intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của lumbrokinase ở Pichia pastoris

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:94

Thêm vào BST
Báo xấu
13
lượt xem 3
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn tập trung giải quyết các vấn đề sau: Sử dụng công nghệ gen và công nghệ protein để biểu hiện và tinh sạch được enzyme lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin; nghiên cứu một số tính chất của enzyme LK tái tổ hợp tinh sạch được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của lumbrokinase ở Pichia pastoris

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ BÍCH NGỌC BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA LUMBROKINASE Ở PICHIA PASTORIS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ BÍCH NGỌC BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA LUMBROKINASE Ở PICHIA PASTORIS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. QUYỀN ĐÌNH THI PGS. TS. TRỊNH HỒNG THÁI Hà Nội - 2014
  3. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Quyền Đình Thi- Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme- Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, người thầy đã rất quan tâm, tận tình chỉ bảo, định hướng nghiên cứu và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình công tác, học tập, tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái- Trưởng phòng Proteomic và Sinh học cấu trúc- Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học quốc gia Hà Nội, người thầy đã tạo nền tảng cho tôi từ những ngày đầu tiên làm quen với sinh học thực nghiệm. Thầy đã rất nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập tại trường, sửa chữa luận văn và động viên tôi trong thời gian nghiên cứu. Để thực hiện tốt luận văn này, tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình giảng dạy và dìu dắt tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự chỉ bảo nhiệt tình, sự giúp đỡ, chia sẻ những kinh nghiệm trong công việc và cuộc sống của TS. Đỗ Thị Tuyên, TS. Lý Thị Bích Thủy cùng các anh chị và các bạn học viên, sinh viên làm việc tại Phòng Công nghệ sinh học Enzyme- Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Tôi xin chân thành cảm ơn. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và luôn bên tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Học viên Vũ Thị Bích Ngọc Vũ Thị Bích Ngọc i Cao học K20
  4. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................i MỤC LỤC ................................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ v DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................vi BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................... viii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TẮC NGHẼN MẠCH MÁU .................................3 1.1.1. Sơ lƣợc về bệnh tắc nghẽn mạch máu ........................................................3 1.1.2. Quá trình đông máu và cơ chế tan huyết khối ............................................3 1.1.3. Một số thuốc điều trị tắc nghẽn mạch máu ................................................6 1.2. KHÁI QUÁT VỀ ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN ......................................9 1.2.1. Một số nguồn sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin ..............................9 1.2.2. Phân loại enzyme thủy phân fibrin ...........................................................11 1.3. KHÁI QUÁT VỀ ENZYME LUMBROKINASE .........................................12 1.3.1. Cấu trúc và đặc tính của lumbrokinase ....................................................12 1.3.2. Tình hình nghiên cứu lumbrokinase ở Việt Nam .....................................15 1.3.3. Tình hình nghiên cứu lumbrokinase trên thế giới ....................................16 1.4. HỆ BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS .............................................................19 1.4.1. Khái quát về hệ biểu hiện Pichia pastoris................................................19 1.4.2. Chuyển gen ngoại lai vào genome nấm men............................................22 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP................................................... 24 2.1. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT ..........................................................................24 2.1.1. Vật liệu .....................................................................................................24 Vũ Thị Bích Ngọc ii Cao học K20
