Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Áp dụng phương pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng vào giảng dạy hoá học phổ thông

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:77

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận văn nhằm khảo sát để lựa chọn ra những thí nghiệm sắc ký có thể áp dụng dạy cho học sinh phổ thông. Nghĩa là thiết bị, hoá chất, đơn giản, ít hoặc không độc hại, dễ tìm kiếm ở phòng thí nghiệm của một trường THPT ở Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Áp dụng phương pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng vào giảng dạy hoá học phổ thông

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------------------ TRẦN MẠNH CƢỜNG ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG VÀO GIẢNG DẠY HOÁ HỌC PHỔ THÔNG Chuyên ngành: Hoá phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. ĐÀO HỮU VINH HÀ NÔI – 2011
1 MỤC LỤC Trang Mở đầu 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Sơ lƣợc về lịch sử phát triển sắc ký 3 1.2. Định nghĩa, nguyên tắc của sắc ký và phân loại các phƣơng pháp sắc ký 4 1.2.1. Định nghĩa 4 1.2.2. Nguyên tắc của sắc ký 4 1.2.3. Phân loại các phương pháp sắc ký 4 1.3. Cơ sở lý thuyết về sắc ký 7 1.3.1. Các khái niệm cơ bản 7 1.3.2. Thuyết đĩa 11 1.3.3. Thuyết tốc độ 14 1.4. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) 16 1.4.1. Các chất hấp thụ dùng trong sắc ký lớp mỏng 17 1.4.2. Dung môi khai triển và thuốc thử hiện màu 18 1.5. Sắc ký giấy (paper chromatography) 18 1.5.1. Kỹ thuật tiến hành sắc ký giấy 19 1.5.2. Giấy sắc ký 19 1.5.3. Dung môi trong sắc ký giấy 20 1.5.4. Ứng dụng của sắc ký giấy 21 1.6. Sắc ký hấp phụ lỏng (trên cột) 21 1.6.1. Nguyên tắc 21 1.6.2. Ứng dụng của sắc ký hấp phụ lỏng 24 1.7. Khái quát về chất diệp lục (chlorophyl) và carotenoit 24 1.7.1. Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyl) 24 1.7.2. Carotenoit 26 1.7.3. Các phương pháp sắc ký đã được dùng để tách các diệp lục và carotenoit. 28 1.8. Khái quát về ion Co2+, Cu2+, Fe3+, Ni2+ và muối của chúng 29 1.8.1. Sơ lược về muối sắt(III) và ion Fe3+ 29 1.8.2. Sơ lược về muối đồng(II) và ion Cu2+ 31 1.8.3. Sơ lược về muối coban(II) và ion Co2+ 32 1.8.4. Sơ lược về muối niken(II) và ion Ni2+ 33 1.8.5. Các phương pháp sắc ký đã được dùng để tách các ion Fe3+, Cu2+, Co2+ và ion Ni2+ 34
2 Trang CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 35 2.1 Các hoá chất và thiết bị cần thiết 35 2.2. Chế tạo bản mỏng từ tinh bột sắn dây 36 2.3. Chiết dịch từ lá xanh 36 2.4. Tiến hành sắc ký cột 37 2.5. Tiến hành sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) 38 2.6. Tiến hành sắc ký giấy (paper chromatography) 39 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1. Sắc ký cột 40 3.1.1. Tách chất màu trong lá xanh 40 a) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi ete dầu hoả - axton. 40 b) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi toluen - axeton. 41 c) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi ete dầu hoả - axeton 42 d) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi toluen - axeton. 43 e) Pha tĩnh là glucozơ, pha động là hệ dung môi ete dầu hoả - axeton. 45 f) Pha tĩnh là glucozơ, pha động là hệ dung môi toluen - cồn etylic nguyên chất. 46 3.1.2. Tách các ion Fe3+, Cu2+, Co2+ 46 a) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi NH4NO3 4M - NH3 4M 46 b) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi CH3COONH4 1,5M -CH3COOH 1,5M 48 c) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi Axeton – HCl đặc 49 d) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi NH4NO3 4M - NH3 4M 49 e) Pha tĩnh là silicagel, pha động dung dịch axit axetic 49 f) Pha tĩnh là tinh bột sắn dây 49 2.7.3. Kết luận 49 3.2. Sắc ký lớp mỏng 50
