập mẫu vi khuẩn Mẫu bệnh đƣợc thu thập tại các vƣờn địa lan bị bệnh tại thành phố Đà Lạt. Tiến hành phân lập mẫu trên môi trƣờng PGA. Cách phân lập mẫu: mẫu bệnh đƣợc phân lập từ vết bệnh điển hình. Cắt lấy mảnh nhỏ có kích thƣớc 3 – 5 mm 3 – 5 mm tại vị trí giữa mô bệnh và mô khỏe. Rửa mẫu bằng nƣớc cất 2 – 3 lần rồi khử trùng mẫu bệnh bằng cồn 700 trong 30 giây, sau đó
31 rửa lại bằng nƣớc cất 2 – 3 lần, cắt nhỏ mẫu và để khô tự nhiên trong tủ cấy. Chú ý không nên để mẫu quá khô. Sau đó đặt mẫu lên môi trƣờng PGA, để ở nhiệt độ phòng. Khi vi khuẩn mọc cấy chuyền sang đĩa khác để tạo dòng thuần. Cách đặt tên mẫu: EC06 – 1 là mẫu vi khuẩn đƣợc phân lập từ các mẫu bệnh trên cây địa lan tại Đà Lạt năm 2006, mẫu 1. (E: Erwinia carotovora subsp. carotovora, C: Cymbidium). Sau đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra gram âm, gram dƣơng các dòng vi khuẩn vừa phân lập đƣợc. Kiểm tra nhanh bằng cách sử dụng KOH 3%. Nhỏ một giọt KOH lên phiến kính, sau đó dùng tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy một ít vi khuẩn từ khuẩn lạc huyền phù trong giọt KOH đó khoảng 2 – 3 phút, nếu nhớt là gram âm ngƣợc lại là gram dƣơng. 3.2.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC Trên môi trƣờng KB: dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi khuẩn cấy chấm điểm lên môi trƣờng KB. Sau 24 giờ đem chiếu dƣới tia UV và quan sát sự phát sáng của vi khuẩn. Trên môi trƣờng YDC: tƣơng tự nhƣ cấy lên môi trƣờng KB. Sau 24 giờ quan sát sự tạo sắc tố và hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn. 3.2.4. Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan Thí nghiệm tiến hành chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan với 17 mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc: EC06-1, EC06-3, EC06-5, EC06-6, EC06-7, EC06-8, EC06-9, EC06-10, EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-14, EC06-15, EC06-16, EC06- 17, EC06-18, EC06-19. Mỗi mẫu phân lập là một công thức, mỗi công thức tiến hành trên một mẩu củ khoai tây và một lá địa lan, bố trí thí nghiệm 2 lần lặp lại. Các mẩu củ khoai tây và lá địa lan không để vi khuẩn vào dùng làm đối chứng. Tiến hành chủng bệnh vi khuẩn trên củ khoai tây Vật liệu Vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng YDC. - Củ khoai tây bi không bị sâu bệnh. - Hộp nhựa có kích thƣớc 20 - 8 cm. Giấy thấm đã sấy khử trùng, nƣớc cất, cồn 700. -
32 Phƣơng pháp Các hộp nhựa đƣợc khử trùng bằng cồn 700, dƣới đáy hộp có đặt một lớp giấy - thấm. Sau đó nhỏ nƣớc cất đã hấp tiệt trùng lên lớp giấy thấm để tạo độ ẩm. Củ khoai tây đƣợc rửa sạch và khử trùng bề mặt bằng cồn 700. Để khô tự nhiên sau - đó dùng dao đã đƣợc khử trùng cắt thành từng miếng nhỏ và đặt vào hộp. Lấy một miếng thạch có chứa khuẩn lạc vi khuẩn và đặt vào chính giữa mẩu khoai tây. Sau đó, tất cả các hộp đƣợc để trong điều kiện nhiệt độ phòng. Đánh giá kết quả: theo dõi xem sau khi chủng bệnh vi khuẩn bao nhiêu ngày thì củ khoai tây bị bệnh và mô tả triệu chứng bệnh. Tiến hành chủng bệnh vi khuẩn lên lá địa lan Vật liệu Vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng YDC. - Lá địa lan cùng tuổi (tuổi 2) không bị sâu bệnh. - Hộp nhựa có kích thƣớc 20 - 8 cm. Giấy thấm đã sấy tiệt trùng, nƣớc cất, cồn 700. - Phƣơng pháp Các hộp nhựa đƣợc khử trùng bằng cồn 700, dƣới đáy hộp có đặt một lớp giấy - thấm. Sau đó nhỏ nƣớc cất đã hấp tiệt trùng lên lớp giấy thấm để tạo độ ẩm. Lấy lá địa lan không bị sâu bệnh rửa sạch và khử trùng bề mặt bằng cồn 70 0. Làm - khô tự nhiên sau đó dùng dao lam sạch cắt một đoạn khoảng 20 cm và đặt vào hộp. Dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi khuẩn chấm lên vết cắt. - Sau khi chủng xong các hộp mẫu đƣợc để ở trong phòng lạnh 250C. - Đánh giá kết quả: theo dõi xem sau khi chủng bệnh bao nhiêu ngày thì lá địa lan bị bệnh và mô tả triệu chứng bệnh. Sau đó, lấy lá địa lan bị bệnh phân lập lại và xác định tác nhân gây bệnh. Cách phân lập mẫu: lấy lá địa lan bị bệnh cho vào cốc nƣớc sạch đã hấp tiệt trùng rửa sạch 2 – 3 lần, khử trùng mẫu bằng cồn 700 trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất 2 – 3 lần, cắt nhỏ mẫu và để khô tự nhiên trong tủ cấy. Đặt mẫu lên môi trƣờng PGA và để ở nhiệt độ phòng. Khi vi khuẩn mọc lên thì quan sát và mô tả.
33 3.2.5. Tăng sinh khối vi khuẩn trên môi trƣờng LB lỏng Dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi khuẩn cho vào ống nghiệm đựng 5 ml môi trƣờng LB đã hấp tiệt trùng và đậy lại bằng nút bông gòn. Các ống nghiệm này đƣợc gói lại thành bó và cho vào máy lắc . Sau 48 giờ tăng sinh dịch vi khuẩn thu đƣợc đem ly tâm để thu sinh khối sau đó tiến hành ly trích. 3.2.6. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn Phƣơng pháp ly trích DNA đƣợc thực hiện theo quy trình của Sambrook và ctv, 2001: Phƣơng pháp sử dụng CTAB/NaCl đã có cải tiến. Quy trình thực hiện nhƣ sau: Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm dịch vi khuẩn 10.000 vòng/5 - phút/4oC. Rửa sinh khối thu đƣợc với 1ml nƣớc cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (thƣờng 2- 3 lần). Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567 μl dung dịch TE và đánh tan - bằng vortex, thêm 30 μl dung dịch SDS 10% và đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 – 2 giờ. Cho thêm vào 100 μl dung dịch NaCl , hòa tan thật kỹ bằng vortex. - Thêm vào 80 μl dung dịch CTAB/NaCl ( khoảng 1/10 thể tích). Pha trộn (đánh - tan bằng vortex), ủ ở 650C/10 phút. Thêm vào 780 μl dung dịch hỗn hợp Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1:v/v). - Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 12.000 vòng/10 phút/4oC. Thu hết dung dịch bên trên (dung dịch DNA) cho vào eppendorf mới. Nếu - không thể phân biệt mặt phân cách chung giữa các dung dịch có thể ly tâm thêm lần nữa ở tốc độ lớn hơn. Chiết xuất dung dịch DNA với Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol - (25:24:1:v/v). Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14.000 vòng/10 phút/4oC. Thu lấy dung dịch bên trên cho vào eppendorf mới (khoảng 500 μl). Kết tủa DNA với dung dịch Isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích của dung - dịch (khoảng 300 μl) và ủ ở tủ - 20oC/30 phút. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/10 phút/40C. Thu lấy kết tủa sau khi ly tâm.
34 Rửa kết tủa bằng Ethanol 70% (khoảng 500 μl).Tốt hơn có thể dùng Ethanol - 70% đƣợc làm lạnh – 200C, nghiêng nhẹ qua lại. Ly tâm 13.000 vòng/10 phút/4oC. Đổ cồn ra hết và làm khô bằng cách cho cồn bay hơi. Hòa tan kết tủa trong 40 μl dung dịch TE, đem giữ trong tủ mát 40C trong suốt - thời gian thử nghiệm. 3.2.7. Thực hiện phản ứng PCR Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 Sử dụng cặp primer có các thông số sau: nhiệt độ Tm: 60,70C và 53,60C, %GC: 61,9% và 47,6%, trình tự primer: Xan 1330 (5'- GTTCCCGGGCCTTGTACACAC - 3') và Xan 322 (5'-GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC - 3'). Hai primer này đƣợc thiết kế trên vùng 16S/23S rDNA cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb (Khoodoo và ctv, 2004). Thành phần phản ứng Thành phần Nồng độ cuối 10X buffer PCR 1X MgCl2 50 mM 1.5 mM dNTP's 10 mM 0.2 mM/mỗi loại Xan 1330 100 pmol/μl 10 pmol/μl Xan 322 100 pmol/μl 10 pmol/μl Taq DNA polymerase 5 UI/μl 1UI DNA mẫu 10 – 100 ng H2O cất vừa đủ 25 μl Chu kỳ nhiệt Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian 940C Giai đoạn khởi động 4 phút Chạy chu kỳ (30 chu kỳ) 940C - Biến tính 1 phút 560C - Bắt cặp 45 giây 720C - Kéo dài 1 phút
35 720C Giai đoạn kết thúc 5 phút Giữ ở 40C Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 Sử dụng cặp primer có các thông số nhƣ sau: nhiệt độ Tm: 84,90C và 73,70C, %GC: 66% và 50%, trình tự primer: Erw1 (5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCG-- 3') và Erw2 (5'- CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAG-- 3'). Hai primer này đƣợc thiết kế trên vùng gen mã hóa pectate lyase của vi khuẩn Erwinia carotovora cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc 434 bp (Darrasse và ctv, 1994). Thành phần phản ứng Thành phần Nồng độ cuối 10X buffer PCR 1X MgCl2 50 mM 1.5 mM dNTP's 10 mM 0.2 mM/mỗi loại Erw1 75 pmol/μl 10 pmol/μl Erw2 83 pmol/μl 10 pmol/μl Taq DNA polymerase 5 UI/μl 1UI H2O cất vừa đủ 25 μl Chu kỳ nhiệt: chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo quy trình của Seo và ctv, 2001. Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian 950C Giai đoạn khởi động 5 phút Chạy chu kỳ (35 chu kỳ) 940C - Biến tính 30 giây 650C - Bắt cặp 30 giây 720C - Kéo dài 45 giây 720C Giai đoạn kết thúc 10 phút Giữ ở 40C Tùy theo sản phẩm PCR, các điều kiện của phản ứng PCR sẽ đƣợc điều chỉnh trong quá trình làm để thu đƣợc kết quả tốt nhất.
36 Điện di và đọc kết quả PCR Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, lấy eppendorf ra khỏi máy luân nhiệt. Sản phẩm PCR sẽ đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose. Chuẩn bị gel cho quá trình điện di: cách chuẩn bị gel nhƣ sau: cân 0,125g agarose, thêm 12,5 ml TAE 0.5X, đun trong lò viba ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thƣờng đun trong 2 phút). Để nguội đến khoảng 600C (đến khi nào cầm đƣợc mà không quá nóng) thì đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lƣợc đã cân bằng. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lƣợc ra khỏi gel và cho vào bồn điện di có chứa TAE 0,5X sẵn sàng cho việc đặt mẫu. Tiến hành điện di: trộn dung dịch gồm 4 μl sản phẩm PCR và 2 μl loading dye 6X. Cho dung dịch này vào giếng trên gel. Điện di 40 – 50 phút với cƣờng độ dòng điện là 250 mA và hiệu điện thế 50V. Nhuộm mẫu: sau khi điện di, gel đƣợc lấy ra khỏi bồn điện di và ngâm vào dung dịch EtBr trong khoảng 15 – 20 phút. Quan sát kết quả điện di: kết quả điện di đƣợc quan sát dƣới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh Gel Doc, đƣợc quan sát nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad.