Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống cây Đinh Lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L.Harms) bằng phương pháp nhân giống vô tính

Chia sẻ: Tri Tâm | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:85

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài đã tiến hành Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro; ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi Đinh lăng lá nhỏ in vitro; ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ cây Đinh lăng lá nhỏ in vitro.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống cây Đinh Lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L.Harms) bằng phương pháp nhân giống vô tính

i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố ở bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào đã công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của Hội đồng khoa học. Thanh Hóa, ngày 05 tháng 10 năm 2015 Người cam đoan Nguyễn Thế Đại
ii LỜI CẢM ƠN Luận văn tốt nghiệp được hoàn thành theo chương trình đào tạo cao học của Đại học Lâm nghiệp. Để có được bản luận văn này, tác giả xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Trường Đại học Lâm nghiệp, Khoa Lâm học, Phòng đào tạo sau Đại học, các Thầy Cô giáo – Các nhà khoa học, đặc biệt là Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp và Tiến sĩ Hà Văn Huân đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ tác giả với những chỉ dẫn khoa học quý giá trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành đề tài “Nghiên cứu nhân giống cây Đinh Lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L.Harms) bằng phương pháp nhân giống vô tính”. Tác giả xin gửi lời cảm tạ sâu sắc đến Ban lãnh đạo của 2 cơ quan: Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp (Trường Đại học Lâm nghiệp) và Trung tâm nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ Lâm nghiệp Thanh Hóa (Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Thanh Hóa), đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tác giả thực tập, tiến hành bố trí các thí nghiệm phục vụ luận văn. Xin gửi lời tri ân đến đồng nghiệp, gia đình đã luôn quan tâm, động viên, cảm thông để tác giả hoàn thành được chương trình đào tạo thạc sĩ cũng như hoàn thành được luận văn. Xin kính chúc các Thầy Cô giáo, Lãnh đạo cùng tập thể cán bộ 2 cơ quan Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp và Trung tâm nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ Lâm nghiệp Thanh Hóa, gia đình, bạn bè luôn dồi dào sức khỏe, hạnh phúc và thành công trong cuộc sống. Xin chân thành cảm ơn! Thanh Hóa, ngày 05 tháng 10 năm 2015 Tác giả Nguyễn Thế Đại
iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan ...................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................. iii Danh mục các từ viết tắt................................................................................... vi Danh mục các bảng ......................................................................................... vii Danh mục các hình ......................................................................................... viii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU................................. 3 1.1. Giới thiệu khái quát về cây Đinh lăng ................................................... 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại .................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái và giá trị sử dụng ............................................. 3 1.1.3. Đặc tính sinh học, sinh thái ............................................................. 5 1.2. Đại cương về nuôi cấy mô tế bào [20] ................................................... 5 1.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................... 5 1.2.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật ................... 6 1.3. Nhân giống vô tính in vitro .................................................................... 8 1.3.1. Khái niệm nhân giống vô tính in vitro ............................................ 8 1.3.2. Yêu cầu thực tiễn ............................................................................ 8 1.3.3. Một số phương thức nhân giống vô tính in vitro ............................ 9 1.3.4. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro .............. 10 1.3.5. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống .......................... 11 1.4. Nhân giống cây trồng bằng phương pháp giâm hom ........................... 16 1.4.1. Cơ sở tế bào của hình thành rễ bất định ........................................ 17 1.4.2. Cơ sở sinh lý của sự hình thành rễ bất định .................................. 17
iv 1.5. Một số kết quả của việc nghiên cứu nhân giống vô tính ..................... 21 1.5.1. Trên thế giới .................................................................................. 21 1.5.2. Ở Việt Nam ................................................................................... 23 1.6. Tình hình nghiên cứu nhân giống vô tính cây Đinh lăng lá nhỏ ......... 24 Chương 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................. 26 2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 26 2.2.1. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ......................... 26 2.2.2. Nhân giống bằng phương pháp giâm hom .................................... 26 2.3. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 26 2.4. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 27 2.5. Thiết bị và hóa chất .............................................................................. 27 2.6. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 27 2.6.1. Phương pháp luận.......................................................................... 27 2.6.2. Nguyên tắc bố trí thí nghiệm......................................................... 28 2.6.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể đối với nội dung nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ....................................................... 28 2.6.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể của nội dung nhân giống bằng phương pháp giâm hom .................................................................. 33 2.7. Phương pháp thu thập số liệu và xử lý số liệu ..................................... 36 2.7.1. Phương pháp kế thừa tài liệu......................................................... 36 2.7.2. Thu thập số liệu ............................................................................. 37 2.8. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................... 38 2.8.1. Số liệu nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro tính các chỉ số như sau:................................................................... 38 2.8.2. Số liệu nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp giâm hom tính các chỉ số như sau: ........................................................................... 39
v Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 40 3.1. Kết quả nghiên cứu nhân giống Đinh lăng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ......................................................................................................... 40 3.1.1. Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro ................................................................................................................. 40 3.1.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi Đinh lăng lá nhỏ in vitro .............................................. 44 3.1.3. Tạo rễ cho chồi Đinh lăng in vitro ................................................ 49 3.1.4. Quy trình nhân giống In vitro cây Đinh lăng ................................ 55 3.2. Kết quả nghiên cứu nhân giống Đinh lăng bằng phương pháp giâm hom .............................................................................................................. 55 3.2.1. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ ra rễ và sự phát triển của hom giâm ......................................................................................................... 55 3.2.2. Ảnh hưởng của chiều dài hom giâm đến tỷ lệ ra rễ và sự phát triển của hom giâm .......................................................................................... 57 3.2.3. Ảnh hưởng của vị trí lấy hom đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của hom giâm ......................................................................................................... 60 3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (IBA) đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của hom giâm ............................................................. 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ BIỂU
vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ IBA Indoly Butyric Acid BAP Benzyl Amino Purin NAA Napthalene acetic acid ĐHST Điều hòa sinh trưởng CTTN Công thứ thí nghiệm MS Môi trường cơ bản MS (Murashige – Skoog) ĐC Đối chứng
