Luận văn: PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR (part 3)

Chia sẻ: Sadfaf Asfsggs | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:18

Thêm vào BST

Báo xấu

87
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Hình 4.2. Vi khuẩn Lxx dưới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần). Kết quả quan sát sự xuất hiện của vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nước mía dưới kính hiển vi cho kết quả: trong 6 giống mía sản xuất được khảo sát tại TTNNCMĐ thì chỉ có giống VN84-1437 và R570 là không nhiễm bệnh, còn lại 4 giống mía khác là C90-127, DLM24, VN85-1427 và ROC26 đều thấy đƣợc sự xuất hiện của vi khuẩn Lxx dưới kính hiển vi (xem Bảng 4.1). Tuy nhiên, phương pháp chẩn đoán này cho tỉ lệ kết quả...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn: PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR (part 3)

33 Hình 4.2. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần). Kết quả quan sát sự xuất hiện của vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía dƣới kính hiển vi cho kết quả: trong 6 giống mía sản xuất đƣợc khảo sát tại TTNNCMĐ thì chỉ có giống VN84-1437 và R570 là không nhiễm bệnh, còn lại 4 giống mía khác là C90-127, DLM24, VN85-1427 và ROC26 đều thấy đƣợc sự xuất hiện của vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (xem Bảng 4.1). Tuy nhiên, phƣơng pháp chẩn đoán này cho tỉ lệ kết quả dƣơng tính giả và âm tính giả khá cao. Nguyên nhân ở đây là sự phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần là rất khó khi nồng độ vi khuẩn nhiễm bệnh hiện diện trong dịch chiết thấp. Bảng 4.1. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi. TTNCMĐ Nông trƣờng Thọ Vực Giống Kết quả Giống Kết quả STT STT 1 C90-127 + 1 Mi55-14 + 2 VN84-4137 - 2 VN84-4137 - 3 DLM24 + QĐ368 3 + 4 R570 - VĐ85-177 4 + 5 VN85-1427 + 5 VN85-1427 + 6 ROC26 + Chú thích: - : Mẫu âm tính +: Mẫu dương tính. Thân mía đƣợc nhuộm bằng dung dịch thuốc nhuộm s afranin, sau 30 phút làm tiêu bản xem dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 40 và 100 lần, ta sẽ thấy có sự nhuộm màu
34 hay không nhuộm màu của các bó mạch khoẻ mạnh và bị nhiễm Lxx. (xem hình 4.3). Mạch đƣợc nhuộm màu đỏ của safranin là kết quả của sự thẩm thấu dung dịch thuốc nhuộm lên trên thân, còn mạch không đƣợc nhuộm màu là do vi khuẩn Lxx tồn tại trong bó mạch làm tắt nghẽn sự lƣu thông của dung dịch thuốc nhuộm đi lên lên trên. a b Hình 4.3. Mẫu thân nhuộm safranin dƣới kính hiển vi (x 40 lần (A) và x 100 lần (B)). Chú thích: a: mạch vàng có chứa vi khuẩn; b: mạch đỏ là không có vi khuẩn. Chẩn đoán bằng phƣơng pháp nhuộm STM cho kết quả: tất cả các giống mía sản xuất khảo sát tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực đều bị nhiễm bệnh cằn mía gốc với các mức độ nhiễm bệnh khác nhau. (xem bảng 4.2). Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc dựa trên phƣơng pháp nhuộm STM. TTNCMĐ Nông trƣờng Thọ Vực Tỉ lệ Tỉ lệ Mức độ Mức độ mạch mạch Giống nhiễm Giống nhiễm TT TT nhuộm nhuộm bệnh bệnh đỏ (%) đỏ (%) 1 C90-127 79,18 Tb Nặng 1 68,11 My55-14 Nặng 2 VN84-4137 54,67 2 82,82 Tb VN84-4137 Nặng 3 DLM24 54,67 QĐ368 3 79,18 Tb 4 R570 75,28 Tb VĐ85-177 4 79,88 Tb 5 VN85-1427 80,42 Tb Nặng 5 65,90 VN85-1427 6 ROC26 78,82 Tb Trung bình tỉ lệ 70,50 Trung bình 75,18 Trung bình mạch nhuộm đỏ Chú thích: Tb: Trung bình
