Luận văn: PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (part 3)

Chia sẻ: Sadfaf Asfsggs | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

151
lượt xem 26
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

4.1. Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng Hoa lan cũng giống nhƣ các loại cây cảnh khác thƣờng xuyên bị sâu bệnh gây hại làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng bình thƣờng, năng suất, phẩm chất trong đó có màu sắc, hƣơng vị, độ tƣơi bền dẫn đến làm giảm giá trị kinh tế, giá trị thẩm mỹ, giá trị hàng hóa và xuất khẩu trên thị trƣờng trong và ngoài nƣớc, thậm chí còn làm chết cây. Hiện nay, tình hình bệnh hại nhất là bệnh chết cây địa lan...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn: PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (part 3)

37 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng Hoa lan cũng giống nhƣ các loại cây cảnh khác thƣờng xuyên bị sâu bệnh gây hại làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng bình thƣờng, năng suất, phẩm chất trong đó có màu sắc, hƣơng vị, độ tƣơi bền dẫn đến làm giảm giá trị kinh tế, giá trị thẩm mỹ, giá trị hàng hóa và xuất khẩu trên thị trƣờng trong và ngoài nƣớc, thậm chí còn làm chết cây. Hiện nay, tình hình bệnh hại nhất là bệnh chết cây địa lan đã gây thiệt hại rất lớn cho ngƣời nông dân trồng địa lan tại TP. Đà Lạt. Do đó, việc tiến hành điều tra tình hình bệnh hại và xác định tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo vệ thực vật. 4.1.1. Các triệu chứng bệnh trên địa lan: Qua điều tra cho thấy một số bệnh thƣờng xuất hiện trên địa lan với triệu chứng bệnh nhƣ sau: Trên chồi địa lan (a) (b) Hình 4.1.Các triệu chứng bệnh trên chồi địa lan. a. Chồi địa lan với triệu chứng thối nâu vàng. b. Chồi địa lan với triệu chứng thối nâu đen.
38 Trên giả hành (a) (b) (c) (d) Hình 4.2. Các triệu chứng bệnh trên giả hành. a. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng thối nâu vàng. b. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng thối nâu đen. c. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng khô giả hành. d. Chậu địa lan với giả hành và chồi bệnh. Trên phát hoa (a) (b) Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh trên phát hoa. a. Phát hoa địa lan với triệu chứng thối nâu vàng. b. Phát hoa địa lan với triệu chứng thối nâu đen.
39 4.1.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệu điều tra tháng 10 năm 2005) Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra. Số chậu bệnh Số chậu bệnh Số chậu bệnh Vƣờn điều tra Tổng số chậu do vi khuẩn do nấm do virus 1 200 60 100 0 2 15.000 3.000 750 3.000 3 1.000 500 100 0 4 7.000 2.800 210 0 5 2.000 1.400 400 800 6 150 0 15 8 7 150 60 15 15 8 20.000 0 0 600 9 300 0 0 0 10 2.500 0 1.750 1.000 11 1.000 800 0 200 12 400 160 80 120 13 400 80 40 100 14 450 45 405 135 15 2.000 0 1.200 200 16 3.500 2.450 350 350 17 500 150 50 50 18 1.000 100 0 100 Tổng cộng 57.550 11.605 5.465 6.678 Qua đánh giá kết quả từ bảng 4.1, tỉ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra nhƣ sau: bệnh do vi khuẩn: 20,17%, bệnh do virus: 9,5%,bệnh do nấm: 11,6%.