vii DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1 Các công thức thí nghiệm khử trùng mẫu Đinh lăng 29 2.2 Các công thức thí nghiệm nhân nhanh chồi Đinh lăng 30 2.3 Các công thức môi trường tạo rễ cây Đinh lăng in vitro 32 Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ ra 2.4 34 rễ và phát triển của hom giâm Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của chiều dài hom 2.5 35 giâm đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của hom giâm Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của loại hom giâm đến 2.6 35 tỷ lệ ra rễ và phát triển của hom giâm Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ chất điều 2.7 hòa sinh trưởng (IBA) đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của 36 hom giâm Ảnh hưởng của biện pháp khử trùng đến hiệu quả tạo 3.1 41 mẫu sạch in vitro chồi Đinh lăng lá nhỏ 3.2 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân nhanh chồi 45 Ảnh hưởng của BAP và IBA đến hiệu quả nhân nhanh 3.3 46 chồi Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến hiệu quả nhân 3.4 47 nhanh chồi Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng 3.5 50 đến khả năng ra rễ của chồi Đinh lăng Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của 3.6 55 hom giâm Ảnh hưởng của chiều dài hom đến tỷ lệ ra rễ và phát 3.7 57 triển của hom giâm Ảnh hưởng của vị trí lấy hom đến tỷ lệ ra rễ và phát 3.8 60 triển của hom giâm Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 3.9 61 (IBA) đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của hom giâm
viii DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 3.1 Cây Đinh lăng lá nhỏ 40 Ảnh hưởng của biện pháp khử trùng đến hiệu quả 3.2 41 tạo mẫu sạch in vitro chồi Đinh lăng lá nhỏ 3.3 Chồi Đinh lăng sau 2 tuần nuôi cấy 43 Nhân nhanh chồi Đinh lăng trên môi trường bổ sung 1 3.4a 48 mg/lBAP Nhân nhanh chồi Đinh lăng trên môi trường có bổ sung 3.4b 49 1,0 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin Cây Đinh lăng in vitro hoàn chỉnh trong bình thí 3.5 53 nghiệm 3.6 Cây Đinh lăng in vitro đưa ra khỏi bình thí nghiệm 53 3.7a Cây Đinh lăng in vitro trồng vào bầu đất 54 3.7b Cây Đinh lăng in vitro phát triển sau 40 ngày 54 3.8a Sử dụng hom thân để giâm hom 59 Ảnh hưởng của chiều dài đến quá tỷ lệ ra rễ của 3.8b 59 hom giâm 3.9a Hom thân phát triển sau 25 ngày giâm 60 3.9b Hom cành phát triển sau 25 ngày giâm 60 Rễ không xuất phát từ mặt cắt hom khi sử dụng 3.10 (a,b,c) 62 IBA nồng độ 1000ppm Rễ xuất phát từ mặt cắt của hom khi sử dụng IBA 3.11 (a,b) 63 với nồng độ 500 - 750ppm 3.12 (a,b) Cây Đinh lăng hom phát triển sau 25 ngày 63
1 MỞ ĐẦU Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Tổng số loài thực vật đã ghi nhận cho Việt Nam khoảng 10.500 loài, ước đoán hệ thực vật Việt Nam có khoảng 12.000 loài. Trong số này, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30%. Kết quả điều tra nguồn tài nguyên dược liệu ở Việt Nam giai đoạn 2001 – 2005 của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt Nam có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc. Trong đó nhóm thực vật bậc cao có mạch vó 3.970 loài [14]. Cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L.Harms) thuộc họ ngũ gia bì (Araliaceae Juss), là cây thuốc quý được sử dụng nhiều để làm thuốc tại Việt Nam. Đinh lăng lá nhỏ là dạng cây bụi cao 1 – 2m, vỏ thân màu trắng nhạt, nhẵn, phân cành thấp. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy trong cây Đinh lăng, nhất ở rễ, củ có chứa nhiều chất có tác dụng bồi bổ sức khỏe và chữa bệnh, như: Alcaloid, glucosid, saponin, flavonoid, tanin, vitamin B1, các acid amin trong đó có lysin, systein và methionin. Trong đó đáng chu ý là cây Đinh lăng có chứa các hợp chất Saponin tương tự như nhân sâm. Trong một số trường hợp, rễ, củ Đinh lăng được thay thế cho nhân sâm như một nguyên liệu dễ tìm ở Việt Nam (Đỗ Tất Lợi, 2006); (Nguyễn Trần Châu và cộng sự 2007) [3], [15]. Theo phân loại của Phạm Hoàng Hộ (2003), Đinh lăng có nhiều loại thuộc chi Polyscias, như Đinh lăng lá trổ, Đinh lăng lá ráng, Đinh lăng lá tròn và Đinh lăng lá nhỏ,… Trong đó, loài Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L.Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãi làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu đời. Ngày nay, tác dụng dược tính của cây Đinh lăng đã được chứng minh, vì thế nhu cầu sử dụng cây Đinh lăng làm thuốc ngày càng tăng. Hàng năm, Tổng công ty Dược Traphaco cần 400 tấn rễ Đinh lăng lá nhỏ để làm thuốc, nhưng hiện nay
2 nguồn cung cấp không ổ định do chưa chủ động trong sản xuất Đinh lăng [6]. Nguyên nhân chính là quan niệm người dân cho rằng Đinh lăng là loài dễ trồng, dễ nhân giống nên không để tâm đến các biện pháp nghiên cứu kỹ thuật trồng. Thực tế cho thấy rằng khi gặp sản xuất đại trà quy mô lớn, nhân giống, trồng và chăm sóc cây Đinh lăng đã gặp một số vấn đề như: Số lượng giống cung cấp bị hạn chế; Nguồn gốc giống không được kiểm định nên đem trồng cả những giống không đảm bảo chất lượng và năng suất. Trong nhân giống thì tỷ lệ cây đủ tiêu chuẩn xuất vườn thấp; Hệ số nhân giống không cao,… Xuất phát từ cơ sở thực tiễn về nhu cầu nguồn giống cây Đinh lăng, cơ sở khoa học về nhân giống vô tính, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống cây Đinh Lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L.Harms) bằng phương pháp nhân giống vô tính” góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất giống, tăng năng suất chất lượng cây trồng, nâng cao đời sống người dân.