35 Bảng 4.2 cho thấy tỉ lệ mạch đƣợc nhuộm màu có sự khác nhau giữa các giống: cao nhất ở giống VN84-4137 (82,82%) tại nông trƣờng Thọ Vực, thấp nhất là giống VN84-4137 và DLM24 (54,67%) tại TTNCMĐ. Điều này tƣơng đƣơng với giống VN84-4137 tại Thọ Vực bị nhiễm trung bình, giống VN84-4137 và DLM24 bị nhiễm nặng với bệnh cằn mía gốc. Về kết quả phát hiện vi khuẩn Lxx thì phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM cho kết quả ở Bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả chẩn đoán của hai phƣơng pháp: dùng kính hiển vi và nhuộm STM. TTNCMĐ Nông trƣờng Thọ Vực Phƣơng pháp Phƣơng pháp chẩn đoán chẩn đoán Giống Giống STT STT KHV STM KHV STM 1 C90-127 + + 1 + + My55-14 2 VN84-4137 - + 2 - + VN84-4137 3 DLM24 + + QĐ368 3 + + 4 R570 - + VĐ85-177 4 + + 5 VN85-1427 + + 5 + + VN85-1427 6 ROC26 + + Chú thích: STM: Nhuộm Safranin mô cây mía - : Mẫu âm tính KHV: Chẩn đoán dựa vào kính hiển vi +: Mẫu dương tính Nhận xét: Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và nhuộm STM trên các giống cho thấy rằng hầu nhƣ tất cả các giống sản xuất đƣợc kiểm tra tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực đều bị nhiễm RSD. Nguyên nhân của tình hình trên có thể là do thiếu sự nghiên cứu thống kê về tình hình bệnh, cũng nhƣ thông kê số liệu về mức độ thiệt hại do bệnh cằn mía gốc gây ra ở nƣớc ta nói chung và các giống mía ở TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực nói riêng. Từ đó ngƣời dân vẫn chƣa quan tâm đúng mức đến việc phòng chống tác nhân gây bệnh. Mặt khác, nguyên nhân cũng có thể là do triệu chứng của bệnh cằn mía gốc không đặc trƣng và khó có thể phân biệt đƣợc cây bị bệnh. Vì vậy ngƣời nông dân sẽ không biết đƣợc ruộng mình bị nhiễm bệnh cằn mía gốc khi nào và đôi khi lầm lẫn
36 rằng ruộng mình bị thiếu dinh dƣỡng hay bị sâu bệnh phá hoại. Kết quả có ý nghĩa thực tiễn trong việc thống kê tình hình nhiễm bệnh RSD trên các giống mía khảo sát. 4.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx và nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trƣờng nuôi cấy Vi khuẩn Lxx là vi khuẩn rất khó nuôi cấy trên môi trƣờng nhân tạo, khuẩn lạc vi khuẩn theo nghiên cứu là phải mất đến khoảng 22 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng đặc trƣng mới hình thành đƣợc (Stevens Brumbley, 2003). Do vậy thời gian 2 tháng để nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn Lxx trên môi trƣờng nhân tạo là quá ngắn và kết quả thu đƣợc cũng hạn chế, không có bào tử của vi khuẩn Lxx hình thành. Tuy nhiên, sau quá trình nghiên cứu chúng tôi cũng thu đƣợc một số kết quả nhất định cụ thể nhƣ sau: - Quan sát và theo dõi quá trình hình thành khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx trên môi trƣờng nuôi cấy hàng ngày kể từ lúc bắt đầu cấy đến khoảng 15 - 22 ngày (ủ ở 28OC). Theo đó thì chỉ sau khi cấy mẫu dịch chiết vào môi trƣờng nuôi cấy 1 ngày thì các vi khuẩn đã bắt đầu mọc trên môi trƣờng nuôi cấy. Đặc biệt là vào những ngày đầu tiên, đã có sự xuất hiện của các khuẩn lạc giống nhƣ khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx đƣợc Davis (1980) mô tả ,đó là khuẩn lạc nhỏ đƣờng kính từ 0,1 - 0,3 mm, không màu. Tuy nhiên sau vài ngày nuôi cấy các khuẩn lạc này lớn dần lên và có màu vàng (Hình 4.4). Thậm chí sau 15 - 20 ngày nuôi cấy vẫn còn một số vùng trên đĩa nuôi cấy có các khuẩn lạc có kích thƣớc và hình dạng tƣơng tự, tuy nhiên khi phân lập ra môi trƣờng trên đĩa khác thì lại không phải Lxx mà vẫn là loại vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng này. A B Hình 4.4. Khuẩn lạc nhỏ tƣơng tự nhƣ khuẩn lạc Lxx trên môi trƣờng sau 2 ngày nuôi cấy (A); và khuẩn lạc của nó sau khi phân lập (B).