3 Trang 3.2.1. Tách chất màu trong lá xanh 50 a) Bản mỏng của hãng Merck, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton 50 b) Bản mỏng sắc ký tự chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton 52 3.2.2. Tách các ion kim loại Fe3+, Cu2+, Co2+, Ni2+ 54 a) Bản mỏng của hãng Merck, hệ dung môi NH3 4M – NH4NO3 4M 54 b) Bản mỏng chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung môi axeton - HCl đặc 56 3.2.3. Kết luận 58 3.3. Sắc ký giấy 59 3.3.1. Tách chất màu trong lá xanh 59 a) Giấy sắc ký loại 3S, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton 59 b) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton 61 c) Giấy sắc ký là loại 3S, hệ dung môi toluen - cồn etylic tuyệt đối 63 d) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi toluen - cồn etylic tuyệt đối 65 3.3.2. Tách các ion Fe3+, Cu2+ và Co2+ 66 a) Giấy sắc ký loại 3S, hệ dung môi axeton - HCl đặc 66 b) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi axeton - HCl đặc 68 3.3.3. Kết luận 68 KẾT LUẬN CHUNG 70 KIẾN NGHỊ 71 Tài liệu tham khảo 72 I. Tiếng việt 72 II. Tiếng Anh 73
4 MỞ ĐẦU 1/Lý do chọn đề tài Sắc ký được ra đời từ năm 1903 bởi nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet), đến nay sắc ký đã phát triển mạnh mẽ trở thành môn học quan trọng của hoá phân tích hiện đại và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Nhờ có khả năng tách riêng rẽ các chất cho kết quả phân tích định tính hoặc định lượng đều rõ ràng. Sắc ký tham gia vào phân tích các mẫu phức tạp trong các lĩnh vực từ sản xuất nông nghiệp, công nghiệp đến các hoạt động phục vụ đời sống như chữa bệnh, điều tra hình sự. Ngoài ra sắc ký còn là công cụ phục vụ đắc lực cho nghiên cứu khoa học. Thí dụ trong sản xuất nông nghiệp, sắc ký góp phần tách và định lượng các chất dinh dưỡng trong sản phẩm, phân tích các độc tố, như các hóa chất bảo vệ thực vật, các kim loại nặng trong thực phẩm, nước uống… Trong chữa bệnh, sắc ký góp phần xét nghiệm mẫu bệnh phẩm, thí dụ phân tích thuốc kháng sinh, phân tích các dược phẩm, dược liệu… Sắc ký cũng phục vụ đắc lực trong quan trắc môi trường, đánh giá tác động của môi trường tới đời sống con người. Thí dụ tách và định lượng hàm lượng các chất độc hại trong không khí. Vậy dạy cho học sinh THPT kiến thức về sắc ký là rất cần thiết, tuy nhiên chương trình môn Hoá Học ở bậc học phổ thông của nước ta hiện nay chưa có phần nào nói về sắc ký. Có lẽ khó khăn là các thí nghiệm thực hành về sắc ký thường khó làm, cần nhiều máy móc hỗ trợ hiện đại đắt tiền, thời gian làm thí nghiệm lâu có trường hợp diễn ra trong thời gian dài, nhiều hoá chất khó kiếm đắt tiền không phù hợp với trường THPT. Với mong muốn có thể đưa nội dung sắc ký vào chương trình Hoá Học phổ thông ở nước ta Phó giáo sư - Tiến sĩ, Nhà giáo ưu tú Đào Hữu Vinh, đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện luận văn “Áp dụng phƣơng pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng vào giảng dạy hoá học phổ thông”. 2/ Mục đích nghiên cứu Khảo sát để lựa chọn ra những thí nghiệm sắc ký có thể áp dụng dạy cho học sinh phổ thông. Nghĩa là thiết bị, hoá chất, đơn giản, ít hoặc không độc hại, dễ tìm kiếm ở phòng thí nghiệm của một trường THPT ở Việt Nam. Chọn thành phần pha động, pha tĩnh và chất phân tích sao cho thí nghiệm dễ làm, thời gian cho một nghiệm chỉ khoảng từ 5 đến 15 phút nhưng vẫn đảm bảo chuyển tải
5 được cho học sinh những kiến thức cơ bản nhất về bản chất, nguyên lý và ứng dụng của sắc ký. 3/ Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Kiến thức về sắc ký là khá rộng, nhưng do mục tiêu đã nêu trên hơn nữa thời gian nghiên cứu và khả năng của bản thân có hạn, nên tôi chỉ tập trung nghiên cứu khảo sát việc thay đổi các hoá chất dụng cụ để thực hiện thí nghiệm sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy ở mức tách định tính các chất màu trong lá xanh (chlorophyl, carotenoit), một số ion kim loại thông dụng có màu đặc trưng (Fe3+, Cu2+, Co2+, Ni2+). 4/ Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu các tài liệu về cơ sở lý thuyết chung của sắc ký, tài liệu hướng dẫn thực hành sắc ký. Làm thực nghiệm với sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy; nghiên cứu sự thay đổi thành phần pha động, pha tĩnh và chất phân tích để tìm ra những thí nghiệm phù hợp với mục đích đã nêu.