3 Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Giới thiệu khái quát về cây Đinh lăng 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 1.1.1.1. Phân loại Tên Việt Nam: Đinh lăng lá nhỏ, cây gỏi cá, Nam Dương sâm. Tên khoa học: Polycias fruticosa L.Harms Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan) Lớp: Magnoliopsida (Thực vật 2 lá mầm) Bộ: Apiales (Hoa tán) Họ: AraliaceaeJuss (Ngũ gia bì) [10] 1.1.1.2. Nguồn gốc Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ Thái Bình Dương, là cây có biên độ sinh thái rộng nên phân bố của nó cũng rất rộng. Ở khu vực Đông Nam Á cây phân bố ở Malaysia, Indonesia, Nam Trung Quốc, Lào, Việt Nam. Tại Việt Nam, cây Đinh lăng được trồng làm cây cảnh, làm thuốc hoặc lấy lá với quy mô nhỏ theo hộ gia đình. Chồi non, lá của cây Đinh lăng được dùng ăn sống hoặc nấu như một loại rau và được dùng rộng rãi [10], [14]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái và giá trị sử dụng 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái Cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L.Harms) thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae Juss) xanh quanh năm, là cây chịu hạn không ưa đọng nước, phát triển tốt trên các vùng đất cát pha, tơi xốp, có độ ẩm trung bình. Là loại cây nhỏ, thân tròn sần sùi, không có gai, có vết sẹo do lá rụng để lại, thường cao 1 – 2 mét. Lá kép lông chim 2 – 3 lần mọc so le, không có lá kèm rõ, có mùi thơm đặc trưng. Lá chét chia thùy, có răng cưa nhọn không
4 đều, có cuống dài. Lá có màu xanh, bóng mặt dưới nhiều hơn, gốc lá và phiến lá thuôn nhọn dài 3 – 5cm, rộng 0,5 – 1,5 cm. Gân lá hình lông chim, gân chính nổi rõ, 3 – 4 cặp gân phụ. Cuống lá dài, tròn, xanh sậm, có những đốm xanh nhạt trên cuống, đáy cuống phình to thành bẹ lá. Cụm hoa tán tụ thành chìm ở ngọn cành. Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính, mẫu 5. Cuống hoa hình trụ, màu xanh, dài 3 – 4mm. Lá bắc tập hợp ở gốc cuống hoa theo hình tam giác nhọn. Quả dẹt dài 3 – 4mm, dày 1mm và có vòi tồn tại [2], [10]. 1.1.2.2. Giá trị sử dụng Bộ rễ Đinh lăng có màu vàng, có vị ngọt. Rễ cây Đinh lăng thành thục có chứa nhiều chất có tác dụng bồi bổ sức khỏe và chữa bệnh như: Alcaloid, glucosid, saponin, flavonoid, tanin, vitamin B1, các acid amin trong đó có lysin, systein và methionin. Trong đó đáng chu ý là cây Đinh lăng có chứa các hợp chất Saponin tương tự như nhân sâm. [15] Đi sâu vào những cây có cùng họ với Nhân sâm (Panax ginseng) làm thuốc bổ, qua rất nhiều năm nghiên cứu và thử nghiệm. Viện Y học Quân đội Việt Nam đã tìm ra cây Đinh lăng với những tính chất của Nhân sâm. Qua nghiên cứu và thực nghiệm của Viện Y học Quân đội, kết quả nghiên cứu đã xác nhận rễ cây Đinh lăng có tác dụng làm tăng cường sức dẻo dai và nâng cao sức đề kháng của cơ thể, chống được hiện tượng mệt mỏi, làm cho cơ thể ăn ngon, ngủ yên, tăng khả năn lao động và làm việc bằng trí óc, lên cân và chống độc. Đinh lăng được dùng chủ yếu là phần lá và rễ. Rễ đinh lăng được thu hái vào mùa đông, ở những cây đã có từ 4-5 tuổi trở lên, cỡ độ tuổi này, rễ mới có nhiều hoạt chất. Tính chất dược liệu: có vị đắng, ngọt, tính mát, mùi thơm, không độc. Trong y học cổ truyền Việt Nam, rễ Đinh lăng có vị ngọt, hơi đắng, tính mát có tác dụng thông kinh mạch, bồi bổ khí huyết, lá có vị đắng, tính
5 mát, có tác dụng giải độc thức ăn, chống dị ứng, chữa ho ra máu, kiết lỵ. Danh y Hải Thượng Lãn Ông Lê Hữu Trác đã dùng rễ Đinh lăng sao vàng, khử thổ, sắc cho phụ nữ uống sau khi sinh đẻ để chống đau dạ con và làm tăng tiết sữa cho con bú. Lá đinh lăng được dùng theo kinh nghiệm dân gian, chống bệnh co giật cho trẻ em, lấy lá non và lá già phơi khô đem lót vào gối hoặc trải giường cho trẻ nằm. Thân cành Đinh lăng sắc uống để chữa được bệnh đau lưng, mỏi gối, tê thấp, dùng phối hợp với rễ cây xấu hổ (ngủ ngày), cúc tần, cam thảo dây. Đinh lăng còn được dùng để chữa ban sởi, ho ra máu, kiết lỵ. Phối hợp với sữa ong chúa làm thuốc bổ là rất tốt [15]. Theo nghiên cứu của Học viện Quân sự Việt Nam, cao Đinh lăng có tác dụng: Tăng biên độ điện thế não, tăng tỉ lệ các sóng alpha, beta và giảm tỷ lệ sóng delta (những biến đổi này diễn ra ở vỏ não mạnh hơn so với ở thể lưới); Tăng khả năng tiếp nhận của các tế bào thần kinh vỏ não với các kích thích ánh sáng; tăng nhẹ quá trình hưng phấn khi thực hiện phản xạ dương tính và phản xạ phân liệt. 1.1.3. Đặc tính sinh học, sinh thái Là cây lâu năm, có thể sống đến vài chục năm, ưa ẩm, ưa sáng, chịu hạn tương đối, chịu bóng nhưng cây sẽ phát triển yếu, không chịu được ngập úng, cây sẽ bị héo úa và chết đi. Phân bố rộng trên khắp cả nước, ở tất cả các vùng sinh thái, có thể phát triển trên nhiều loại đất nhưng tốt nhất là đất pha cát. Cây phát triển mạnh khi nhiệt độ dưới 280C, mùa Thu và mùa Xuân cây phát triển nhanh nhất [10]. 