37 - Theo quan sát thì có khoảng 3 loại vi khuẩn tồn tại trên môi trƣờng nuôi cấy và một số loài nấm. Các loại này đều phát triển trên môi trƣờng nuôi cấy đôi lúc nhanh (sau vài ngày) nhƣng cũng có lúc chậm (nhiều đĩa nuôi cấy có vi khuẩn mọc lên với hình dạng và kích thƣớc giống mô tả, khuẩn lạc này giữ nguyên hình dạng và kích thƣớc cho đến 20 ngày sau nuôi cấy). Tuy nhiên đây không phải là vi khuẩn Lxx, mà vẫn là loại vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng. Do hạn chế về mặt tài liệu nghiên cứu nên môi trƣờng mà chúng tôi sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Lxx là môi trƣờng SC (Davis, 1980) và có bổ sung thêm một số thành phần theo Stevens Brumbley (2003) là chƣa hoàn chỉnh. Theo nghiên cứu mới đây của Stevens Brumbley thì môi trƣờng thích hợp hơn và thời gian hình thành bào tử ngắn hơn (khoảng 15 ngày) là do vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng MSC (Teakle, 12992) có bổ sung thêm methionine (L. E.Camargo và ctv, 2004). Có sự tạp nhiễm trên là do thành phần môi trƣờng nuôi cấy không thích hợp, các kháng sinh và acid amin không tinh nên khó tan trong dung dịch nƣớc. Mặt khác dịch vi khuẩn đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy là dịch không vô trùng nên sẽ có rất nhiều vi khuẩn hình thành trên môi trƣờng rất giàu dinh dƣỡng cho vi khuẩn Lxx này. Do vậy cần thiết lập một quy trình chuẩn bị mẫu vô trùng dành cho nuôi cấy vi khuẩn mới có hiệu quả đƣợc. 4.2.3. PCR phát hiện vi khuẩn Lxx Song song với việc nuôi cấy vi khuẩn Lxx, chúng tôi cũng tiến hành chạy PCR trực tiếp trên dịch chiết của cây mía bị bệnh. Sau nhiều lần tiến hành thí nghiệm, thay đổi quy trình và sử dụng các chất bổ sung khác nhau vào phản ứng PCR, nhƣng kết quả PCR dựa vào cặp mồi của Stevens Brumbley (2003) đều không đạt đƣợc kết quả mong đợi. - Kết quả thí nghiệm 1: PCR theo protocol của Stevens Brumbley (2003). Kết quả điện di: Không có sản phẩm trên gel điện di. Nhận xét: Nguồn mẫu DNA đƣợc chuẩn bị theo quy trình của Stevens Brumbley (2003) để chạy phản ứng PCR. Primer đƣợc đặt mới tại công ty Biorad với trình tự đƣợc blast trên NCBI có kết quả cho bắt cặp đặc hiệu với vi khuẩn Lxx trên ngân hàng gen. Tuy nhiên kết quả điện di không có thì nguyên nhân có thể là do quy trình thực hiện chƣa tối ƣu hoặc do DNA mẫu
38 đƣa vào chƣa đƣợc biến tính tốt. - Thí nghiệm 2: Thay đổi cách chuẩn bị mẫu. Khảo sát hiệu quả của hai phƣơng pháp chuẩn bị mẫu: Biến tính bằng nhiệt và li trích DNA vi khuẩn Lxx. Chạy PCR theo thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt nhƣ ở thí nghiệm 1. Mẫu đƣợc chuẩn bị và đem đi đo OD, tính kết quả lƣợng DNA có trong mẫu và thêm vào trong thành phần phản ứng PCR với nồng độ thƣờng dùng là 0,5 μM. Kết quả: không có băng DNA trên gel điện di. Nhận xét: Do OD không có tác dụng trong trƣờng hợp này vì dịch chiết nƣớc mía có chứa nhiều nhân tố ức chế nên lƣợng DNA đo đƣợc không chính xác với thực tế DNA mẫu vi khuẩn trong mẫu. Tăng lƣợng DNA mẫu đƣa vào phản ứng PCR lên 1,5 và 2 lần cũng không cho kết quả vì điều này cũng đồng nghĩa với việc tăng các nhân tố ức chế phản ứng PCR. Hút DNA từ lớp trên của dịch biến tính đem chạy PCR. Tăng