6 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Sơ lƣợc về lịch sử phát triển sắc ký [15, 18, 19] Năm 1903 nhà thực vật học người Nga Michael Tsvet đã dùng cột nhôm oxit (có tài liệu nói cột canxi cacbonat) làm pha tĩnh và pha động là ete dầu hoả tách thành công chlorophyl từ lá cây. Ông đã giải thích hiện tượng bằng ái lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt tên phương pháp này là phương pháp sắc ký (chromatography), sắc ký nghĩa là ghi màu vì đã tách được những chất có màu. Tuy nhiên phát minh của Tsvet gần như bị lãng quên trong một thời gian dài. Mãi tới năm 1931 sau khi Vinterstin và Lederer dùng phương pháp của Tsvet tách caroten thô thành  và  caroten và nhận thấy giá trị của phương pháp về phương diện điều chế, phương pháp sắc ký mới bắt đầu được chú ý đúng mức và phát triển nhanh chóng. Đặc biệt trong những năm 30 của thế kỷ XX, nhu cầu về phân tích và tách hỗn hợp các chất trở nên rất cấp thiết nên sắc ký phát triển nhanh chóng. Năm 1938 Izmailov và Shraiber đặt nền móng đầu tiên cho sắc ký lớp mỏng và sau đó những công trình của Stahl đã làm cho sắc ký lớp mỏng phát triển nhanh chóng và ứng dụng rất rộng rãi. Năm 1941 Tiselius phát triền các kỹ thuật tách sắc ký và chỉ ra các phương pháp phân tích tiền lưu, phân tích thế đẩy và phân tích rửa giải. Cũng trong năm 1941 sắc ký phân bố ra đời khi Martin và Synge đề xuất phương pháp tách không phải theo ái lực của các cấu tử đối với chất hấp thụ, mà do sự phân bố khác nhau của các cấu tử giữa hai chất lỏng không trộn lẫn. Các tác giả trên đã phát triển một dạng mới của sắc ký phân bố: sắc ký giấy. Do có công đóng góp các tác giả đã nhận giải Nobel năm 1952. Vào năm 1941 – 1942, Martin đã làm một bước ngoặt lớn trong sắc ký do dùng sắc ký giấy tách thành công các ancaloit chiết được từ các cây thuốc. Năm 1952, Martin công bố công trình đầu tiên về sắc ký khí dựa trên sự phân bố của chất giữa pha tĩnh là chất lỏng và pha động là chất khí. Vào những năm 1970, sắc ký khí phát triển, cùng với nó, sắc ký lỏng cũng nâng cao hiệu quả của phương pháp, các vật liệu làm pha tĩnh không ngừng được cải tiến, từ đó hiệu lực của các phương pháp sắc ký đạt được những thành tựu đáng kể như tách được các hỗn hợp các chất cực kỳ giống nhau (thí dụ các nguyên tố đất hiếm), các ancaloit, các hiđrocacbon trong các mẫu dầu…Ngày nay trong sắc ký lỏng chất nhồi được cải tiến, kích thước hạt giảm xuống tới 1,5 – 1,7  m, có khả năng chịu áp suất và nhiệt độ tốt, hình thành các phương pháp cực kỳ hiệu quả (Ultra Performance Liquid Chromatography – UPLC) có thể tách nhanh các hợp chất khó trong thời gian vài chục giây. Ngoài ra phương pháp siêu tới hạn
7 (Supercritical fluid chromatography – SFC) cũng được phát triển để phù hợp với các chất có khối lượng phân tử lớn. Vào cuối thể kỷ trước, một phương pháp tách mới được đời là các phương pháp điện di, đặc biệt là điện di mao quản. Phương pháp có hiệu lực tách rất cao, nhanh, có thể tách được nhiều các đối tượng vô cơ và hữu cơ. Năm 1994, những máy điện di mao quản đầu tiên được bán trên thị trường, được sử dụng rất có hiệu quả để phân tích các dược phẩm, các mẫu sinh học, đặc biệt là các mẫu cực kỳ khó như protein, enzim… Sự phát triển phong phú của sắc ký đã làm cho danh từ “sắc ký” không còn đúng theo ý nghĩa ban đầu của nó. Tuy nhiên tất cả các phương pháp sắc ký đều có những nét chung nhất: quá trình tách dựa trên sự chuyển dịch của hỗn hợp chất phân tích qua lớp chất bất động (pha tĩnh) là chất rắn hoặc chất lỏng mang trên chất rắn hoặc giấy và sự chuyển dịch đó được thực hiện bằng một chất khí hoặc chất lỏng (pha động). 1.2. Định nghĩa, nguyên tắc và phân loại các phƣơng pháp sắc ký [10, 15] 1.2.1. Định nghĩa Tính đa dạng muôn màu của phương pháp sắc ký đã làm nảy sinh nhiều định nghĩa, nhiều tên gọi trong lĩnh vực sắc ký. Nhưng định nghĩa được nhiều nhà hoá học thừa nhận là hoàn chỉnh nhất, tổng quan nhất như sau: Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh. - Một hệ sắc ký bao gồm: chất phân tích, pha tĩnh và pha động. 1.2.2. Nguyên tắc của sắc ký Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: một pha thường cố định gọi là pha tĩnh(stationary phase) và một pha chuyển động gọi là pha động (mobile phase). Khi cho mẫu chứa hỗn hợp chất cần phân tích đã được hoà tan trong dung môi thích hợp (pha động) di chuyển qua pha tĩnh do sự phân bố các chất cần phân tích giữa hai pha là khác nhau nên tốc độ di chuyển của chúng khác nhau và sẽ được tách khỏi nhau sau một thời gian nhất định. 1.2.3. Phân loại các phƣơng pháp sắc ký 1.2.3.1. Phân loại theo trạng thái liên hợp của pha động và pha tĩnh - Theo cách phân loại này tất cả các phương pháp sắc ký được phân thành hai nhóm lớn theo pha động: sắc ký lỏng và sắc ký khí. Đây là cách phân loại lôgic nhất và được sử dụng rộng rãi. - Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng (được mang trên chất rắn). 1.2.3.2. Phân loại theo cơ chế của quá trình tách