  5. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học 2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................24 2.1.3. Các dung dịch và đệm ..............................................................................25 2.1.4. Môi trƣờng ................................................................................................26 2.1.5. Máy móc và thiết bị ..................................................................................27 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................28 2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy ..............................................................................28 2.2.2. Khảo sát điều kiện nuôi cấy biểu hiện LK tái tổ hợp ...............................29 2.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp ......................................................................29 2.2.4. Tách fibrinogen ........................................................................................30 2.2.5. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin .........................................................31 2.2.6. Xác định hàm lƣợng protein .....................................................................32 2.2.7. Xác định các yếu tố ảnh hƣởng lên hoạt tính và độ bền của enzyme ......33 2.2.8. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) ..........................................................34 2.2.9. Phản ứng nối ghép gen ngoại lai ..............................................................35 2.2.10. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli .............................................35 2.2.11. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli .............................................36 2.2.12. Điện di DNA trên gel agarose ...............................................................36 2.2.13. Xử lí DNA plasmid bằng enzyme cắt giới hạn ......................................37 2.2.14. Tinh sạch DNA gel agarose....................................................................37 2.2.15. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào nấm men bằng phƣơng pháp xung điện .....................................................................................................................38 2.2.16. Tách chiết DNA tổng số nấm men .........................................................39 2.2.17. Điện di protein trên gel polyacrylamide ( SDS- PAGE) ........................40 2.2.18. Nhận dạng protein ngoại lai bằng kĩ thuật MALDI- TOF (MS/ MS) (Matrix-assisted laser desorption ionization- Time of flight) ............................41 Vũ Thị Bích Ngọc iii Cao học K20
  6. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học 2.2.19. Giải trình tự nucleotide...........................................................................41 2.2.20. Xử lý số liệu ...........................................................................................42 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 43 3.1. NHÂN DÒNG GEN MÃ HÓA LUMBROKINASE .....................................43 3.1.1. Thiết kế vector tách dòng pJET1.2 blunt/lk (pJLK).................................43 3.1.2. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA/LK (pPLK)......................................46 3.2. BIỂU HIỆN LUMBROKINASE TRONG P. PASTORIS X33.....................49 3.2.1. Tạo chủng P. pastoris X33 mang gen lk ..................................................49 3.2.2. Sàng lọc các dòng P. pastoris X33/pPLK tái tổ hợp ..............................51 3.2.3. Biểu hiện P. pastoris X33/pPLK tái tổ hợp ............................................52 3.2.4. Tối ƣu môi trƣờng biểu hiện ...................................................................53 3.2.5. Tối ƣu nồng độ methanol .........................................................................55 3.2.6. Tối ƣu thời gian biểu hiện ........................................................................56 3.3. TINH SẠCH rLK ...........................................................................................56 3.4. ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA rLK .............................................................58 3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK ...............58 3.4.2. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK.........................61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 64 PHỤ LỤC ....................................................................................................................i Vũ Thị Bích Ngọc iv Cao học K20
  7. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Hoạt tính thủy phân fibrin và casein của một số protease ........................12 Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .........................................24 Bảng 2.2. Dung dịch sử dụng trong nghiên cứu .......................................................25 Bảng 2.3. Môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu ......................................................27 Bảng 2.4. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ......................................28 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR với thể tích 25 µl ..........................................34 Bảng 2.6. Thành phần gel polyacrylamide 12,5% ....................................................40 Bảng 3.1. Hoạt tính rLK ở các môi trƣờng biểu hiện khác nhau ..............................53 Bảng 3.2. Hiệu suất tinh sạch rLK ............................................................................58 Vũ Thị Bích Ngọc v Cao học K20
  8. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Quá trình hình thành cục máu đông trong mạch máu .................................4 Hình 1.2. Vai trò của antiplasmin (chất ức chế plasmin) ............................................5 Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa plasminogen ...................................................................6 Hình 1.4. Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các loài giun đất ..............14 Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của lumbrokinase .........................................................15 Hình 1.6. Con đƣờng chuyển hóa methanol trong P. pastoris .................................21 Hình 1.8. Hiện tƣợng tích hợp gen ngoại lai vào vị trí 5’AOX1 hoặc aox1::ARG4 của genome nấm men P. pastoris .............................................................................23 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn plasmin (Sigma) .................................................................32 Hình 2.2. Đƣờng chuẩn BSA (Sigma) ......................................................................32 Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm PCR ........................................................................43 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm tách plasmid pJLK, sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pJLK với XbaI và XhoI ............................................................................................44 Hình 3.3. Trình tự vector tách dòng pJLK ................................................................45 Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch vector pPICZαA và gen lk , sản phẩm tách plasmid pPLK , sản phẩm cắt plasmid pPLK với enzyme EcoRI và XbaI ..............47 Hình 3.5. Trình tự vector biểu hiện pPLKvà trình tự amino acid tƣơng ứng ...........48 Hình 3.6. Điện di đồ tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pPLK với enzyme SacI ........49 Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm tách DNA nấm men, sản phẩm PCR bộ gen nấm men P. pastoris X33 ..................................................................................................50 Hình 3.8. Đĩa thử hoạt tính thủy phân fibrin của dịch nổi thu từ các dòng P. pastoris X33/ pPLK tái tổ hợp ................................................................................................52 Hình 3.9. Điện di đồ protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp ....................................................................................................................53 Hình 3.10. Điện di đồ protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch tối ƣu môi trƣờng biểu hiện X33/pPLK ........................................................................................................54 Vũ Thị Bích Ngọc vi Cao học K20
  9. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nồng độ MeOH cảm ứng lên mức độ biểu hiện rLK ...55 Hình 3.12. Tối ƣu thời gian biểu hiện rLK ..............................................................56 Hình 3.13. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch rLK.........................................................57 Hình 3.14. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme rLK .....................................60 Hình 3.15. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến độ bền enzyme rLK .........................................61 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính enzyme rLK ........................................62 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền enzyme rLK ...........................................63 Vũ Thị Bích Ngọc vii Cao học K20
  10. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ 2D- PAGE Two dimention - polyacrylamide gel electrophoresis (Điện di hai chiều trên gel polyacrylamide) APS Ammonium persulfate ARN Acid ribonucleic BLAST Basic local alignment search tool (Công cụ tìm kiếm liên kết định vị cơ bản) BSA Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò) Bp Base pairs (Cặp bazo) cs Cộng sự cDNA Complement DNA DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 2’ Deoxynucleoside 5’ triphosphate ĐC Đối chứng EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide kb Kilo base kDa Kilo dalton M Marker (Thang chuẩn) MALDI- TOF Matrix- assisted laser desorption/ionization- time of flight (ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên chất nền và năng lƣợng laser- thời gian bay ) Vũ Thị Bích Ngọc viii Cao học K20
  11. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học MS Mass spectrometry (Khối phổ) OD Optical density (Mật độ quang học) PBS Phosphate buffered saline (Dung dịch đệm phosphate) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease rLK Recombinant lumbrokinase (lumbrokinase tái tổ hợp) Rpm Revolutions per minute (Vòng quay/ phút) SDS Sodium dodecyl sulfate SDS- PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Taq Thermus aquaticus TBE Tris boric acid EDTA TCA Trichloroacetic acid TE Tris EDTA TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine v/v Volume/ volume (Thể tích/ thể tích) w/v Weight/ volume (Khối lƣợng/ thể tích) YNB Yeast nitrogen base WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) Vũ Thị Bích Ngọc ix Cao học K20
  12. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học MỞ ĐẦU Bệnh tim mạch là một trong nh ng nguyên nh n g y tử vong cao nhất trên toàn thế giới. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), hàng năm có khoảng trên 17 triệu ngƣời chết vì bệnh tim mạch, dự tính lên tới 23,3 triệu ngƣời vào năm 2030. Trên 80% các ca tử vong xảy ra ở các nƣớc có thu nhập thấp và trung bình, điển hình là các nƣớc đang phát triển tại vùng Nam Á và Đông Nam Á, nơi bệnh tim mạch đang gia tăng cùng với tốc độ công nghiệp hóa, đô thị hóa và nh ng thay đổi trong lối sống [64]. Tại Việt Nam, theo thống kê của Viện tim mạch, tỷ lệ ngƣời d n mắc các bệnh tim mạch và đột quỵ khoảng 16% d n số. Có nhiều nguyên nh n dẫn tới rối loạn tim mạch và mạch máu não nhƣ: chứng tràn máu não, tăng huyết áp, xơ cứng động mạch,….