lƣợng DNA mẫu đƣa vào phản ứng với nồng độ gấp 1,5 lần, 2 lần. Kết quả: không có băng DNA trên gel điện di. Nhận xét: DNA sau khi biến tính sẽ nằm ở lớp trên dung dịch vì vậy chúng tôi sử dụng lớp này chạy PCR nhằm thu lƣợng DNA sạch, Tuy nhiên kết quả PCR không cho sản phẩm khuyếch đại thì có thể là do biến tính Lxx. Có lẽ trong quá trình biến tính vi khuẩn bằng cách gia nhiệt, thành tế bào vi khuẩn bị phá vỡ và DNA vi khuẩn Lxx thoát ra ngoài, tuy nhiên quá trình này cũng giải phóng ra các enzym phân hủy hoặc làm hƣ hỏng DNA vốn tồn tại trong tế bào. Do vậy chúng tôi thử nghiệm ly trích DNA vi khuẩn từ dịch chiết nƣớc mía. Thực hiện lọc mẫu dịch vi khuẩn ở màng lọc 0,4 μm; chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR, tƣơng tự nhƣ quy trình của Stevens Brumbley (2003). Nhận xét: Dùng màng lọc 0,4 μm lọc Lxx và kiểm tra vi khuẩn có qua lỗ lọc không bằng cách quan sát dƣới kính hiển vi. Kết quả quan sát dƣới kính hiển vi kiểm tra không thấy có sự hiện diện của vi khuẩn Lxx trong dịch lọc. Chúng tôi nhận định rằng có thể màng lọc 0,4 μm có kích thƣớc nhỏ nên vi khuẩn Lxx không qua đƣợc, hoặc có qua nhƣng ít và không thể quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi. Do vậy chúng tôi vẫn tiếp tục thực hiện cách biến tính mẫu nhƣ quy trình của Stevens Brumbley và đem do OD sản phẩm, hút DNA mẫu ở lớp trên dịch biến tính để chạy PCR nhƣng vẫn không đạt đƣợc kết quả. Kết luận: Không
39 thể loại bỏ đƣợc các nhân tố ức chế phản ứng PCR trực tiếp trong dịch chiết nƣớc mía bằng cách ly tâm đƣợc. Li trích vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía theo quy trình ly trích vi khuẩn thông thƣờng. Kết quả: Không có băng DNA vi khuẩn trên gel điện di sau li trích. Nhận xét: Có thể do lƣợng vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía có ít nên thực hiện li trích DNA không có kết quả. - Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu quả sử dụng của PVP trong PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía. Kết quả: không có sản phẩm PCR đích. Nhận xét: Tăng hàm lƣợng PVP vào phản ứng nhằm mục đích tăng cƣờng khả năng khử các nhân tố ức chế phản ứng PCR, tuy nhiên có lẽ khi nồng độ PVP cao thì nó cũng quay lại ức chế phản ứng PCR do đó chúng tôi không tăng nồng độ PVP trong các thí nghiệm tiếp theo nữa. Do vậy chúng tôi tiếp tục làm thí nghiệm theo hai hƣớng. Thứ nhất là giữ nguyên cách chuẩn bị mẫu DNA cho PCR theo Stevens Brumbley (2003) và thay đổi quy trình phản ứng. Thứ hai là thay đổi quy trình chuẩn bị mẫu DNA cho PCR. - Thí nghiệm 4: Chuẩn bị mẫu theo quy trình của Stevens Brumbley. Khảo sát ảnh hƣởng của các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt. Kết quả thí nghiệm: Không có sản phẩm trên gel điện di. Tóm lại, PCR là một hệ thống tƣơng thích các thành phần hóa chất và chu trình nhiệt. Nhiều trƣờng hợp phản ứng PCR đƣợc thực hiện từ dịch DNA mẫu ly trích với mồi chuyên biệt nhƣng vẫn không ra kết quả. Vì vậy PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía là một vấn đề rất khó thực hiện vì nguồn mẫu ban đầu là dịch chiết nƣớc mía không sạch, có chứa nhiều nhân tố ức chế phản ứng PCR. Kết quả điện di sản phẩm sau các lần chạy