40 25 Tỉ lệ nhiễm bệnh (%) 20 15 10 5 0 Vi khuẩn Virus N ấm Tác nhân gây bệnh Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra. Bệnh thối làm chết cây địa lan đang ảnh hƣởng rất nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn cho ngƣời trồng lan. Qua điều tra cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn gây ra cao hơn hẳn so với tỉ lệ nhiễm bệnh do nấm và virus gây ra qua các vƣờn điều tra (bảng 4.1 và đồ thị 4.1), có vƣờn không bị nhiễm bệnh hoặc chỉ bị nhiễm bệnh do hai tác nhân gây ra. Nhƣ thế, không thể kết luận đƣợc vƣờn đó là hoàn toàn sạch bệnh mà nó có thể bị bệnh tiềm ẩn, chƣa biểu hiện triệu chứng ra bên ngoài. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân góp phần làm cho bệnh lây lan và phát triển mạnh. Ngoài các yếu tố tự nhiên thì kỹ thuật trồng và chăm sóc của nông dân cũng ảnh hƣởng đến sự phát sinh, phát triển của bệnh. Họ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, chƣa có quy trình kỹ thuật hợp lý. 4.2. Phân lập mẫu vi khuẩn Theo Nguyễn Văn Minh (2005), qua điều tra và phỏng vấn ở những vƣờn địa lan có bệnh chết cây xuất hiện và vƣờn không có bệnh, cho thấy nhận thức của các chủ vƣờn về bệnh này còn kém. Phần lớn các chủ vƣờn đều nhận biết đƣợc triệu chứng bệnh và điều kiện giúp cho bệnh phát triển mạnh, nhƣng đa số các hộ trồng chƣa phân biệt đƣợc bệnh có bao nhiêu triệu chứng và nguyên nhân gây ra.
41 Kết quả điều tra cho thấy, bệnh do vi khuẩn gây ra chiếm tỉ lệ cao hơn cả. Trƣ ớc tình hình đó, chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu chồi địa lan có triệu chứng bệnh do vi khuẩn gây ra và tiến hành phân lập. Kết quả là phân lập đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng trên môi trƣờng PGA (Hình 4.4): a. Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. b. Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. Erwinia carotovora subsp. carotovora là vi khuẩn gram âm. Cho nên chúng tôi tiến hành kiểm tra gram âm, gram dƣơng để loại bỏ những dòng vi khuẩn gram dƣơng bằng cách sử dụng KOH 3%. Tuy nhiên, cách kiểm tra này cũng không cho kết quả thật chính xác. Có thể bị nhầm lẫn giữa gram âm và gram dƣơng đối với những vi khuẩn có thời gian nuôi lâu, nó cũng tạo nhớt khi huyền phù trong KOH. (a) (b) Hình 4.4. Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh trên môi trƣờng PGA. a. Khuẩn lạc màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. b. Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. 4.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC 4.3.1. Trên môi trƣờng KB Môi trƣờng KB đƣợc dùng để xem sự phát sáng của vi khuẩn khi chiếu dƣới tia UV. Theo Fiori và Schiaffino (2003), vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora không phát sáng trên môi trƣờng KB. Do đó, chúng tôi đã chọn lọc đƣợc những dòng không phát sáng để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình 4.5.1).
42 4.3.2. Trên môi trƣờng YDC Theo Seo và ctv (2001), khi thử nghiệm sinh lý, sinh hóa trên 87 dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora thì thấy trong 22 dòng Thái Lan có 5 dòng sản sinh sắc tố vàng trên môi trƣờng YDC, 23 dòng Hàn Quốc và 24 dòng Nhật Bản đều không sản sinh sắc tố vàng trên môi trƣờng YDC. Nhƣ vậy, giữa các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora có sự đa dạng về đặc tính kiểu hình phenotyp, do chúng có phổ ký chủ và sự phân bố địa lý rộng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn lên môi trƣờng YDC để xem sự sản sinh sắc tố vàng và hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn. Sau 24 giờ quan sát thấy trên môi trƣờng YDC, khuẩn lạc vi khuẩn có màu rất đặc trƣng (Hình 4.5.2). - Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. - Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. aa a. Khuẩn lạc vi khuẩn phát sáng khi chiếu dƣới tia UV, tạo thành quầng sáng xung quanh. b b. Khuẩn lạc vi khuẩn b không phát sáng khi chiếu dƣới tia UV. Hình 4.5.1. Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng KB chiếu dƣới tia UV sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng). a. Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng a trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. b. Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép b a khuẩn lạc tròn nhẵn. Hình 4.5.2. Hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng YDC sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng).