8 Phương pháp phân loại này dựa trên cơ chế của quá trình hấp thụ - giải hấp thụ, nghĩa là theo tương tác của chất được sắc ký với pha động. Có bốn cơ chế sắc ký chính sau đây. A. Sắc ký hấp phụ. Sự tách do ái lực khác nhau của các chất đối với chất hấp phụ rắn (pha tĩnh). Đối với các chất hấp phụ phân cực, ái lực đó chủ yếu do tương tác của các cực. Do đó các nhóm phân cực trong phân tử ảnh hưởng tới kết quả tách mạnh hơn các mạch hiđrocacbon không phân cực. B. Sắc ký phân bố. Trong phương pháp này người ta lợi dụng sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha tĩnh lỏng (được giữ bởi chất mang rắn) và pha động. Trong sắc ký lỏng pha tĩnh thường phân cực hơn pha động, tuy nhiên cũng có trường hợp ngược lại. Về nguyên tắc có thể có rất nhiều tổ hợp hai pha lỏng. Tuy nhiên trong thực tế số đó bị hạn chế rất lớn. Như chúng ta đã biết qui tắc về độ tan “các chất giống nhau hoà tan vào nhau”, do đó độ phân cực của các chất được sắc ký cũng như của các pha tĩnh và pha động có ảnh hưởng tới quá trình tách. C. Sắc ký trao đổi ion. Sự tách xảy ra do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch đối với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn là pha tĩnh. Chất rắn quan trọng nhất trong trường hợp này là các nhựa trao đổi ion. Sắc ký trao đổi ion chủ yếu dùng trong dung môi là nước hoặc hỗn hợp nước - dung môi hữu cơ trong môi trường có độ điện môi tương đối lớn để các ion có thể tồn tại tự do và bền. D. Sắc ký rây phân tử. Trong phương pháp này người ta sử dụng các vật liệu rắn có độ xốp lớn. Có các lỗ với kích thước nhất định để rây chọn lọc các cấu tử tuỳ theo kích thước và hình dạng phân tử. Các zeolit tổng hợp có giá trị rất lớn trong sắc ký rây các chất khí. Có thể dùng các hợp chất vô cơ, hữu cơ, polime tổng hợp để tách các chất vô cơ và hữu cơ; đặc biệt nhóm polime ưa nước (loại dextran mạng) được dùng để tách các chất có hoạt tính sinh học. Ngoài ra còn có các loại sắc ký kết tủa, sắc ký tạo phức, sắc ký oxi hoá- khử, nhưng chúng ít có giá trị thực tế. Cuối cùng cần nhấn mạnh rằng, đối với một quá trình sắc ký có một cơ chế chủ đạo, nhưng có thể xảy ra các cơ chế phụ khác. Ví dụ trong sắc ký hấp phụ có thể có một phần trao đổi ion (hấp phụ hoá học, tạo phức) hoặc cơ chế phân bố. 1.2.3.3. Phân loại theo cách hình thành sắc đồ. Cơ sở của phương pháp phân loại này dựa trên cách chuyển dịch tương đối của pha động so với pha tĩnh. Có thể khai triển sắc đồ theo ba phương pháp: tiền lưu,
9 đẩy và rửa giải. Phương pháp rửa giải quan trọng và phổ biến nhất, sau đó là phương pháp đẩy, còn phương pháp tiền lưu ít được sử dụng. A. Phương pháp tiền lưu. Theo phương pháp này, người ta cho hỗn hợp chất phân tích, ví dụ, dung môi chứa các cấu tử A, B liên tục đi vào lớp đầu tiên của pha tĩnh (đầu cột) và di chuyển tới lớp cuối cùng của pha tĩnh (cuối cột). Nếu chất B bị hấp thụ mạnh hơn chất A thì tuyến dung môi phía trước sẽ nghèo cấu tử B hơn và kết quả là dung môi đi ra khỏi cột chứa cấu tử A nguyên chất. Cấu tử B sẽ không bị hấp thụ ở những lớp chất hấp thụ đã bão hoà cấu tử B và chuyển động dọc cột cùng với cấu tử A. Cuối cùng dung môi chứa hỗn hợp A, B đi ra khỏi cột. Như vậy phương pháp này cho phép thu được một lượng nào đó A nguyên chất. B. Phương pháp đẩy. Nguyên tắc của phương pháp này là đưa một mẫu tương đối nhỏ hỗn hợp chất phân tích chứa các cấu tử A, B lên lớp đầu của pha tĩnh (lúc này xảy ra quá trình tiền lưu nhưng rất ít). Sau đó cho dung môi chứa chất E (pha động) đi qua. Điều kiện quan trọng là chất E bị hấp thụ mạnh hơn A, B. Do đó E đẩy các cấu tử A, B chuyển động xuống phía dưới. Vì B bị giữ mạnh hơn A cho nên B lại đẩy A về phía trước. Kết quả ta được các vùng A nguyên chất, B nguyên chất và pha động chứa E nguyên chất Hình 1.1. Phương pháp đẩy Như vậy, khác với phương pháp tiền lưu, nhờ phương pháp đẩy ta có thể thu được các phân đoạn chứa từng cấu tử nguyên chất. C. Phương pháp rửa giải. Trước hết đưa các mẫu nhỏ gồm hỗn hợp các cấu tử A, B vào lớp đầu tiên của pha tĩnh. Giả sử B bị hấp thụ mạnh hơn A. Sau đó cho pha động chứa cấu tử E đi qua cột. Điều kiện quan trọng là cấu tử E bị hấp thụ yếu hơn cả. Lúc đó pha động sẽ rửa A, B với tốc độ khác nhau tuỳ theo mức độ các cấu tử đó bị pha tĩnh giữ. Vì A bị hấp thụ yếu hơn nên nó dịch chuyển nhanh hơn cùng với pha động.
10 Đó là kết quả của sự chuyển dịch cân bằng hấp thụ-giải hấp thụ giữa các cấu tử A, B, E. Nếu tốc độ chuyển dịch của A, B đủ khác nhau, thì các vùng A, B chồng chập nhau lúc đầu dần dần được tách ra và cuối cùng tạo thành hai vùng riêng biệt và được ngăn cách bởi dung môi nguyên chất (chứa E). Vùng A chuyển dịch trước vùng B Hình 1.2. Phương pháp rửa giải Nếu đường đẳng nhiệt hấp thụ là tuyến tính, thì đường cong biểu diễn sự biến thiên nồng độ các cấu tử có dạng hình chuông (phân bố Gauss). Nhược điểm của phương pháp này là dùng lượng lớn dung môi do đó nồng độ chất đi ra khỏi đầu cột rất loãng. 1.2.3.4. Phân loại theo thiết bị hình thành sắc đồ. Theo phương pháp phân loại này, tất cả các phương pháp sắc ký được chia thành hai nhóm: Sắc ký cột và sắc ký phẳng. Trong sắc ký cột (kể cả sắc ký cột mao quản) quá trình tách hỗn hợp được thực hiện trên các cột hình tròn nạp các chất hấp thụ thích hợp. Còn trong sắc ký phẳng sự hình thành sắc đồ được tiến hành trên các lớp phẳng chất hấp thụ (giấy hoặc lớp mỏng). Cuối cùng cần nói rằng tuyệt đại đa số phương pháp sắc ký đều tiến hành theo lối động, nghĩa là một pha đứng im và một pha chuyển động; tuy nhiên có một số trường hợp tách theo lối tĩnh nghĩa là cả hai pha đều đứng im tương đối và phải khuấy trộn mạnh để cân bằng hấp thụ - giải hấp thụ xảy ra nhanh. Lý thuyết sắc ký không áp dụng cho lối tĩnh. 1.3. Cơ sở lí thuyết về sắc ký [10, 15] 1.3.1. Các khái niệm cơ bản . Hệ số phân bố Một cấu tử A cho tiếp xúc với pha động và pha tĩnh sẽ phân bố giữa hai pha theo tỷ số nồng độ nhất định, như vậy, nó có hệ số phân bố riêng, nói một cách khác cân bằng phân bố được thiết lập, có phương trình:
11   Am As   (3.1) Hệ số phân bố là tỷ số nồng độ chất phân tích giữa hai pha [A s ] KD = (3.2) [A m ] Trong đó [As] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh [Am] là nồng độ chất phân tích trong pha động . Mối liên hệ giữa hệ số phân bố và tốc độ di chuyển của các chất trong hệ sắc ký. Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động. Gọi fa là phần thời gian của chất A ở pha động fa = Số milimol A trong pha động/số milimol A trong toàn cột [A]m .Vm fa = (3.3) [A]m .Vm +[A]s .Vs Biến đổi phương trình 3.3 (chia phân sôa cho [A]m.Vm ta có: 1 fa  (3.4) Vs 1  K DA Vm Vs 1 Đặt k 'A  K DA . , ta có f A  (3.5) Vm 1  k ,A Trong đó k ,A được gọi là hệ số lưu. Tốc độ tuyến tính của cấu tử A trong pha động, UA là: u u A  u.f A hay u A  (1  k ,A ) u là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s). Qua đó ta thấy hệ số KD và hệ số lưu k ,A đều tỉ lệ nghịch với tốc độ di chuyển của chất tan. . Thời gian lƣu tR và thời gian lƣu hiệu chỉnh tR’ Thời gian lưu tR là thời gian tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới khi pic đạt giá trị cực đại. L L(1  k ,A ) t RA   uA u L/u = tm là thời gian cấu tử không lưu giữ trên cột, còn gọi là thời gian chết. Vs t RA  t m (1  K DA . )  t m (1  k ,A ) (3.6) Vm Thời gian lưu hiệu chỉnh t’R là thời gian lưu không tính thời gian chết , , t’RA = tRA – tm = tm.k’A  k ,A  t R  VR (3.7) tm Vm . Thể tích lƣu VR và thể tích lƣu hiệu chỉnh VR’ Thể tích lưu VR là thể tích của dung dịch rửa giải tính từ khi bắt đầu bơmmẫu
12 vào cột đến khi pic đạt giá trị cực đại. Gọi F là tốc độ chảy của pha động (ml/phút). Thể tích lưu VR được tính theo công thức: VRA = tRA.F; Vm = tm.F; thay vào 3.6 ta có VRA = Vm(1+ K’A) (3.8) Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R là thể tích lưu để loại đi thể tích trống của cột. V’RA = VR – Vm = Vm.k’A = KDA.Vs (3.9) Thể tích lưu riêng Vg là thể tích đặc trưng riêng cho cấu tử, là thể tích dung dịch rửa giải để rửa giải chất phân tích trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích của pha tĩnh. V’RA/Vs = KDA = Vg . Hệ số tách Hệ số tách  là đại lượng đánh giá khả năng tách 2 chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố của chúng và là tỉ số của hệ số phân bố của 2 chất, một chất phân tích A và một chất khác B hoặc một chất chuẩn. Điều kiện cần thiết để hai chất A và B tách khỏi nhau là   1 (3.10) Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và pha động phải khác nhau. Mặt khác từ số thể tích lưu riêng của hai chất, t’RA/t’RB cũng chính là tỉ số của hệ số phân bố K DA k ,A t ,RA VRA , Vậy có thể tóm tắt là:      , K DB k ,B t ,RB VRB . Đĩa lý thuyết + Khái niệm đĩa lý thuyết Đĩa lí thuyết là phần nào đó của cột mà ở đó cân bằng được thiết lập. Theo quan niệm của Martin và synge, cân bằng phân bố được thiết lập nhanh chóng, tức thời. Tuy nhiên điều này gặp khó khăn khi giải thích sự giãn rộng vùng mẫu, hiện tượng pic sắc ký không cân đối. Amoudson và Lapidus và sau đó là Van Deemter cho rằng đĩa được hình thành khi đạt cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại, + Sắc đồ và tính số đĩa lí thuyết Sắc đồ là đường biểu diễn sự phụ thuộc diện tích S hoặc chiều cao h tín hiệu đo được có thể là độ hấp thụ quang, cũng có thể là độ dẫn điện, hoặc tần số xung điện…liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có trong mẫu và thời gian. Các tín hiệu này được gọi là “pic” sắc ký. Định lượng các chất phân tích dựa vào diện tích pic sắc ký là chính xác nhất. Ngày nay, hầu hết các máy sắc ký hiện đại đều được trang bị phần mềm để tính diện tích của pic một cách tự động. Có thể hiểu rằng phần nào đó của cột được gọi là đĩa lí thuyết khi cân
13 bằng phân bố chất phân tích tại đó được đáp ứng. Gọi N là số đĩa lí thuyết,  là độ lệch chuẩn;  tỉ lệ thuận với N . Đối với cột sắc ký N càng lớn pic càng hẹp, thời gian lưu tR tỉ lệ thuận với số đĩa lí thuyết N, nên ta có thể viết: tR N t  hay N  ( R )2 (3.11)  N  w Mặt khác w = 4  hay   4 Số đĩa lí thuyết N có thể viết lại là: tR 2 t N  16( )  5,54( R ) 2 (3.12) w w1/2 Trong sắc ký cột nhồi, số đĩa lí thuyết được tính tương đối dựa vào chiều dài cột và chiều cao đĩa lí thuyết, H  2-3dp . Độ phân giải Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử ra khỏi nhau trong một phép tách sắc ký. Hay cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để, độ phân giải càng cao. Độ phân giải được đánh giá qua các đại lượng đặc trưng là: thời gian lưu tRA, tRB, độ rộng pic wA, wB. 2(t RB  t RA ) t RB  t RA Độ phân giải R được định nghĩa: R   (3.13) WA  WB WA WB  2 2 Trong đó: tRB – tRA = t R là sự chênh lệch thời gian lưu (cũng có thể dùng thể tích lưu VRA – VRB) của hai cấu tử A và B. Đại lượng này được so sánh với tổng bán chiều rộng pic, đo bằng giây hoặc ml nói lên khả năng tách của cột. Khi R = 1, hai cấu tử A và B mới tách khỏi nhau đạt 95%, nghĩa là còn 2,5% của A ở trong B, 2,5% ở trong A. Khi R = 1,5 thì hai cấu tử A và B đã tách khỏi nhau đạt 99,8% có nghĩa là còn 0,1% A ở trong B và ngược lại. Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lý thuyết tăng: t R  N , chiều rộng pic tỉ lệ với N N R hay R  L N Thí dụ tăng gấp đôi chiều dài cột, độ phân giải mới R’ sẽ là R’= 2R Cách làm tăng độ phân giải a) Dựa trên sự thay đổi cấu trúc cột: - Tăng chiều dài cột - Sử dụng chất nhồi có kích thước hạt nhỏ hơn, đồng đều hơn. - Thay đổi pha tĩnh. - Giảm đường kính cột.
14 b) Dựa trên thay đổi vận hành cột - Tối ưu hoá tốc độ pha động. - Giảm lượng mẫu. - Giảm nhiệt độ (GC). - Thay đổi thành phần pha động (LC) 1.3.2. Thuyết đĩa * Thiết lập phƣơng trình rửa giải Đĩa lý thuyết là một khái niệm vừa trừu tượng vừa hiện thực. Nó hiện thực ở chỗ là một phần của cột sắc ký, tuy nhiên nó cũng trừu tượng ở chỗ không thể phân biệt được ranh giới cụ thể của nó. Có thể định nghĩa: “đĩa lý thuyết là phần nào đó của cột mà trên đó cân bằng phân bố được thiết lập trong quá trình tách”. Số đĩa lý thuyết của một sắc ký thường không cố định cho một cột sắc ký nào, thậm chí cho các phép sắc ký khác nhau trên cùng một cột. Gọi là thuyết đĩa vì các tác giả đã xây dựng phương trình tính thể tích lưu cho phép tách sắc ký dựa trên việc tính toán lượng chất tan có trong từng đĩa lý thuyết. Đặt KD là hệ số phân bố, V là thể tích trống của một đĩa và Vm là thể tích trống của toàn cột. Gọi Sx,n là phần chất phân tích đi vào pha tĩnh, Lx,n là phần chất phân tích còn lại ở pha động. Theo định nghĩa về hệ số