1.2. Đại cương về nuôi cấy mô tế bào [20] 1.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều
6 lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất. Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng quý hiếm. Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương pháp nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất. Năm 1939, nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi (White, 1939) và rễ (Nobercourt, 1939). Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe, 1980, 1988). Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có 3 nhân tố ảnh hưởng trực tiếp: Môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu được sử dụng trong nuôi cấy. Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương hỗ của các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá trình hình thành chồi và rễ (Brown &Thorpe, 1986). 1.2.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật Tính toàn năng cùng với sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào là cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào thực vật. 1.2.2.1. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào thực vật Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh.
7 Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. 1.2.2.2. Sự trẻ hóa Vào thế kỷ XVII, XVIII người ta cho rằng các dòng vô tính bị thoái hóa đi theo tuổi và chỉ có thể trẻ hóa thông qua sinh sản bằng hạt. Song thực tế cho thấy đời sống của một dòng vô tính là vô hạn nếu như nó sống trong môi trường thích hợp và liên tục đổi mới bằng sinh sản sinh dưỡng. Khả năng tái sinh là một dấu hiệu quan trọng xác định sự chuyển giai đoạn từ non trẻ sang trưởng thành. Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là rất khác nhau. Nuôi cấy các bộ phận non trẻ sẽ ra chồi, ra rễ tốt hơn các bộ phận trưởng thành. Vì vậy, việc trẻ hóa là một biện pháp quan trọng nhất trong nhân giống sinh dưỡng. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy thực vật in vitro thực chất là kết quả của phân hóa và phản phân hóa tế bào. 1.2.2.3. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Quá trình phân hóa tế bào có thể bảng thị như sau: Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hóa chức năng Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết và có điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là sự phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào.
8 Về bản chất thì quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào là do điều hòa hoạt động của gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng rẽ tế bào, gặp điều kiện thuận lợi thì các gen được hoạt hóa, quá trình phân hóa sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn. 1.3. Nhân giống vô tính in vitro 1.3.1. Khái niệm nhân giống vô tính in vitro - Nhân giống in vitro hay vi nhân giống (micropropagation) là hệ thống sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng tồn tại hoặc mô phân sinh trong cây. - Nói cách khác, nhân giống in vitro hay vi nhân giống (micropropagation) là sự tăng bội hoặc tái sinh sản vật liệu thực vật được thu nhỏ trong ống nghiệm dưới điều kiện môi trường vô trùng và được điều khiển. 1.3.2. Yêu cầu thực tiễn Hiện nay, các ngành sản xuất nông lâm nghiệp đã và đang được quan tâm trên nhiều quốc gia. Mong muốn tạo ra nhiều sản phẩm có năng suất, chất lượng cao, sạch bệnh... phục vụ nhu cầu của con người. Đáp ứng những nhu cầu trên thì vấn đề đẩy mạnh công tác nhân giống in vitro càng được quan tâm với những mục tiêu sau: - Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác nhân giống.