43 4.4. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây, lá địa lan Từ nguồn vi khuẩn cấy lên môi trƣờng YDC, chúng tôi tiến hành chủng lên củ khoai tây và lá địa lan. 4.4.1. Trên củ khoai tây: sau 48 giờ chủng bệnh, quan sát thấy triệu chứng bệnh biểu hiện nhƣ sau: (a) (b) (d) (c) Hình 4.6.1. Các triệu chứng bệnh trên củ khoai tây chủng vi khuẩn sau 48 giờ (ở nhiệt độ phòng). a. Vết bệnh lõm xuống, màu vàng kem, nhày. b. Vết bệnh lõm xuống, màu nâu đen, nhày. c. Vết bệnh có dịch nhày kèm theo bọt màu trắng. d. Vết bệnh hơi lõm xuống, nhày, xung quanh vết bệnh có đƣờng viền màu nâu nhạt. Sau 48 giờ chủng vi khuẩn, quan sát thấy 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây hại mạnh: EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-14, EC06-15, EC06-16, EC06-17, EC06-18 và EC06-19 với các triệu chứng nhƣ hình 4.6.1. Ngoài ra, các dòng còn lại khả năng gây bệnh yếu hoặc không gây bệnh. Điều này có thể do phân lập, cấy chuyền nhiều lần nên độc tính của vi khuẩn bị giảm.
44 4.4.2. Trên lá địa lan: Sau 10 ngày chủng bệnh, quan sát thấy hầu nhƣ các dòng vi khuẩn không gây bệnh trên lá địa lan. Chỉ duy nhất có dòng EC06-8 gây bệnh. Vết bệnh có màu vàng xanh, lan theo chiều rộng của phiến lá. Ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe có viền màu nâu đen (Hình 4.6.2). a. Ranh giới giữa mô b bệnh và mô khỏe có màu nâu đen. b. Vùng bị bệnh có màu vàng xanh. a Hình 4.6.2. Triệu chứng bệnh trên lá địa lan chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 250C). Sau đó, chúng tôi đã tiến hành phân lập lại từ lá địa lan chủng bệnh vi khuẩn có biểu hi ện bệnh. Kết quả thu nhận đƣợc vi khuẩn có hình thái, màu sắc khuẩn lạc giống với ban đầu (Hình 4.6.3). Hình 4.6.3. Vi khuẩn phân lập từ lá địa lan bị bệnh sau khi chủng vi khuẩn 10 ngày trên môi trƣờng PGA. 4.5. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn DNA là vật chất cơ bản trong nghiên cứu di truyền phân tử. Do đó, chúng ta phải ly trích đƣợc DNA tách khỏi tế bào và các chất nhƣ RNA, protein,…Có nhiều phƣơng
45 pháp ly trích DNA nhƣng mục đích cuối cùng là làm sao thu đƣợc lƣợng DNA đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Tuy giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn khá đơn giản nhƣng nó lại đóng vai trò vô cùng quan trọng. Chúng tôi đã tiến hành ly trích một số dòng vi khuẩn. Sau khi ly trích xong, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra DNA. Kết quả ly trích đƣợc thể hiện ở hình 4.6. 1 2 3 45 6 7 8 DNA tổng số Phần tạp nhiễm Hình 4.7. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của vi khuẩn. 1. EC06-1, 2. EC06-3, 3. EC06-5, 4. EC06-6, 5. EC06-7, 6. EC06-8, 7. EC06-9, 8. EC06-10. Điện di trên gel agarose 0,8% ở hiệu điện thế 100V/15 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 3 μl mẫu/giếng. Qua hình trên cho thấy các mẫu ly trích có độ tinh sạch chƣa cao. Ngoài DNA tổng số còn có phần tạp (RNA và protein) ở phía dƣới. Có thể loại bỏ đƣợc phần tạp này bằng cách sử dụng enzyme RNAse. Có một số mẫu DNA bị đứt gãy tạo thành vệt sáng dài. Tuy nhiên, DNA thu đƣợc tƣơng đối sạch để thực hiện phản ứng PCR. Trƣớc khi tiến hành thực hiện phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành pha loãng DNA gốc trong nƣớc cất vô trùng hoặc TE 1X. Do lƣợng DNA mẫu dùng trong phản ứng PCR khoảng từ 10 – 100 ng. Nếu lƣợng DNA mẫu quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn. Sau khi pha loãng, chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose để kiểm tra.