[34]. Trong tổng số các bệnh nh n bị tai biến mạch máu não thì có đến 24% tử vong, 50% sống nhƣng bị các di chứng nặng hoặc nhẹ, chỉ có 26% số bệnh nh n sống và làm việc bình thƣờng. Nguyên nh n chủ yếu là do xuất hiện cục máu đông g y tắc mạch và cản trở lƣu thông máu. Do đó, việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh này. Vào khoảng nh ng năm 90, các nhà nghiên cứu tại Nhật Bản đã phát hiện đƣợc 1 enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, bao gồm 6 izozyme đƣợc đặt tên chung là lumbrokinase (LK) [47,50]. Về phƣơng diện l m sàng, LK đƣợc xem là thuốc tan huyết khối đặc hiệu, sử dụng làm thuốc uống vì có thể đƣợc hấp thu từ ruột vào máu và hoạt hóa hệ thống fibrin nội sinh [66]. Một ƣu điểm lớn của lumbrokinase so với các thuốc điều trị bệnh tắc nghẽn mạch thông dụng khác - thƣờng đƣợc sử dụng làm thuốc tiêm (nhƣ tPA (tissue type plasminogen activator), urokinase và streptokinase) [40,42] là không có tác dụng phụ, không g y chảy máu hệ thống, giá thành rẻ. Hiện nay, hầu hết các thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu có mặt tại Việt nam phải nhập khẩu từ nƣớc ngoài và có giá thành cao. Vì vậy, nh ng năm gần đ y, nghiên cứu sản xuất các yếu tố chống tắc nghẽn mạch máu dạng tự nhiên và tái tổ hợp bắt đầu đƣợc quan t m ở trong nƣớc. Trong Vũ Thị Bích Ngọc 1 Cao học K20
  13. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học số đó, LK nhận đƣợc rất nhiều quan t m của các nhà khoa học do nh ng ƣu điểm nổi bật của nó. Tuy nhiên, các nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức độ tinh sạch, đánh giá tính chất l hóa của LK từ giun đất và tách dòng gen mã hóa LK, hiện chƣa có công bố nào về nghiên cứu sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp để làm thuốc. Nhằm góp phần vào việc hạ giá thành sản phẩm và chủ động nguồn nguyên liệu để sản xuất lumbrokinase, đề tài KC04.01/11-15 (2012-2014) “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp làm thuốc phòng chống tắc nghẽn mạch máu’’ do PGS.TS. Quyền Đình Thi làm chủ nhiệm đã đề xuất x y dựng quy trình công nghệ tạo các dòng tế bào sản xuất LK tái tổ hợp. Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của lumbrokinase ở Pichia pastoris”, nhằm tiến tới x y dựng đƣợc quy trình công nghệ tạo các dòng tế bào sản xuất LK tái tổ hợp dùng làm nguyên liệu thuốc cũng nhƣ x y dựng quy trình công nghệ ổn định sản xuất LK tái tổ hợp. Với đề tài trên, luận văn tập trung giải quyết các vấn đề sau: 1. Sử dụng công nghệ gen và công nghệ protein để biểu hiện và tinh sạch đƣợc enzyme lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin. 2. Nghiên cứu một số tính chất của enzyme LK tái tổ hợp tinh sạch đƣợc. Vũ Thị Bích Ngọc 2 Cao học K20
  14. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TẮC NGHẼN MẠCH MÁU 1.1.1. Sơ lƣợc về bệnh tắc nghẽn mạch máu Bệnh tắc nghẽn mạch máu g y ra rối loạn tim mạch và mạch máu não là một trong nh ng nguyên nh n g y tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Liên đoàn tim mạch thế giới đƣa ra thống kê cứ ba ngƣời tử vong trong đó có một ngƣời chết vì bệnh tim mạch. Ở Mỹ, cứ 29 gi y có thêm một ngƣời bị bệnh mạch vành, và cứ 1 phút thì có một ngƣời tử vong. Tử vong do bệnh tim mạch chiếm 42% toàn bộ các ca tử vong, phí tổn do bệnh chiếm 128 tỉ USD/ năm. Hiện nay trên thế giới số ngƣời chết hoặc chịu di chứng nặng nề từ các bệnh tim mạch và tai biến mạch máu não ngày càng gia tăng nhất là ở các nƣớc đang phát triển. Ngoài ra còn có rất nhiều bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu nhƣ: tràn máu não, nhồi máu cơ tim, tắc động mạch phổi. Nguyên nh n chủ yếu của các bệnh trên là do các cục máu đông làm tắc nghẽn mạch máu. Do đó để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim mạch g y ra, các nhà khoa học đã đi theo hƣớng xử l các huyết khối hình thành trong thành mạch. Và việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh tim mạch [7]. 1.1.2. Quá trình đông máu và cơ chế tan huyết khối Đông máu là hiện tƣợng sinh lý xảy ra khi mạch máu bị tổn thƣơng, máu đƣợc chuyển từ thể lỏng sang thể đặc. Quá trình bao gồm một chuỗi các phản ứng xảy ra theo kiểu bậc thang đƣợc chia thành 3 giai đoạn: giai đoạn hình thành phức hợp prothrombinase qua 2 con đƣờng nội sinh và ngoại sinh, giai đoạn hình thành thrombin từ prothrombin và giai đoạn tạo mạng lƣới fibrin từ fibrinogen hình thành cục máu đông [1]. Cơ chế đông máu đƣợc bảo tồn khá chắc trong tiến hóa, riêng với lớp thú, hệ thống đông máu tồn tại 2 thành phần là tế bào (tiểu cầu) và protein (các yếu tố đông máu). Rối loạn của 1 trong 2 thành phần gây rối loạn trong quá trình đông máu, tác động tới việc máu đông nhiều hoặc đông quá ít. Vũ Thị Bích Ngọc 3 Cao học K20
  15. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Khi chấn thƣơng làm tổn hại đến nội mạc mạch máu, tiểu cầu lập tức tạo nút chặn cầm máu tại vết thƣơng, đ y đƣợc coi là quá trình cầm máu ban đầu. Quá trình cầm máu thứ phát diễn ra đồng thời, các yếu tố đông máu trong huyết tƣơng đáp ứng một loạt các chuỗi phản ứng để tạo các sợi huyết có vai trò củng cố nút chặn tiểu cầu. Đ y thực chất là chuyển fibrinogen dạng hòa tan thành fibrin dạng không hòa tan, sau đó, các mạch máu sẽ tạo mạng lƣới chứa tiểu cầu sợi huyết hình thành cục máu, gắn vào thành mạch để ngăn chặn sự mất máu và tạo điều kiện để liền vết thƣơng (Hình 1.1). Giai đoạn 1: Giai đoạn 2: Giai đoạn 3: Tiểu cầu gắn vào Tiểu cầu giải phóng Mạng lƣới fibrin bắt gi màng trong (thành fibrin và bắt đầu bịt hồng cầu, bịt kín hoàn mạch máu) kín thành mạch máu toàn thành mạch máu Khối fibrin Tiểu cầu Tế bào hồng cầu Màng trong Mô liên thành kết mạch máu Hình 1.1. Quá trình hình thành cục máu đông trong mạch máu Bình thƣờng trong cơ thể, quá trình đông máu đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi quá trình chống đông máu để khu trú việc đông máu chỉ ở chỗ bị thƣơng mà không lan rộng ra cả dòng máu. Tham gia quá trình chống đông máu là hàng loạt các chất chống đông khác nhau và hiện tƣợng tiêu fibrin dƣới tác dụng của plasmin- enzyme thủy phân fibrin của cơ thể [2]. Quá trình đông máu liên quan tới 1 hệ thống phản ứng protease bao gồm khoảng 30 loại protein khác nhau, trong khi đó chỉ có 1 enzyme plasmin có thể phá vỡ cục máu đông. Vũ Thị Bích Ngọc 4 Cao học K20
  16. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Cục máu đông có thể tan trở lại nhờ quá trình tan huyết khối nhằm tái lƣu thông tuần hoàn máu, đ y là quá trình ngƣợc với quá trình đông máu. Có hai cơ chế làm tan huyết khối là: cơ chế ph n hủy fibrin thông qua hoạt hóa plasminogen thành plasmin và cơ chế ph n hủy trực tiếp fibrin (Hình 1.3). Đối với cơ chế tan huyết khối thông qua hoạt hóa plasminogen có sự tham gia của các yếu tố gồm: plasminogen, plasmin và các chất hoạt hóa. Plasmin gồm 2 chuỗi polypeptide nối với nhau bằng một cầu nối disulfide, chuỗi nhẹ gắn serine- protease, chuỗi nặng có vị trí gắn fibrin. Yếu tố này đƣợc tạo ra dƣới dạng không hoạt động là plasminogen ở gan. Đ y là một chuỗi polypeptide chứa 791 amino acid. Chất hoạt hóa plasminogen của mô (tPA) chuyển plasminogen thành plasmin, plasmin xúc tác phản ứng cắt fibrin thành các sản phẩm tan đƣợc, đƣợc gọi là sản phẩm thoái giáng của fibrin (FDPs). Các sản phẩm này có tác dụng cạnh tranh với thrombin làm chậm sự chuyển hóa fibrinogen thành fibrin (làm chậm sự tạo thành cục máu). Trong máu ngƣời bình thƣờng, plasmin tồn tại song song với yếu tố ức chế là antiplasmin (Hình 1.2). Nó có nồng độ cao hơn 30 lần so với plasmin trong huyết tƣơng, chống lại tác động của plasmin tới việc ph n hủy protein trong huyết tƣơng [7]. Trong máu có 2 yếu tố hoạt hóa plasminogen tự nhiên là yếu tố hoạt hóa mô (tPA) và urokinase (uPA), các hoạt động tiêu sợi huyết tự nhiên đƣợc kiểm soát bởi các chất ức chế hoạt hóa plasminogen (ví dụ PAI-1: plasminogen activator inhibitor – 1, một chất ức chế tác dụng nhanh của t-PA và u-PA) và các chất ức chế plasmin (ví dụ a1- antiplasmin, a2-macroglobulin) [22]. Hình 1.2. Vai trò của antiplasmin (chất ức chế plasmin) Vũ Thị Bích Ngọc 5 Cao học K20