phân bố ta có: Sx,n KD  (3.14) L x,n Trong đó x là số lần đưa V ml dung dịch rửa giải vào, n là số thứ tự của đĩa Khi nạp chất phân tích Mẫu được nạp vào đĩa số 0, tại đây, cân bằng phân bố được thiết lập: S0,0 = KD.L0,0 (3.15) Mặt khác do nạp chất phân tích vào cột là 1 đơn vị khối lượng, ta có: S0,0 + L0,0 = 1 (3.16) Thay (3.15) vào (3.16) ta có: KD.L0,0 + L0,0 = 1 1 Từ đó dễ dàng suy ra: L0,0  (3.17) 1 KD KD Và S0,0  (3.18) 1 KD Khi đƣa 1V ml dung dịch rửa giải vào: Pha động của đĩa số 0 di chuyển xuống đĩa số 1. Tại đĩa số 0: Chất phân tích từ đĩa số 0 phân bố lại: KD S1,0  L1,0  S0,0  từ (3.14) ta có S1,0  K D .L1,0 thay vào biểu thức vừa rồi (1  K D )
15 KD ta có: K D .L1,0  L1,0  suy ra: (1  K D ) KD K 2D L1,0  ; S  (3.19) (1  K D )2 (1  K D )2 1,0 Tại đĩa số 1: Khi x = 1, toàn bộ chất phân tích ở pha động ở đĩa số 0 chuyển xuống đĩa số 1, phân bố vào pha tĩnh và pha động, ta có 1 S1,1  L1,1  L0,0  từ (3.14) ta có S1,1  K D .L1,1 thay vào biểu thức vừa rồi ta (1  K D ) 1 có: K D .L1,1  L1,1  và suy ra: (1  K D ) 1 KD L1,1  ; S1,1  (3.20) (1  K D ) 2 (1  K D )2 Khi đƣa 2V ml dung dịch rửa giải vào: Tại đĩa số 0: Pha động của đĩa số 0 lại di chuyển xuống đĩa số 1 lần nữa, sau đó cân bằng tại đĩa này lại được phân bố lại, ta có: K 2D S2,0  L2,0  S1,0  từ (3.14) ta có S2,0  K D .L2,0 thay vào biểu thức vừa rồi ta (1  K D )2 K 2D có: K D .L2,0  L2,0  và suy ra: (1  K D )2 K 2D K 3D L2,0  ; S  (3.21) (1  K D )3 (1  K D )3 2,0 Tại đĩa số 1: Khi x = 2, lượng chất phân tích trong đĩa 1 gồm 2 nguồn, một là do từ đĩa số 0 chuyển xuống, và hai là do từ pha tĩnh của đĩa số 1 cân bằng lại: KD KD 2K D S2,1  L2,1  S1,1  L1,0    (1  K D ) (1  K D ) 2 2 (1  K D )2 từ (3.14) ta có S2,1  K D .L2,1 thay vào biểu thức vừa rồi ta có: 2K D K D .L2,1  L 2,1  và suy ra: (1  K D ) 2 2K D 2K 2D L2,1  ; S  (3.22) (1  K D )3 (1  K D )3 2,1 Tại đĩa số 2: Khi x = 2, toàn bộ chất phân tích ở pha động của đĩa số 1 chuyển xuống đĩa số 2, phân bố vào pha tĩnh và pha động, ta có: 1 S2,2  L2,2  L1,1  (1  K D )2
16 từ (3.14) ta có S2,2  K D .L2,2 thay vào biểu thức vừa rồi ta có: 1 K D .L2,2  L2,2  và suy ra: (1  K D )2 1 KD L2,2  ; S2,2  (3.23) (1  K D ) 3 (1  K D )3 Tính toán tương tự cho các đĩa tiếp theo lượng chất trong pha động có kết quả như ở bảng sau: Bảng 1.1. Giá trị của Lx,n n=0 n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 x=0 1 1 KD x=1 KD 1 (1  K D ) 2 (1  K D ) 2 x=2 K 2D 2K D 1 (1  K D )3 (1  K D )3 (1  K D )3 x=3 K 3D 3K 2D 3K D 1 (1  K D ) 4 (1  K D ) 4 (1  K D ) 4 (1  K D ) 4 x=4 K 4D 4K 3D 6K 2D 4K D 1 (1  K D )5 (1  K D )5 (1  K D )5 (1  K D )5 (1  K D )5 x=5 K 5D 5K 4D 10K 3D 10K 2D 5K D 1 (1  K D )6 (1  K D )6 (1  K D )6 (1  K D )6 (1  K D )6 (1  K D )6 x=6 K 6D 6K 5D 15K 4D 20K 3D 15K 2D 6K D (1  K D )7 (1  K D )7 (1  K D )7 (1  K D )7 (1  K D )7 (1  K D )7 x=7 K 7D 7K 6D 21K 5D 35K 4D 35K 3D 21K 2D (1  K D )8 (1  K D )8 (1  K D )8 (1  K D )8 (1  K D )8 (1  K D )8 Phương trình tổng quát tính lượng chất phân tích cho một đĩa bất kỳ như sau: Sx,n + Lx,n = Sx-1,n + Lx-1,n-1 (3.24) x! K Dx n 1 Sx,n  . (3.25) (x  n)!n! (1  K D ) x 1 x! K Dx n L x,n  . (3.26) (x  n)!n! (1  K D ) x 1 Điều kiện x  n , nếu x < n thì Lx,n = 0; Sx,n = 0 Khi x tăng, Lx,n sẽ qua giá trị cực đại sau đó giảm dần tới 0. Trong sắc ký, số đĩa lý thuyết thường rất lớn. Giá trị Lx,n tại cực đại được ký hiệu là Lx*,n sẽ không khác nhau nhiều so với Lx-1,n. Ta có thể viết: Lx*,n = Lx*-1,n. Giá trị của n rất lớn, như vậy, giá trị của Lx*,n được viết lại là:
17 K Dx n (x*  1)! K Dx 1n * * x* ! L x* ,n  * .  L  . (x  n)!n! (1  K D ) x 1 x* 1,n (x *  1  n)!n! (1  K D ) x * * Nhân cả hai vế của phương trình trên với phân số: (x*  1  n)!n! (1  K D ) x * . ta có: (x*  1)! K Dx 1n * K Dx n (x*  1  n)!n! (1  K D ) x * * x* ! x* KD . . .  * . 1 (x  n)!n! (1  K D ) * x*  n (x  1)! * KDx* 1 n x  n 1 KD x*.K D  (x*  n).(1  K D ) ; rút ra được: x* = n(1+KD) (3.27) x*.V = VR là lượng dung dịch tại cực đại của đường cong rửa n.V = Vm là thể tích trống của cột. Nhân phương trình (3.27) với V ta có phương trình quan trọng để giải thích quá trình sắc ký: VR = Vm(1+KD) (3.28) 1.3.3. Thuyết tốc độ, phƣơng trình Van Deemter Sự giãn rộng vùng mẫu Theo thuyết này, yếu tố tốc độ của pha động có vai trò cực kỳ quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký. Sự giãn rộng vùng mẫu mà nguyên nhân sâu xa là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh bị ảnh hưởng nhiều bởi tốc độ pha động. Ngoài ra, đường kính hạt nhồi, kỹ thuật nạp cột..., cũng ảnh hưởng rất nhiều tới sự giãn rộng vùng chất phân tích, ảnh hưởng tới độ rộng của pic thu được trong sắc đồ. Các tác giả đưa ra đại lượng đặc trưng cho độ giãn rộng của vùng chất phân tích là chiều cao đĩa lý thuyết, H. Chiều cao đĩa lý thuyết được cấu thành do 3 yếu tố H1, H2, H3 là 3 đại lượng độ giãn rộng thành phần. H = H1 + H2 + H3 (3.29) H1 là đại lượng khuếch tán xoáy, đặc trưng cho độ đồng đều của hạt nhồi, đường kính hạt nhồi, khả năng nạp cột, được viết: H1  2d p (1.30) trong đó  là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt,  = 1,5; d p là đường kính hạt nhồi H2 là đại lượng khuếch tán theo chiều dọc. Nó được hình thành do sự khuếch tán của chất phân tích về hai đầu của cột, phụ thuộc vào tốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động, đường đi của chất phân tích, được biểu diễn bằng phương trình: H2 = B/u Trong đó B  2 Dm là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và hệ số đường đi của nó. Trong điều kiện nạp cột tốt,
18 đường đi của chất phân tích không quá khúc khuỷu,   1 ; Dm là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động, như vậy, H2 có thể viết là: H2  2 Dm / u (1.31) H3 là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng, là yếu tố phụ thuộc nhiều vào tốc độ hấp thụ và giải hấp. Quá trình này phụ thuộc vào cả pha tĩnh và pha động vì vậy H3 có thể viết: H3  (Cs  Cm )u (1.32) trong đó Cs là hệ số đặc trưng cho sự chuyển khối của chất phân tích trong pha tĩnh phụ thuộc vào pha tĩnh, nó có giá trị nhỏ, khi tốc độ dòng, F  1ml / phút, Cs  0 . Cs  K.d f2 / Ds (1.33) K – là hệ số. Ds – là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh. d f2 - là chiều dày pha tĩnh. Cm là hằng số đặc trưng cho sự chuyển khối của chất phân tích trong pha động, phụ thuộc vào pha động, Cm   d p2 / Dm (1.34)  là hệ số thực nghiệm, có giá trị 0,5-1 D m là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động. Tổng hợp lại, H có biểu thức tổng quát là: H  2d p  2 Dm / u  (K.d f2 / Ds   d p2 / Dm )u (1.35) Phương trình (1.35) thường được viết tắt là H = A + B/u + Cu Trong thực tế có thể tính gần đúng H  3  4d p Để xét cực tiểu chiều cao đĩa lý thuyết, lấy đạo hàm phương trình Van Deemter, ta có: H'  B/ u 2  C. Tại cực tiểu, H'  0 hay B/ u 2  C  0  u2t.ư=B/C 2 1/2  u t.ư= (B/C) (1.36) 1/2  Hmin = A + 2.(B/C) (1.37)
19 Hình 1.3. Đường cong Van Deemter Ngoài ra còn có các yếu tố làm giãn rộng vùng mẫu do nguyên nhân ở ngoài cột như thể tích pha động giữa đầu ra cột sắc ký và detector lớn, thể tích mẫu bơm vào cột lớn, lượng mẫu lớn… Vì mục đích và phạm vi nghiên cứu của luận văn đã được trình bày ở trên nên chúng tôi sẽ giới thiệu chi tiết hơn về sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography), sắc ký giấy (paper chromatography) và sắc ký hấp phụ lỏng trên cột (Adsorption liquid chromatography on columns) 1.4. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) [15, 18] Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn – lỏng. Trong đó pha động là chất lỏng được đi xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ như silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic. Do chất hấp thụ được tráng thành lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng (hay sắc ký lớp mỏng). Trước đây Sắc ký lớp mỏng chủ yếu dùng trong phân tích định tính, nhưng đến nay đã áp dụng sang cả phân tích định lượng do những tiến bộ của kỹ thuật làm tăng tính lặp lại và độ chính xác. Hệ số di chuyển Rf là đại lượng đặc trưng quan trọng về mức độ tách. Hệ số di chuyển R f được tính theo công thức: l v Rf  hoặc R f  l0 v0