46 4.6. Phản ứng PCR 4.6.1. Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 Chúng tôi đã tiến hành chạy PCR trên các dòng vi khuẩn: EC06-1, EC06-5, EC06- 6, EC06-8, EC06-9, EC06-10, EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-19 với cặp primer Xan 1330 và Xan 322. 1 2 3 4 Sản phẩm PCR 1 2 3 4 Hình 4.8. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 560C). 1. EC06-1, 2. EC06-8, 3. EC06-9, 4. EC06-19. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4μl mẫu/giếng. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 1,5 kb. Tuy nhiên thấy xuất hiện 2 band điều đó chứng tỏ có sự tạp nhiễm. Lý do của sự tạp nhiễm này có thể đƣợc giải thích có thể tạp nhiễm trong khi ly trích hoặc tạp nhiễm khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Để khắc phục hiện tƣợng này, chúng tôi đã nâng nhiệt độ bắt cặp từ 560C lên 580C. Kết quả là thu đƣợc một band. 1 Hình 4.9. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 580C). Sản phẩm PCR 1. EC06-8. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4μl mẫu/giếng.
47 Trình tự 16S rDNA là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa , phân loại vi khuẩn và đã đƣợc xác định cho nhiều loài vi khuẩn. Trình tự 16S rDNA và vùng hoạt động giữa 16S – 23S rDNA chỉ ra sự biến đổi giữa các dòng trong cùng một loài. Dựa vào vùng này để phát hiện ra sự khác nhau giữa các loài vi khuẩn.Cặp primer chúng tôi sử dụng đƣợc thiết kế trên vùng 16S/23S rDNA, cho phép khuếch đại đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb. Khi kiểm tra trên Genbank chúng tôi thấy cặp primer này có thể khuếch đại trên một số loài khác. Nhƣ thế, chúng tôi chƣa thể khẳng định đƣợc vi khuẩn chúng tôi đang nghiên cứu chính xác là Erwinia carotovora subsp. carotovora. Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2. 4.6.2. Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 (5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3'), (5'- Primer Y1 Y2 CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT- 3') đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn DNA có kích thƣớc 434bp. Trình tự của mỗi mồi đã đƣợc kiểm tra trên Genbank và EB ML (Darrasse và ctv, 1994). Trong thí nghiệm này, chúng tôi cũng sử dụng cặp primer có trình tự giống nhƣ mô tả của Darrasse và ctv (1994) nhƣng có tên khác là Erw1 và Erw2. Chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 với chu kỳ nhiệt nhƣ đã nêu ở mục 3.2.7. Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy không có sản phẩm khuếch đại nào đƣợc tạo ra. Điều đó chứng tỏ phản ứng PCR không xảy ra (Hình 4.10). Hình 4.10. Sản phẩm PCR với cặp primer Erw1 và Erw2. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4 μl/giếng.
48 Theo chúng tôi có nhiều nguyên nhân khiến cho phản ứng PCR không xảy ra: - Nhiệt độ nóng chảy (melting) của hai primer tƣơng đối cao (84,90C và 73,70C) do trong thành phần có nhiều GC (66% và 50%). Quy trình ban đầu chúng tôi thực hiện nhiệt độ giai đoạn bắt cặp là 650C nhƣ thế là tƣơng đối cao. Nhƣng kết quả vẫn không có sản phẩm khuếch đại. Do đó, chúng tôi tiến hành giảm xuống 620C, 600C, 580C nhƣng vẫn không có kết quả. - Nguyên nhân thứ hai có thể do nồng độ các chất tham gia phản ứng quá thấp nên không đủ cho phản ứng PCR xảy ra. Lƣợng Taq ban đầu chúng tôi sử dụng là 0,1μl/UI, có thể là thấp không đủ để xúc tác cho phản ứng xảy ra. Chúng tôi tiến hành tăng lƣợng Taq từ 0,1μl/UI lên 0,2μl/UI đồng thời tăng nồng độ primer từ 10 pmol lên 20 pmol. Nồng độ Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hƣởng mạnh đến quá trình PCR. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Nồng độ Mg2+ thấp sẽ làm hạn chế quá trình kéo dài. Ngƣợc lại, nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). Khoảng nồng độ cho phép của Mg2+ từ 1 – 5 mM (McPherson, M. J. và Møller, S. G. 2000). Từ đó, chúng tôi tiến hành tăng nồng Mg2+ từ 1,5 mM lên 2 mM, 2,5 mM, 3 mM nhƣng vẫn không cho bất kỳ kết quả nào. Nhƣ vậy, việc tăng nồng độ các hóa chất là không hiệu quả. - Nguyên nhân thứ ba có thể do số chu kỳ khuếch đại chúng tôi sử dụng ban đầu (35 chu kỳ) là tƣơng đối dài. Vì vậy, chúng tôi đã giảm từ 35 xuống 30 chu kỳ, 25 chu kỳ nhƣn g vẫn không có sản phẩm khuếch đại nào đƣợc tạo ra cả. Qua các thí nghiệm thay đổi các điều kiện của phản ứng PCR, kết quả vẫn không có sản phẩm khuếch đại tạo ra.. Có nhiều lý do để giải thích cho vấn đề này. Thứ nhất, các mẫu địa lan khi bị thối có thể có nhiều loại vi sinh vật khác tấn công do đó có thể trong các mẫu vi khuẩn chúng tôi phân lập không có sự hiện diện của vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora. Thứ hai là có thể có sự tạp nhiễm khi phân lập và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Thứ ba là có thể các điều kiện của phản ứng chúng tôi thay đổi chƣa phù hợp. Do hạn chế về mặt thời gian nên chúng tôi vẫn chƣa tìm ra đƣợc một quy trình PCR thích hợp cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan.