  17. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Nhờ cơ chế trên mà cơ thể gi đƣợc sự ổn định và c n bằng gi a quá trình đông máu và tan huyết khối. Yếu tố hoạt hóa plasminogen nội mô (tPA) Yếu tố XIa, Yếu tố ức chế hoạt hóa XIIa plasminogen 1&2 kallikrein Sản phẩm thoái giáng của fibrin Thrombin- yếu tố ức chế quá trình thuỷ ph n fibrin Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa plasminogen Cơ chế tan huyết khối thông qua ph n hủy trực tiếp fibrin đƣợc xem là cơ chế an toàn hơn cơ chế hoạt hóa plasminogen vì plasmin có liên quan đến hệ thống cầm máu của cơ thể, nếu lƣợng plasminogen đƣợc hoạt hóa thành plasmin mất c n bằng so với antiplasmin thì sẽ nguy hiểm với nh ng vết thƣơng chảy máu. Ngoài các yếu tố lumbrokinase, t-PA và u-PA không có yếu tố nào có thể ph n hủy trực tiếp fibrin mà đều phải thông qua hoạt hóa plasminogen [46]. Ý nghĩa của quá trình thủy phân fibrin là rất lớn vì fibrin có thể đƣợc thải loại từ dòng máu, tạo các kháng đông và kháng kết dính có hoạt tính cao. 1.1.3. Một số thuốc điều trị tắc nghẽn mạch máu Hiện nay trên thế giới, do nh ng thay đổi trong môi trƣờng và lối sống, số bệnh nhân tử vong do bệnh tim mạch ngày càng tăng cao, đặc biệt là ở nh ng nƣớc đang phát triển. Do vậy, nhu cầu về thuốc ch a bệnh tim mạch là rất lớn. Vũ Thị Bích Ngọc 6 Cao học K20
  18. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Trong hầu hết các thể khác nhau của bệnh nhƣ: bệnh tràn máu não, nhồi máu cơ tim hay tắc nghẽn động mạch phổi đều có nguyên nhân tắc nghẽn mạch do việc hình thành cục máu đông trong mạch máu [51]. Việc điều trị thƣờng tập trung vào kìm hãm sự tạo thành fibrin hoặc g y tác động để chuyển hóa plasminogen thành plasmin. Trƣớc đ y, các thuốc kháng đông có bản chất hóa học nhƣ heparin và coumarin thƣờng đƣợc sử dụng trong việc xử l bệnh nghẽn mạch với tác dụng kìm hãm sự tạo thành cục fibrin [64]. Khi tiêm heparin với liều 0,5-1 mg/kg trọng lƣợng cơ thể có thể kéo dài thời gian đông máu tới trên 30 phút. Heparin có tác dụng ngay tức thời nên nhanh chóng ngăn cản sự phát triển của huyết khối. Tác dụng của heparin kéo dài trong vòng 3- 4 giờ rồi bị phá hủy bởi heparinase có trong máu. Tiêm coumarin vào cơ thể, coumarin sẽ tác dụng cạnh tranh với vitamin K nh ng vị trí hoạt động trong các phản ứng enzyme để dẫn đến sự tạo thành bốn yếu tố II, VII, IX, X. 12 giờ sau khi tiêm coumarin, hoạt tính đông máu giảm xuống còn 50% và sau 24 giờ chỉ còn bằng 20% so với bình thƣờng. Nhƣ vậy, coumarin không có tác dụng chống đông ngay lập tức vì còn phải đợi cho các yếu tố đông máu có sẵn trong huyết tƣơng tiêu thụ hết. Ba ngày sau khi chấm dứt điều trị bằng coumarin thời gian đông máu mới trở lại bình thƣờng [1]. Ngoài ra, các nhà điều trị còn sử dụng aspirin trong việc ngăn ngừa nhồi máu cơ tim. Các thuốc atropine, papaverine và nitroglyceryl giúp ngăn ngừa hoặc giảm co thắt mạch vành. Cho đến nh ng năm 1950 các phƣơng pháp chỉ là để làm giảm nhẹ chứ chƣa phải điều trị [15,55]. Sau khi nhận thấy có thể kìm hãm sự tạo thành fibrin trong cơ thể sống bằng cách chuyển hóa plasminogen dạng không hoạt động thành plasmin hoạt động, các nghiên cứu l m sàng đã chỉ ra cách tiếp cận tốt nhất để điều trị nghẽn mạch là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch 1 enzyme có khả năng chuyển hóa plasminogen thành plasmin. Các enzyme đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc điều trị là streptokinase (từ vi khuẩn α- haemolytic Streptococcus), urokinase (từ nƣớc tiểu của ngƣời) và tPA (chất hoạt hóa plasminogen của mô) tái tổ hợp [40]. Vũ Thị Bích Ngọc 7 Cao học K20