PCR mà không có băng DNA đích trên gel điện di thì có thể là do rất nhiều nguyên nhân: - Có thể là nguồn DNA mẫu đƣa vào trong phản ứng PCR không tinh sạch. Chúng tôi tiến hành ở đây là do trong dịch chiết có quá nhiều chất lơ lửng, ức chế phản ứng PCR. Nguồn mẫu dịch chiết mà chúng tôi dùng để chạy phản ứng PCR đƣợc thu từ những cây có triệu chứng điển hình ngoài đồng ruộng, kết hợp với kiểm tra quan sát sự xuất hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết mía dƣới kính hiển vi và dƣơng tính khi nhuộm STM. Tuy nhiên mặc dù đã xác định đƣợc lƣợng mẫu đƣa
40 vào là có vi khuẩn đích nhƣng còn quá nhiều yếu tố không thể kiểm soát đƣợc nhƣ các chất ức chế phản ứng có trong dịch chiết nƣớc mía, lƣợng mẫu DNA thích hợp đƣa vào phản ứng. - Có thể hóa chất mà chúng tôi sử dụng sau nhiều lần thực hiện phản ứng đã làm đông lạnh và rã đông nhiều lần dẫn đến sự mất hoạt tính của hóa chất đặc biệt là Taq DNA polymerase và primer. - Mặt khác các máy PCR khác nhau cũng cho kết quả khác nhau. Hiện TTPT có 3 loại máy PCR và mỗi máy có một chế độ lên xuống nhiệt độ theo chu kỳ nhiệt khác nhau (nhanh hay chậm) do vậy đây cũng là một nguyên nhân không thể loại trừ. Tuy nhiên sau khi thực hiện PCR luân phiên trên cả 3 loại máy vẫn không có kết quả.
41 Phần 5. KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ Kết luận 5.1. - Các giống mía đƣợc khảo sát không bị nhiễm SCMV. - Tỉ lệ mô cây không bị nhiễm bệnh cằn mía gốc trên các giống mía khảo sát trong phƣơng pháp nhuộm STM tại TTNCMĐ là 70,5%, tại nông trƣờng Thọ vực là 75,18%. - Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx chƣa thu đƣợc khuẩn lạc. - Phát hiện vi khuẩn Lxx dựa vào kỹ thuật PCR trực tiếp dịch chiết nƣớc mía chƣa đạt đƣợc kết quả mong muốn. Đề nghị 5.2. - Tiến hành điều tra khảo sát tình hình bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên nhiều giống mía ở các giai đoạn tăng trƣởng khác nhau, và thực hiện tại các vùng mía lận cận để có cái nhìn tổng quát và chính xác hơn về tình hình diễn biến của bệnh tại 2 khu vực này. Đặc biệt là đối với bệnh cằn mía gốc, cần tiến hành bố trí thí nghiệm trên nhiều giống khác nhau đối chứng với giống không bị bệnh, để cuối cùng có con số thống kê chính xác về tình hình và mức độ gây hại của bệnh hiện nay, từ đó có những khuyến cáo thích hợp trong việc phòng trừ và kiểm soát bệnh. - Qua quá trình tìm hiểu về bệnh cùng với sự hỗ trợ về kiến thức của GS. Stevens Brumbley (Australia), ngƣời đã có kinh nghiệm nghiên cứu lâu năm về bệnh cằn mía gốc và vi khuẩn Lxx, chúng tôi xin đề nghị về quy trình nuôi cấy thu khuẩn lạc vi khuẩn Lxx, cũng nhƣ quy trình PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía nhƣ sau trong các thí nghiệm tiếp theo nhƣ sau:  Quy trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx  Xác định triệu chứng ngoài đồng ruộng.  Xác định cây nhiễm bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp nhuộm STM.  Thu dịch chiết (tiến hành vô trùng), kiểm tra sự hiện diện của Lxx dƣới kính hiển vi điện tử hay đối pha (Phụ lục 1).  Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng MCS có bổ sung các thành phần theo Stevens Brumbley (2003) và L. E Camargo (2004).
42  Tăng sinh trong môi trƣờng lỏng S8 để thu sinh khối (Thành phần môi trƣờng nuôi cấy cho ở Bảng phụ lục 2).  Quy trình PCR phát hiện vi khuẩn Lxx:  Nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn Lxx, thực hiện li trích DNA vi khuẩn Lxx theo quy trình cho ở Phụ lục 3.  Thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Lxx  Sau khi ổn định quy trình rồi thì tiến hành PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía dựa trên đối chứng dƣơng là vi khuẩn Lxx đã nuôi cấy đƣợc.
43 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 8/2006. Báo cáo tổng kết mía đường năm 1. 2005-2006. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông 2. nghiệp. Đỗ Ngọc Diệp, 2002. Nghiên cứu sâu đục thân hại mía và biện pháp phòng trừ ở 3. vùng Đông Nam Bộ. Luận án tiến sỹ, Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần hại mía trên một số giống mới nhập nội 4. và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu vùng Đông Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Lê Song Dự, Nguyễn Thị Quí Mùi, 1997. Cây mía. Nhà xuất bản Nông nghiệp 5. Tp. Hồ Chí Minh. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà 6. xuất bản Giáo dục. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh 7. học. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh. Nguyễn Huy Ƣớc, 1994. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 8. Nguyễn Văn Tuất, 2002. Kỹ thuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng. 9. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 10. Phạm Văn Ty, 2001. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. 11. Phan Gia Tân, 1990. Cây mía. Tủ sách ĐH Nông Lâm. 12. Trƣơng Lê Bạch Liên, 2005. Điều tra và phát hiện bệnh khảm lá (Sugarcane Mosaic Virus) trên cây mía (Sacccharum spp) bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng kỹ thuật RT-PCR. Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Nông học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 13. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đoán bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 14. Andreas Westphal and T. Eril Mirkov, 2003. Need for improved detection of Ratoon stunting disease in Sugarcane in South Texas. Phytopathology 7: p 133 - 136.
44 15. Alfred. Hercules, 2000. Aurum Total RNA Mini Kit Instruction Manual Bio-Rad Laboratories, p 26-27. 16. Chemicon International, Inc - 28820 Single Oak Drive - Temecula, CA 92590, Introduction to Antibodies - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 17. Damann. K.E, Jr. 1988. Alkaline-induced metaxylem autofluorescence: a diagnostic symptom of ratoon stunting disease of sugarcane. Phytopathology 78: p 233 - 236. 18. Fegan, 1999. Sensitive and specific detection of Clavibacter xyli subsp. xyli, causal agent of ratoo stunting disease os sugarcane , with a polymerase chain reaction-based assay. Phytopathology, p 33 - 36. 19. John R. Crowther, 2001, The Elisa Guidebook – Volume 149, p 12 – 34. 20. Gillaspie Jr., A.G. Davis, M.J. (1992): Ratoonstunting disease of sugarcane. In Plant disease of International Importance. Disease of sugar, Forestand Plantation Crops, vol4 (A.N. Mukhopadhyay,J. Kamar, H.S. Chaube, U.S.Singh, eds). EnglewoodCliffs: New Jersey, Prentice Hall, p 41 – 61. 21. G.P. Rao, A. Salem Saumtally, Phillippe Rott. (2004). Sugarcane pathology. Volume III: Bacteria and nematode diseases, p 1 – 225. 22. Hoy J. W; Grisham M. P. and Damann K.E, 1999. Spread and increase of ratoon stunting disease and comparison of disease detection methods. In Plant disease. 23. Koike H, and Gillaspie A.G, 1989. Mosaic. In: Diseases of Sugarcane: Major diseases, (Edited by C. Recaud, B. T. Egan, A.G. Gillaspie, C. G. Hughes). International Society of Sugarcane Technologist, p 301-322. 24. P. Taylor and Stevens Brumbley, 2003. Development of PCR –based markers for detection of Leifsonia xyli subsp. xyli in fibrovascular fluid of infected sugarcane plants. CSIRO publishing. 25. Y Pan, 1998. A polymerase chain reaction protocol for detection of Clavibacter xyli subsp xyli, the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting. Phytopathology: p 1 – 8. 26. Biowave vol.6 No.23 2004, tomato spotted wilt virus. 27. G.A. Dafalla, Plant Pathology Centre, Faculty of Agricultural Sciences,University of Gezira, Wad Medani, Sudan. 28. Introduction to Microbiology: Virus Genomes, 2005.
xii PHỤ LỤC Phụ lục 1: Qui trình thu dịch chiết nƣớc mía. (Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006) Cắt hết lá của thân bị nhiễm bệnh. 1. - Phụ thuộc vào chiều dài của mắt mía mà cắt đoạn thân ra có chứa 3 - 4 mắt mía - Vì nồng độ vi khuẩn cao nhất ở dƣới thân cho nên lấy phần thân ở sát gốc mía. Rửa thân bằng bàn chải và lau cho khô bằng giấy lau. 2. Rửa sạch bằng nƣớc. 3. Ngâm thân mía vào trong dung dịch thuốc tẩy 10 % trong 10 phút. 4. Rửa sach dƣới vòi nƣớc máy. 5. Khử trùng thân mía bằng cồn 70 % và đốt để cho hết cồn còn dƣ. 6. Cắt một đoạn thân mía ra và khử trùng đoạn thân này. 7. Dùng bơm đẩy khí từ một đầu và thu dịch chiết ở đầu kia bằng eppendorf 8. vô trùng. Đổ dịch chiết trên vào môi trƣờng nuôi cấy MSC. Kiểm tra môi trƣờng 9. nuôi cấy hàng ngày.
xiii Phụ lục 2: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006) MÔI TRƢỜNG MSC ( CHO 1L MÔI TRƢỜNG)  Thành phần hấp vô trùng:  Thành phần lọc Corn meal agar = 17 g Glucose = 2 g Bacto-agar =4g Cysteine = 0.5 g Bacto-peptone = 8 g Bovine serum albumin = 2 g MgSO47H2O = 0.2 g H2O = 100 ml K2HPO4 (0.1 M ) = 13 ml Bovine hemin chloride = 30 ml KH2PO4 (0.1 M ) = 87 ml H2O = 800 ml Hòa tan các thành phần hấp trong nƣớc và chỉnh về pH = 7,5 với 5 N NaOH. Hấp vô trùng. Hòa tan các thành phần lọc vào trong nƣớc và thêm vào môi trƣờng đƣợc hấp khi chúng ở 55OC bằng một màng lọc vô trùng 0.22 m. MÔI TRƢỜNG LỎNG S8  Thành phần hấp vô trùng  Thành phần lọc: Bacto - Soytone = 8 g Glucose = 2 g Hemin chloride = 15 ml Cysteine = 0.5 g MgSO4 .7H2O = 0.2 g Bovine serum albumin = 2 g K2HPO4 = 0.35 g H2O = 100 ml KH2PO4 = 1.1 g H2O = 885 ml 1) Hòa tan tất cả các thành phần trong nƣớc và chỉnh về pH 6,6 bằng NaOH 5N. 2) Hấp vô trùng và trữ ở nhiệt độ phòng đến khi thêm các thành phần lọc vô trùng vào.