49 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 1. Bệnh thối làm chết cây địa lan đang ảnh hƣởng nghiêm trọng đến các vƣờn lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng. Qua kết quả điều tra cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn gây ra cao hơn hẳn (20,17%) so với tỉ lệ nhiễm bệnh do virus (9,5%) và nấm (11,6%). 2. Kết quả phân lập vi khuẩn thu đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng: - Khuẩn lạc vi khuẩn có màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. - Khuẩn lạc vi khuẩn có màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. 3. Kết quả chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan: - Trên củ khoai tây: 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh, các dòng còn lại khả năng gây bệnh yếu hoặc không gây bệnh. - Trên lá địa lan : hầu nhƣ các dòng vi khuẩn không gây bệnh sau khi chủng bệnh 10 ngày, duy nhất chỉ có dòng EC06-8 gây bệnh. 4. Quy trình tách chiết DNA khá đơn giản, đảm bảo lƣợng DNA thu đƣợc có độ tinh sạch cao phục vụ tốt cho việc chạy PCR. Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ ở mục 3.2.6. 5. Kết quả phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 đã khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1,5 kb. 5.2. Đề nghị Từ những khó khăn, trở ngại gặp phải trong quá trình nghiên cứu nên chúng tôi có thể đƣa ra một số đề nghị sau: 1. Cần có những nghiên cứu cụ thể hơn về đặc điểm sinh trƣởng và phát triển, tiến hành thử các phản ứng sinh hóa. Bởi vì, nguồn mẫu ban đầu là rất quan trọng, phải khẳng định chắc chắn trƣớc khi tiến hành các thử nghiệm tiếp theo ở mức độ phân tử. 2. Cần có một mẫu đối chứng dƣơng là điều rất quan trọng và cần thiết. 3. Thiết lập lại quy trình PCR cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) và hoàn thiện quy trình.
50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Trần Văn Bảo, 1999. Kỹ thuật nuôi trồng phong lan. Nhà xuất bản trẻ. 175 trang. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp - Ứng dụng). Nhà xuất bản Giáo dục. 3. Nguyễn Văn Minh, 2005. Điều tra bệnh chết cây và kỹ thuật trồng địa lan (Cymbidium) tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng. Luận văn tốt nghiệp Ngành Nông Học 2005. 4. Lê Hữu Quang, 2005. Nghiên cứu một số loại giá thể cho cây hoa địa lan (Cymbidium) trồng tại TP. Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học 2005. 5. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội. Trang 7 – 118. 6. Nguyễn Văn Tới, 2003. Một số vấn đề bảo vệ thực vật trong nuôi trồng hoa địa lan Cymbidium. http://www.lamdong.gov.vn/rauhoadl/DesktopDefault.aspx?tabid=64. 7. Trƣơng Trỗ, 1988. Đà Lạt Cymbidium. Sở khoa học, công nghệ và môi trƣờng Lâm Đồng.http://www.lamdong.gov.vn/cdrom/Dulich/Dacsan/Cymbidium/Images/cymbidium. jpg&imgrefurl=... TIẾNG NƢỚC NGOÀI 8. Aysan Y., Saygili H., Sahin F. and Mirik M. New symptoms of tomato soft rot diseases in Turkey.http://www.pubhort.org/actahort/books/695/695_32.htm.
51 9. Aysan Y., Saygili H., Sahin F. and Cetinkaya-Yildiz R. Present status of bacterial stem rot on tomato in Turkey. http://www.pubhort.org/actahort/books/695/695_10.htm. 10. Cerkaukas R. F. and Brown J. 2001. Bacterial stem and peduncle canker of greenhouse pepper. http://ginkgo.cisti.nrc.ca/ppv/RPViewDoc?_handler_=HandleInitialGet&journal=tcjpp&v olume=23&articleFile=k01-019.pdf 11. Christopher P. K. and David H. P. 1999. Ribosomal DNA Sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology, 2: 299 – 305. 12. Darrasse A., Priou S., Kotojansky A. and Bertheau Y. 1994. PCR and restriction fragment length polymorphism of a pel gen as a tool to identify Erwinia carotovora in relation to potato diseases. Applied and Environmental. Microbiology, May, p.1437 – 1443. 13. Fiori M. and Schiaffino A., 2003. Bacterial Stem Rot in Greenhouse Pepper (Capsicum annuum L. ): Occurrence of Erwinia carotovora sbsp. carotovora. J.Phytopathology. 152, 28 – 33. 14. Heidi Hyytiainen, 2005. Regulatory networks controlling virulence in the plant pathogen Erwinia carotovora ssp. carotovora. Department of Biological and Environmental Sciences. Faculty of Biosciences. University of Helsinki.57 pages. http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/bio/bioja/vk/hyytiainen/regulato.pdf. 15. Kang H. W., Kwon S. W. and Go S. J. 2003. PCR – based specific and sensitive detection of Pectobacterium ssp. carotovorum by primers generated from a URP – PCR fingerprinting – derived polymorphic band. Plant pathology. 52, 127 – 133.
52 16. Khoodoo M. H. R., Sahin F., Donmez M. F. and Jaufeerally Fakim Y. 2004. Molecular characterisation of Xanthomonas Strains isolated from aroids in Mauritius. Systematic and Applied Microbiology. 28, 366 – 380. 17. Marcos Montesano, 2002. Molecular characterization of plant defense respones to Erwinia carotovora. Division of Genetics, Department of Biosciences, Faculty of Science. University of Helsinki. 60 pages. http://ethesis.helsinki.fi/juikaisut/mat/bioti/vk/montesano/molecula.pdf. 18. McPherson M. J. and Møller S. G., 2000. PCR. BIOS. 276 pages. 19. Phokum C., Jitareerat P., Photchanachai S. and Cheevadhanarak S. Detection and classification of soft rot Erwinia of vegetables in Thailand by DNA polymerase chain reaction. http://www.actahort.org/books/712/712-121.htm. 20. Seo S. T., Furuya N., Lim C. K., Takanami Y. and Tsuchiya K. 2003. Phenotypic and genetic characterization of Erwinia carotovora from mulberry (Morus spp. ). Plant Pathology. p. 142. 21. Seo S. T., Furuya N., Lim C. K., Takanami Y. and Tsuchiya K. 2001. Phenotypic and Genetic Diversity of Erwinia carotovora ssp. carotovora Strains from Asia. J.Phytopathology.150: 120 – 127. 22. Subandiyah S., Iwanami T., Tsuyumu S. and Ieki H. 2000. Comparison of 16S rDNA and 16S/23S Intergenic Region Sequences Among Citrus Greening Organisms in Asia. Plant Dis. 84:15 – 18.
53 23. So Young Yoo, Sun Young Park, Won Min Yoo, Kyung Hee Chang, Nae Choon Yoo, June Myung Kim, Seung Min Yoo, Ki Chang Keum and Sang Yup Lee, 2002. Design of ITS and 23S rDNA – Targeted Probes and Its Usefulness for the Identification of Bacterial Pathogen. Genome Informatics. 13: 589 – 590. 24. Wright P. J. 1998. Plant disease record A soft rot of calla (Zantedeschia spp. ) caused by Erwinia carotovora subspecies carotovora. http://www.rsnz.org/publish/nzjchs/1998/42.php. 25. Yeshitila Degefu, Sanna Jokela, Erkki-Joki Tkola and Elina Virtanen, 2006. DNA based detection of blackleg and soft rot disease causing Erwinia strains in seed potatoes. http://www.smts.fi/pos06/1008.pdf. TRANG WEB http://vi.wikipedia.org/wiki/Hoa_phong_lan http://en.wikipedia.org/wiki/Erwinia http://www.soc.nii.ac.jp/jssm/Erwinia%20carotovora.jpg http://www.mientrung.com/content/view/2457/39