  19. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Nattokinase: là một loại enzyme tự nhiên đƣợc chiết xuất từ môi trƣờng lên men của vi khuẩn Bacillus natto. Nattokinase làm tan fibrin gấp 4 lần plasmin nội sinh trong cơ thể. Nattokinase giúp duy trì và tăng cƣờng khả năng ph n hủy fibrin bình thƣờng của cơ thể nhằm hỗ trợ điều trị và phòng ngừa các bệnh liên quan đến huyết khối nhƣ nhồi máu cơ tim, thiếu máu lên não, đột quỵ [56,59]. Streptokinase: là một protein có khối lƣợng 47 kDa, sinh ra từ vi khuẩn α- haemolytic Streptococcus. Streptokinase xúc tác chuyển hóa plasminogen ngƣời thành plasmin qua sự thủy ph n liên kết L-arginyl-L-valyl [42,50]. t-PA: là yếu tố hoạt hóa mô, có thể sản xuất bằng con đƣờng tái tổ hợp nhƣng giá thành cao. Đầu tiên t-PA gắn với fibrin, phức này sau đó gắn vào plasminogen tạo thành phức hợp hoạt hóa plasminogen để thủy ph n fibrin [27,31]. Urokinase: đƣợc tổng hợp bởi tế bào biểu mô hình ống trong thận ngƣời và thu đƣợc trong nƣớc tiểu, do đó việc sản xuất và khai thác l m sàng bị hạn chế (2300 lít nƣớc tiểu mới thu đƣợc 29 mg urokinase tinh khiết) [63]. Urokinase cũng hoạt động nhƣ một chất hoạt hóa plasminogen, thủy ph n liên kết ester ở L-lysine và L-arginine [50], thƣờng đƣợc dùng để tiêu hủy huyết khối tại chỗ, ngoài ra còn dùng để điều trị tắc nghẽn phổi, huyết khối tĩnh mạch s u.Việc sử dụng các enzyme này đã tỏ ra rất hiệu quả tuy nhiên nó vẫn chƣa thể giải quyết đƣợc hết các vấn đề nảy sinh trong điều trị nghẽn mạch máu nhƣ sốt, tăng chảy máu cao, tạo kháng nguyên, khó xác định liều lƣợng thích hợp (streptokinase), giá thành cao (t-PA tái tổ hợp và urokinase) và không hiệu quả khi uống qua đƣờng miệng [37]. Bên cạnh việc hoạt hóa plasminogen thành plasmin, các nhà khoa học còn nghiên cứu và tìm kiếm nh ng tác nh n có khả năng thủy ph n trực tiếp fibrin và giải quyết đƣợc nhƣợc điểm của các loại thuốc đã sử dụng trƣớc đó. Các enzyme này phổ biến trong tự nhiên từ con ngƣời, động vật, thực vật, vi khuẩn và đã đƣợc sử dụng thành công trong việc xử l tắc mạch, cứu sống nhiều trƣờng hợp tắc mạch phổi và nhồi máu cơ tim. Vũ Thị Bích Ngọc 8 Cao học K20
  20. Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học 1.2. KHÁI QUÁT VỀ ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN 1.2.1. Một số nguồn sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin Xu hƣớng nghiên cứu tìm ra các enzyme thủy ph n fibrin có nguồn gốc từ nhiều đối tƣợng khác nhau ngày càng phổ biến. Năm 1987, Sumi và cs, sau nhiều năm nghiên cứu về enzyme ph n giải cục nghẽn và tìm kiếm một tác nh n tự nhiên có thể hòa tan cục nghẽn liên quan tới nhồi máu cơ tim và tai biến mạch máu não, đã phát hiện ra nattokinase- một enzyme có khả năng thủy ph n fibrin mạnh. Nattokinase đƣợc chiết và tinh sạch từ một loại thực phẩm lên men truyền thống là Natto, đã đƣợc sử dụng ở Nhật Bản trên 2000 năm nhƣ một vị thuốc d n gian cho các bệnh về tim mạch và tê phù. Natto đƣợc sản xuất thông qua một quá trình lên men bằng cách bổ sung B. natto, một vi khuẩn có lợi vào dịch đậu tƣơng đã đƣợc nấu sôi. Khi đó B. natto sẽ sản xuất ra enzyme nattokinase. Sau khi thử nghiệm trên 173 loại thức ăn tự nhiên đƣợc xem là có tác dụng đối với các bệnh liên quan tới hiện tƣợng nghẽn mạch máu, Sumi đã tìm đƣợc điều mà ông mong muốn khi natto đƣợc nhỏ lên cục nghẽn nh n tạo làm từ fibrin trên một đĩa petri và để yên ở 37C. Cục nghẽn xung quanh natto đã tan dần và tan hoàn toàn trong 18 giờ. Ông đã đặt tên cho enzyme mới phát hiện này là “nattokinase”, có nghĩa là “enzyme ở natto” [56]. Đến năm 1991, Mihara và cs đã tách chiết đƣợc enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, một thành phần chính để ch a nh ng cơn sốt và nhận ra rằng enzyme này gồm có 6 isozyme, ông đã đặt tên chung cho 6 enzyme này là lumbrokinase [47]. Có thể nói, việc nghiên cứu phát hiện các enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin cao là một trong nh ng vấn đề hiện nay rất đƣợc quan t m. Sau nh ng phát hiện đầu tiên về enzyme thủy ph n fibrin và triển vọng ứng dụng của nó trong việc điều trị bệnh tim mạch, hàng loạt nghiên cứu trên các đối tƣợng khác nhau đã đƣợc công bố. Các enzyme thủy ph n fibrin không chỉ đƣợc tách chiết từ các loại thuốc, thức ăn truyền thống mà còn từ nhiều loài động vật, thực vật khác. Vũ Thị Bích Ngọc 9 Cao học K20
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.01: Bộ Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Kinh Doanh MBA
165 tài liệu
2070 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2