xiv Phụ lục 3: Quy trình li trích DNA vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006) Quy trình gồm 14 bƣớc nhƣ sau: 1) Nuôi Lxx trong 50 ml môi trƣờng lỏng S8. 2) Thu tế bào (ly tâm 6000 vòng trong 10 phút). 3) Huyền phù tế bào trong 2 ml lysis buffer (50 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA). 4) Ủ ở 37OC trong 30 phút. 5) Thêm 1/10 thể tích SDS vào để đạt nồng độ 1% SDS. 6) Thêm proteinase K đến nồng độ cuối cùng là 50 μg/ml. 7) Ủ ở 50 - 55OC trong 4 giờ. 8) Ly trích với phenol trung tính: chloroform : isoamyl alcohol cho đến khi bề mặt đƣợc rửa sạch. 9) Thêm ethanol lạnh vào với thể tích tăng 2 lần nhằm làm kết tủa acid nucleic. 10) Thu DNA bằng pipet, rửa cẩn thận bằng cồn 70%. 11) Xử lí bằng Rnase. 12) Tiếp tục thêm phenol : chloroform để kết tủa ethanol. 13) Thu DNA bằng pipet và rửa bằng cồn 70%. 14) Huyền phù DNA trong TE.
xv Phụ lục 4: Danh sách bệnh hại mía quan trọng và phổ biến. Tên Việt Nam Tên tiếng Anh Tác nhân gây hại Bệnh do nấm I Bệnh sọc nâu 1 Brown stripe Cohliobalus stenospilus (Drechs) Bênh mốc sƣơng 2 Downy mildew Peronosclerospora sacchri (T. Miyake) Bệnh đốm mắt én 3 Eye spot Bipolaris sacchari shoemaker Bênh đốm trắng 4 White speck Bipolaris sacchari T.C.Lo Bệnh cháy lá 5 Leaf scorch Stagonospora sacchari Lo and Ling Bệnh dứa 6 Pinapple disease Ceratosystis paradoxa Moreau Bệnh xoắn cổ lá 7 Pokkah boeng Fusarium moniliform Sheldon Bệnh thối đỏ 8 Red rod Colectotrichum falcatum Went Bệnh rỉ sắt đỏ 9 Rust Puccinia melanopcephala H. &P. Syd Bệnh rỉ sắt vàng 10 Rust orange P. kuehnii Butl Bệnh than 11 Smut Ustilago senaminea Syd Bệnh đốm vàng 12 Yellow spot Mycovellosiella koepket Bệnh đốm vòng 13 Ring spot Leptosphaeria sacchari van Berda de Haan Bệnh do vi khuẩn Bệnh gôm 14 Gumming diease Xanthomonas camestris pv. Vasculorum Bệnh thân ngọn đâm 15 Leaf scald Xanthomonas alibilineans (Ashby 1929) chồi Ratoon stunting Bệnh cằn mía gốc 16 Leifsonia xyli subsp xyli (Davis et al, 1980) disease Sọc đỏ 17 Red stripe Pseudomonas rubrilineans (Lee et al) Bệnh do Phytoplasma II Bênh chồi cỏ 18 Grassy shoot Bệnh trắng lá 19 White leaf III Bệnh do virus Bênh sọc vàng Chƣa rõ 20 Chlorotich streak Bệnh Fiji 21 Fiji disease Fiji disease virus Bệnh khảm 22 Mosaic Sugarcane mosaic virus Bệnh đốm sọc 23 Streak Sugarcane streak virus Vàng gân lá 24 Sugarcane yellow leaf virus
xvi Phụ lục 4: Một số hình ảnh về quá trình nghiên cứu bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc. Hình PL2. Lá mía có triệu chứng khảm. Hình PL1. Nhận dạng triệu chứng và thu mẫu. Hình PL3. Kết quả âm tính trong phân tích Hình PL4. Bệnh đốm vòng thƣờng xuất hiện trên các cây khảo sát ELISA. Hình PL5. Quá trình điều tra và thu mẫu. Hình PL6. Gốc mía bị cằn
xvii Hình PL7. Đốt thân mía bị nhiễm Lxx nên Hình PL8. Thân mía bị bệnh có đƣờng ngắn lại. kính nhỏ hơn thân bình thƣờng. Hình PL9,10. Vết đổi màu bên trong thân.