9 - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực, cây cảnh, cây dược liệu, các loài hoa... - Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus. - Bảo quản các tập đoàn giống, nhân giống vô tính các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen. 1.3.3. Một số phương thức nhân giống vô tính in vitro Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống cổ điển như: chiết cành, ghép, giâm hom... Nhân giống in vitro hay vi nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và mang lại hiệu quả kinh tế lớn. Có 3 phương thức để tạo cây in vitro: 1.3.3.1. Hoạt hóa chồi nách Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì sự hoạt hóa chồi nách diễn ra theo 2 cách: - Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi cấy loài cây hai lá mầm như: khoai tây, hoa cúc, cây thuốc lá...) - Tạo cụm chồi từ đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra với cây một lá mầm như: cây lúa, cây mía...) 1.3.3.2. Phương pháp tạo chồi bất định Chồi bất định là chồi được hình thành từ các cơ quan, các bộ phận khác của cây, không phải là phôi. Như: chồi hình thành từ mô sẹo (callus). Tạo chồi bất định sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá, giẻ hành. Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái sinh tế bào để bắt tế bào sôma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo.
10 1.3.3.3. Phương pháp tạo phôi vô tính Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình thành từ các tế bào sôma gọi là phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc có thể được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo. Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái sinh tế bào để tách các tế bào sôma, hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo. Sự hình thành phôi trải qua 2 bước chính sau: - Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Trong quá trình này cần môi trường giàu Auxin vì Auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các tế bào phôi, đồng thời Auxin giúp kích thích quá trình phát triển số lượng tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein, ARN thông tin. - Sự phát triển của phôi mới hình thành. Môi trường nuôi cấy trong giai đoạn này phải nghèo hoặc không có Auxin, với nồng độ Auxin cao kích thích quá trình hình thành phôi nhưng ức chế quá trình phân hóa và phát triển tiếp theo của phôi. Như vậy, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng hợp lý là điều kiện quyết định cho các phản hồi thích hợp, nếu nồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng và nồng độ cao có thể gây ức chế hoặc gây độc. 1.3.4. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước sau: Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virut và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện
11 thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro Bước 2: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng. Bước 5: Đưa cây ra vườn ươm Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu sau: - Cây trong ống nghiệm phải đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều dài rễ, độ cao của thân) - Các giá thể thích hợp cho cây in vitro: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. - Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp. 1.3.5. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống 1.3.5.1. Thành phần môi trường dinh dưỡng Vào thời kì Haberlandt tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy tế bào phân lập những hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng của mô và tế bào thực vật
12 còn rất hạn chế, đặc biệt là vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng hầu như chưa được khám phá. Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công. Đến nay có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã được xây dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trường đều gồm những nhóm chất chính sau: Các loại muối khoáng, nguồn các bon, vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng, các nhóm chất bổ sung, chất độn. - Các loại muối khoáng: Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô và tế bào thực vật được chia thành hai nhóm: Đa lượng và vi lượng + Các nguyên tố khoáng đa lượng: Bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm (tức là trên 30mg/l). Những nguyên tố đó là N, S, P, K, Mg, Ca. Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong một vài môi trường nhưng vẫn chưa rõ tác dụng của chúng. + Các nguyên tố vi lượng: Là các nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30ppm. Đó là Fe, B, Mn, Mo, Cu, Zn, Ni, Co. - Nguồn các bon: Mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức chủ yếu là dị dưỡng, mặc dù trong nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện tự nhiên ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn các bon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn các bon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là saccarose. Nồng độ thích hợp phổ biến là 2 - 3%, song cũng phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi, có khi xuống tới 0,2% (chọn dòng) và tăng lên 12% (nhằm cảm ứng stress nước). - Vitamin: Mặc dù các loại mô và tế bào nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng, do đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B. - Các chất điều hòa sinh trưởng: Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy