Luận văn Thạc sĩ Khoa học Lâm nghiệp: Nhân giống hai dòng bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake) PN46 và PN47 bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: Tri Lễ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:111

Thêm vào BST

Báo xấu

13
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm xác định môi trường (môi trường hoá học và môi trường vật lý) phù hợp để nhân giống hai dòng bạch đàn urô PN46 và PN47 bằng phương pháp nuôi cấy in vitro; tạo ra cây con hoàn chỉnh bằng phương pháp nuôi cấy in vitro cho 2 dòng PN46 và PN47; huấn luyện cây trong ống nghiệm và cấy cây con ra vườn ươm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học Lâm nghiệp: Nhân giống hai dòng bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake) PN46 và PN47 bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Bé gi¸o dôc & ®µo t¹o bé n«ng nghiÖp vµ ptnt Trêng ®¹i häc l©m nghgiÖp ...............o0o............... ph¹m ®øc huy nh©n gièng hai dßng b¹ch ®µn ur« (Eucalyptus urophylla Bleck) PN46 vµ PN47 b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro. Chuyªn ngµnh: l©m häc M· sè : 60 62 60 LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc l©m nghiÖp ngêi híng dÉn khoa häc PGS-TS. D¬ng méng hïng Hµ t©y 2006
LuËn v¨n ®îc hoµn thµnh t¹i: Khoa ®µo t¹o Sau ®¹i häc Trêng ®¹i häc L©m nghiÖp Ngêi híng dÉn khoa häc: PGS.TS. D¬ng Méng Hïng Ph¶n biÖn 1: ............................................................. Ph¶n biÖn 2: ............................................................. LuËn v¨n sÏ ®îc b¶o vÖ t¹i Héi ®ång chÊm luËn v¨n cÊp nhµ níc Häp t¹i: Trêng §¹i häc L©m nghiÖp ViÖt Nam Xu©n Mai, Ch¬ng Mü, Hµ T©y Vµo håi: ..........ngµy........th¸ng .......n¨m 2006 Cã thÓ t×m luËn v¨n t¹i: Trung t©m th«ng tin t liÖu vµ th viÖn - Trêng §HLN Th viÖn Khoa ®µo t¹o Sau ®¹i häc
Hµ t©y 2006
1 Më ®Çu Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, kü thuËt nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo thùc vËt ®· kh«ng ngõng ph¸t triÓn vµ thu ®îc nh÷ng thµnh tùu ®¸ng kÓ. Kü thuËt nµy ra ®êi ®· më ra mét híng míi trong nghiªn cøu thùc vËt vµ nhanh chãng cã vÞ trÝ quan träng trong lÜnh vùc c«ng nghÖ sinh häc vÒ s¶n xuÊt vµ c¶i thiÖn c¸c gièng c©y trång. u ®iÓm næi bËt cña ph¬ng ph¸p nµy lµ cã thÓ nh©n nhanh ®ång nhÊt di truyÒn mét sè lîng lín c¸ thÓ trong thêi gian ng¾n, c©y con ®îc trÎ ho¸ gÇn nh c©y tõ h¹t [15]. Mét sè loµi thuéc chi B¹ch ®µn (Eucalyptus) ®· ®îc nhËp néi vµo ViÖt Nam tõ rÊt sím vµ trång réng r·i trªn hÇu hÕt c¸c vïng sinh th¸i nh»m ®¸p øng c¸c nhu cÇu nguyªn liÖu giÊy, bét giÊy, gç trô má, gç x©y dùng, gç xÎ vµ cñi. Trong héi th¶o quèc gia vÒ loµi c©y u tiªn cho trång rõng ë ViÖt Nam n¨m 2001, c¸c loµi b¹ch ®µn lµ ®èi tîng u tiªn sè 1 trong “Danh môc c¸c loµi c©y u tiªn cho trång rõng trong toµn quèc” [25]. HiÖn nay, nguån c©y gièng cung cÊp cho trång rõng b¹ch ®µn ë níc ta chñ yÕu lµ c©y v« tÝnh (s¶n xuÊt b»ng ph¬ng ph¸p gi©m hom vµ nh©n gièng in vitro). ë ViÖt Nam, nh©n gièng in vitro c¸c dßng b¹ch ®µn Ur« ë níc ta tuy míi ®îc s¶n xuÊt c«ng nghiÖp tõ nh÷ng n¨m 1994 nhng ®Õn nay ®· thu ®îc nh÷ng thµnh c«ng ®¸ng kÓ. Mçi n¨m, c«ng nghÖ nµy cung cÊp kho¶ng 10 triÖu c©y gièng b¹ch ®µn c¸c lo¹i phôc vô c¸c ch¬ng tr×nh trång rõng trªn toµn quèc [25]. Rõng trång c¸c dßng v« tÝnh b¹ch ®µn tõ c©y mÑ u tréi ®îc chän läc ®· t¹o ra bíc ®ét ph¸ míi vÒ n¨ng suÊt vµ chÊt lîng rõng trång trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y. Tuy nhiªn, nhîc ®iÓm lín nhÊt khi g©y trång c©y nhËp néi lµ chóng cã nguy c¬ tæn thÊt nÆng nÒ h¬n c©y b¶n ®Þa khi x¶y ra dÞch s©u bÖnh t¹i m«i trêng g©y trång míi v× søc ®Ò kh¸ng cña chóng kÐm h¬n c©y b¶n ®Þa. Thªm vµo ®ã, mét thùc tÕ mµ nhiÒu ngêi ®Òu thèng nhÊt r»ng, ®iÓm yÕu nhÊt, râ nhÊt, nghiªm träng nhÊt cña trång rõng tõ c©y ®îc nh©n gièng b»ng ph¬ng ph¸p in vitro lµ lµm gi¶m ®¸ng kÓ biÕn dÞ di truyÒn vµ gi¶m sù ®a
2 d¹ng di truyÒn. HiÖu qu¶ cña nã lµm ng¨n chÆn cña qu¸ tr×nh chän läc tiÕp, kh«ng ®îc t¨ng thu tiÕp theo, t¨ng kh¶ n¨ng l©y lan, tµn ph¸ nhanh vµ réng cña s©u bÖnh h¹i [16]. §Ó h¹n chÕ sù l©y lan cña dÞch bÖnh cã thÓ x¶y ra th× mét trong nh÷ng biÖn ph¸p kü thuËt lµ trång nhiÒu loµi, nhiÒu dßng kh¸c nhau trªn nh÷ng diÖn tÝch lín. ë níc ta hiÖn nay cã kho¶ng 12 dßng b¹ch ®µn ®· ®îc Bé NN&PTNT c«ng nhËn vµ cho phÐp trång rõng s¶n xuÊt, trong khi ®ã míi cã 3-4 dßng ®îc nh©n gièng b»ng ph¬ng ph¸p in vitro. V× vËy, nh÷ng dßng ®· ®îc Bé NN&PTNT c«ng nhËn cÇn ®îc nghiªn cøu nh©n gièng b»ng ph¬ng ph¸p in vitro ®Ó cung cÊp cho trång rõng kh¶o nghiÖm vµ trång rõng s¶n xuÊt. N¨m 2003 Bé NN&PTNT ®· c«ng nhËn hai dßng b¹ch ®µn ur« PN46 vµ PN47 (tªn ®Çy ®ñ lµ “Dßng b¹ch ®µn Phï Ninh sè 46” vµ “Dßng b¹ch ®µn Phï Ninh sè 47”) lµ gièng tiÕn bé kü thuËt vµ khuyÕn khÝch trång rõng trªn nh÷ng vïng cã ®iÒu kiÖn sinh th¸i t¬ng tù vïng Trung t©m B¾c Bé (Phô lôc 1.1). HiÖn nay, nhu cÇu c©y gièng cña hai dßng nµy nh»m phôc vô trång rõng kh¶o nghiÖm vµ s¶n xuÊt kh¸ lín. Thªm vµo ®ã, viÖc nh©n gièng b»ng kü thuËt nu«i in vitro cña 2 dßng nµy cha ®îc nghiªn cøu. Thêi gian võa qua, ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy ®· thö nghiÖm ¸p dông quy tr×nh nh©n gièng invitro hai dßng PN14 vµ U6 vµo nh©n gièng hai dßng nµy nhng kh«ng thµnh c«ng. §iÒu nµy cã thÓ do nh÷ng ®Æc ®iÓm sinh lý, sinh ho¸ cña hai dßng nµy cã nh÷ng ®iÓm kh¸c so víi c¸c dßng ®· vµ ®ang ®îc nh©n gièng b»ng quy tr×nh trªn. Nªn viÖc ¸p nghiªn cøu nh©n gièng 2 dßng b¹ch ®µn nµy b»ng kü thuËt nu«i cÊy in vitro ®Ó tiÕn tíi hoµn thiÖn c«ng nghÖ phôc vô cho s¶n xuÊt lµ cÇn thiÕt. Tõ nh÷ng ®Æc ®iÓm, nhu cÇu thùc tiÔn vµ nhu cÇu khoa häc nªu trªn, chóng t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi “Nh©n gièng hai dßng b¹ch ®µn ur« (Eucalyptus urophylla S.T. Blake) PN46 vµ PN47 b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro”.
3 Ch¬ng 1 tæng quan vÊn ®Ò nghiªn cøu 1.1. Kh¸i niÖm vÒ nh©n gièng in vitro. Nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo thùc vËt cßn gäi lµ nu«i cÊy thùc vËt in vitro (trong èng nghiÖm) ®Ó ph©n biÖt víi c¸c qu¸ tr×nh nu«i cÊy trong ®iÒu kiÖn tù nhiªn gäi lµ nu«i cÊy in vivo (ngoµi èng nghiÖm). ThuËt ng÷ “nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo thùc vËt” hay “nu«i cÊy in vitro’’ (Plant Tissue Culture) lµ ph¹m trï kh¸i niÖm chØ tÊt c¶ c¸c lo¹i nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo ë ®iÒu kiÖn v« trïng. Bao gåm [16]:  Nu«i cÊy c©y: nu«i cÊy thùc vËt.  Nu«i cÊy c¸c bé phËn ®· ®îc t¸ch khái thùc vËt: nu«i cÊy c¬ quan.  Nu«i cÊy c¸c ph«i thµnh thôc hay cha thµnh ®· ®îc t¸ch khái thùc vËt: nu«i cÊy ph«i.  Nu«i cÊy m« b¾t nguån tõ c¬ quan thùc vËt: nu«i cÊy m« hay nu«i cÊy m« sÑo.  Nu«i cÊy tÕ bµo ®¬n lÎ hay c¸c côm tÕ bµo rÊt nhá trong m«i trêng láng.  Nu«i cÊy tÕ bµo thùc vËt sau khi ®· t¸ch bá phÇn vá, cßn gäi lµ nu«i cÊy tÕ bµo trÇn (protoplast). 1.2. C¸c giai ®o¹n nh©n gièng in vitro. Nh©n gièng in vitro gåm nhiÒu giai ®o¹n kÕ tiÕp nhau, qu¸ tr×nh nµy cã thÓ chia thµnh c¸c giai ®o¹n sau ®©y: 1.2.1. Giai ®o¹n chuÈn bÞ. Giai ®o¹n chuÈn bÞ lµ giai ®o¹n quan träng, quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng cña mçi thÝ nghiÖm nh©n gièng in vitro. Giai ®o¹n nµy gåm nhiÒu néi dung kh¸c nhau nh pha m«i trêng nu«i cÊy, chuÈn bÞ c¸c ho¸ chÊt khö trïng mÉu,
4 chuÈn bÞ vµ khö trïng thiÕt bÞ. ë giai ®o¹n nµy, chuÈn bÞ m«i trêng dinh dìng cã vai trß v« cïng quan träng v× m« nu«i cÊy cã sinh trëng, ph¸t triÓn ®îc hay kh«ng lµ phô thuéc vµo thµnh phÇn, nång ®é c¸c chÊt cã trong m«i trêng nu«i vµ kh¶ n¨ng hÊp thô chÊt dinh dìng cã trong m«i trêng cña m« nu«i cÊy. Nhu cÇu dinh dìng cña m« nu«i cÊy rÊt kh¸c nhau tuú thuéc vµo loµi, gièng, thËm chÝ c¸c m« lÊy tõ c¸c c¬ quan kh¸c nhau trªn cïng mét c¸ thÓ còng cã c¸c nhu cÇu dinh dìng kh¸c nhau [23]. Cho ®Õn nay, ngêi ta ®· t×m ra nhiÒu lo¹i m«i trêng dinh dìng thÝch hîp cho nhiÒu loµi kh¸c nhau nh: m«i trêng White (1934), m«i trßng MS (Murashige and Skoog, 1962), m«i trêng Litvay (1985),…vv, trong ®ã m«i trêng MS lµ m«i trêng nu«i cÊy c¬ b¶n thÝch hîp cho nhiÒu loµi thùc vËt nãi chung. C¸c lo¹i m«i trêng kh¸c nhau cã thµnh phÇn vµ nång ®é c¸c chÊt kh¸c nhau, tuy nhiªn m«i trêng lu«n gåm 4 thµnh phÇn c¬ b¶n:  Nguån cacbon: Nguån cacbon thêng sö dông ®êng Glucose vµ sucrose. Ngoµi ra, m«i trêng cña mét sè lo¹i thùc vËt cßn sö dông mantose hoÆc lactose [12].  Nguån muèi kho¸ng: C¨n cø vµo hµm lîng chøa trong c©y, c¸c nguyªn tè kho¸ng ®îc chia thµnh hai nhãm. Nhãm c¸c nguyªn tè chiÕm mét lîng lín tõ 10-1 ®Õn 10-4 chÊt kh« gäi lµ c¸c nguyªn tè ®a lîng gåm: C, H, O, N…vv. Nhãm c¸c nguyªn tè chiÕm mét lîng nhá, tõ 10-5 ®Õn 10-7 chÊt kh« gäi lµ c¸c nguyªn tè vi lîng, ®ã lµ c¸c nguyªn tè Mn, Bo, Cu…vv [22].  Vitamin: Nãi chung c¸c m« nu«i cÊy cã kh¶ n¨ng tæng hîp ®Çy ®ñ c¸c vitamin cÇn thiÕt, tuy nhiªn víi sè lîng kh«ng ®Çy ®ñ. §Ó m« nu«i cÊy sinh trëng vµ ph¸t triÓn tèt, ngêi ta thêng ®a thªm vµo m«i trêng mét sè vitamin nhãm B nh: thiamine (B1), pyridoxine (B6), niconin (B3), riboflavin (B2) vµ vitamin C [17] [24].
5  ChÊt ®iÒu hoµ sinh trëng: C¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng tuy chiÕm hµm lîng rÊt nhá trong m«i trêng nu«i cÊy nhng cã vai trß quan träng quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng cña qu¸ tr×nh nh©n gièng. Trong m«i trêng nh©n gièng in vitro chØ sö dông c¸c chÊt trong nhãm chÊt kÝch thÝch sinh trëng bao gåm: auxin, cytokinin vµ gibberelin. Auxin ®îc sö dông ®Ó ®iÒu chØnh sù ph¸t sinh rÔ. Cytokinin sö dông ®Ó ®iÒu chØnh sù ph¸t sinh chåi. Tû lÖ c©n ®èi gi÷a auxin/cytokinin t¹o c©y hoµn chØnh [24]. Trong nh©n gièng in vitro, ngêi ta thêng sö dông auxin lµ IAA, NAA vµ IBA, cytokinin lµ BAP, BA vµ kinetin. 1.2.2. LÊy mÉu, khö trïng mÉu vµ cÊy mÉu vµo m«i trêng t¹o chåi. MÉu sau khi lÊy ®îc röa b»ng níc s¹nh (cã thÓ röa b»ng xµ phßng hoÆc c¸c chÊt tÈy röa kh¸c). Sau ®ã röa b»ng níc cÊt v« trïng, cuèi cïng khö trïng b»ng chÊt diÖt khuÈn trong buång cÊy v« trïng. MÉu cÊy thêng lÊy tõ c¸c bé phËn ®ang ph¸t triÓn m¹nh nh m« ph©n sinh ®Ønh cña chåi hoÆc rÔ hoÆc c¸c bé phËn cßn non v× c¸c bé phËn nµy cã kh¶ n¨ng t¸i sinh, sinh trëng vµ ph¸t triÓn m¹nh. Kh¶ n¨ng t¸i sinh cña mÉu cÊy phô thuéc vµo tõng lo¹i c©y, tõng giai ®o¹n ph¸t triÓn kh¸c nhau cña c¸ thÓ nh tuæi c©y mÑ, tuæi cµnh. Ngoµi ra kh¶ n¨ng t¸i sinh cña mÉu cÊy cßn phô thuéc vµo thêi ®iÓm lÊy mÉu, mïa lÊy mÉu vµ vÞ trÝ cña mÉu. Khö trïng mÉu nu«i lµ bíc cÊy khëi ®Çu quan träng trong nu«i nh©n gièng in vitro. §Æc biÖt trong mét sè trêng hîp mÉu cÊy lµ c¸c loµi quý hiÕm, sè lîng mÉu cã h¹n th× giai ®o¹n khö trïng lµ v« cïng quan träng v× tû lÖ mÉu sèng cao sÏ t¹o ra ®îc sè lîng chåi ®ñ lín cho c¸c thö nghiÖm tiÕp theo. Cã nhiÒu chÊt kh¸c nhau ®îc sö dông ®Ó khö trïng mÉu nhng cã thÓ chia chóng ra lµm 2 lo¹i:  Nhãm chÊt khö trïng bÒ mÆt nh HgCl2, HgCr2, c¸c lo¹i nuèi hypoclorit, níc «xi giµ (H2O2)…vv. §Æc ®iÓm cña nhãm chÊt khö trïng nµy lµ chóng chØ cã kh¶ n¨ng tiªu diÖt nh÷ng vi sinh vËt n»m trªn
6 bÒ mÆt cña mÉu vËt mµ kh«ng diÖt ®îc nh÷ng vi sinh vËt bªn trong m« nu«i cÊy [21].  Nhãm chÊt khö trïng cã kh¶ n¨ng thÊm s©u vµo bªn trong m« nu«i cÊy vµ tiªu diÖt vi sinh vËt tån t¹i trong m« (c¸c chÊt kh¸ng sinh nh penixillin, streptomyxin, xefotaxin…vv). Khi sö dông c¸c chÊt nµy, ngêi ta kh«ng dïng riªng lÎ mµ ®Ó khö trïng mÉu sau khi ®· khö trïng bÒ mÆt. NhiÒu loµi thùc vËt thêng chøa c¸c mÇm bÖnh nh nÊm, vi khuÈn, virus bªn trong m« hoÆc trong c¸c nghiªn cøu t¹o ra c¸c gièng c©y s¹ch bÖnh ngêi ta cÇn sö dông ph¬ng ph¸p nµy [21]. 1.2.3. CÊy t¹o chåi vµ nh©n chåi. Sau mét thêi gian nhÊt ®Þnh nu«i cÊy chåi ë m«i trêng trong èng nghiÖm, chÊt dinh dìng trong m«i trêng sÏ gi¶m ®i hoÆc kh«ng cßn do c©y hÊp thô. Thªm vµo ®ã, mét sè chÊt øc chÕ sinh trëng vµ ph¸t triÓn cña c©y ®îc chåi tiÕt ra m«i trêng, do ®ã chåi cÇn ®îc chuyÓn sang m«i trêng míi. Thêi gian cÊy chuyÓn phô thuéc vµo tõng loµi c©y vµ môc tiªu cña qu¸ tr×nh nh©n gièng. §èi víi nh©n gièng in vitro c©y b¹ch ®µn, thêi gian cÊy chuyÓn tõ 25 ®Õn 30 ngµy sau khi cÊy. Tuy nhiªn, víi nh÷ng thÝ nghiÖm mµ môc tiªu lµ duy tr× gièng hoÆc b¶o tån in vitro th× thêi gian cÊy chuyÓn cã thÓ dµi h¬n. M«i trêng nh©n chåi thêng cã mÆt cña c¶ auxin vµ cytokinin víi tû lÖ thÝch hîp víi tõng loµi thËm chÝ tõng c¸ thÓ. 1.2.4. CÊy t¹o rÔ. §Ó t¹o ra c©y con hoµn chØnh gåm rÔ, th©n vµ l¸, chåi ®îc cÊy vµo m«i trêng t¹o rÔ. Môc tiªu cña giai ®o¹n nµy lµ kÝch thÝch qu¸ tr×nh h×nh thµnh rÔ ë phÇn mÆt c¾t (phÇn gèc) cña chåi. M«i trêng t¹o rÔ thêng chØ cã mÆt cña auxin mµ kh«ng cã mÆt cña cytokinin. 1.2.5. HuÊn luyÖn c©y vµ cÊy c©y con ra bÇu Trong nh©n gièng in vitro, c©y con trong èng nghiÖm ®îc s¶n xuÊt ë ®iÒu kiÖn nh©n t¹o vÒ nhiÖt ®é, ¸nh s¸ng vµ m«i trêng dinh dìng. Do ®ã c©y
7 con cÇn ®îc huÊn luyÖn nh»m t¨ng tû lÖ sèng khi cÊy ra vên ¬m. HuÊn luyÖn c©y b»ng c¸ch ®Æt b×nh c©y ë ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é vµ ¸nh s¸ng tù nhiªn (thêng kh«ng ®Ó ¸nh s¸ng chiÕu trùc tiÕp vµo c©y, nÕu cã th× còng ®îc che tuú theo thêi ®iÓm vµ mïa). Thêi gian huÊn phô thuéc vµ tõng loµi c©y vµ tõng mïa, víi c©y b¹ch ®µn thêng thêi gian huÊn luyÖn kho¶ng 6-10 ngµy. KÕt thóc giai ®o¹n huÊn luyÖn, c©y con ®îc lÊy ra vµ cÊy vµo bÇu. Tuú thuéc vµo môc tiªu cña thÝ nghiÖm hoÆc s¶n xuÊt mµ sö dông thµnh phÇn ruét bÇu kh¸c nhau Tãm l¹i, qu¸ tr×nh nh©n gièng in vitro cã thÓ ®îc chia thµnh c¸c giai ®o¹n nh trªn nhng kÕt qu¶ cña mçi giai ®o¹n kh«ng t¸ch biÖt nhau mµ cã sù kÕ thõa cña giai ®o¹n tríc. Trong c¸c giai ®o¹n trªn th× giai ®o¹n chuÈn bÞ m«i trêng lµ ®Æc biÖt quan träng, giai ®o¹n nµy ¶nh hëng xuyªn suèt vµ quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng hay thÊt b¹i cña qu¸ tr×nh nh©n gièng. 1.3. C¬ së khoa häc cña ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro. 1.3.1. TÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo thùc vËt. Nguyªn lý c¬ b¶n cña nh©n gièng in vitro lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo thùc vËt. Mçi tÕ bµo bÊt kú cña c¬ thÓ thùc vËt ®Òu mang toµn bé lîng th«ng tin di truyÒn cÇn thiÕt vµ ®Çy ®ñ cña c¶ thùc vËt ®ã cßn gäi lµ bé gen (genom). §Æc tÝnh cña thùc vËt ®îc thÓ hiÖn ra kiÓu h×nh cô thÓ trong tõng thêi kú cña qu¸ tr×nh ph¸t triÓn phô thuéc vµo sù gi¶i m· c¸c th«ng tin di truyÒn t¬ng øng trong hÖ gen cña tÕ bµo. Do ®ã, khi gÆp ®iÒu kiÖn thÝch hîp, trong mèi t¬ng t¸c qua l¹i víi ®iÒu kiÖn m«i trêng, c¬ quan, m« hoÆc tÕ bµo ®Òu cã thÓ ph¸t triÓn thµnh mét c¸ thÓ hoµn chØnh mang nh÷ng ®Æc tÝnh di truyÒn gièng nh c©y mÑ. 1.3.2. Sù ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸ cña tÕ bµo. Qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i trong nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt thùc chÊt lµ kÕt qu¶ ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸ tÕ bµo. C¬ thÓ thùc vËt trëng thµnh lµ mét chØnh thÓ thèng nhÊt bao gåm nhiÒu c¬ quan chøc n¨ng kh¸c nhau, trong
8 ®ã cã nhiÒu lo¹i tÕ bµo kh¸c nhau, thùc hiÖn c¸c chøc n¨ng cô thÓ kh¸c nhau. C¸c m« cã ®îc cÊu tróc chuyªn m«n ho¸ nhÊt ®Þnh lµ nhê vµo sù ph©n ho¸. Ph©n ho¸ tÕ bµo lµ sù chuyÓn hãa c¸c tÕ bµo ph«i sinh thµnh c¸c tÕ bµo cña m« chuyªn ho¸, ®¶m nhËn c¸c chøc n¨ng kh¸c nhau trong c¬ thÓ. Qu¸ tr×nh ph©n ho¸ cã thÓ biÓu diÔn nh sau: TÕ bµo ph«i sinh TÕ bµo dÉn TÕ bµo ph©n ho¸ chøc n¨ng. Khi tÕ bµo ®· ph©n ho¸ thµnh m« chøc n¨ng chóng kh«ng hoµn toµn mÊt kh¶ n¨ng ph©n chia cña m×nh. Trong trêng hîp cÇn thiÕt, ë ®iÒu kiÖn thÝch hîp, chóng l¹i cã thÓ trë vÒ d¹ng gièng nh tÕ bµo ph«i sinh vµ tiÕp tôc thùc hiÖn qu¸ tr×nh ph©n hãa, qu¸ tr×nh nµy gäi lµ sù ph¶n ph©n ho¸ cña tÕ bµo. VÒ b¶n chÊt th× sù ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸ lµ mét qu¸ tr×nh ho¹t ho¸ ph©n ho¸ gen. T¹i mét thêi ®iÓm nµo ®ã trong qu¸ tr×nh ph¸t triÓn c¸ thÓ, cã mét sè gen ®îc ho¹t ho¸ ®Ó cho ra tÝnh tr¹ng míi, mét sè gen kh¸c l¹i bÞ øc chÕ ho¹t ®éng. Qu¸ tr×nh nµy x¶y ra theo mét ch¬ng tr×nh ®· ®îc m· ho¸ trong cÊu tróc cña ph©n tö AND cña mçi tÕ bµo. Khi tÕ bµo n»m trong c¬ thÓ thùc vËt, chóng bÞ øc chÕ bëi c¸c tÕ bµo xung quanh. Khi t¸ch tÕ bµo riªng rÏ, gÆp ®iÒu kiÖn thuËn lîi th× c¸c gen ®îc ho¹t ho¸, qu¸ tr×nh ph©n chia sÏ ®îc x¶y ra theo mét ch¬ng tr×nh ®· ®Þnh s½n trong AND cña tÕ bµo [24]. 1.4. Mét sè kÕt qu¶ næi bËt vÒ nu«i cÊy in vitro c©y th©n gç. 1.4.1. Trªn thÕ giíi Nh©n gièng in vitro ®èi víi c©y rõng ®· thu ®îc nh÷ng thµnh c«ng ®¸ng kÓ, ®©y lµ mét kh©u quan träng gãp phÇn t¨ng n¨ng suÊt rõng trång trªn thÕ giíi trong nh÷ng gÇn ®©y. Trong ®ã ph¶i kÓ ®Õn c«ng nghÖ nh©n gièng in vitro c©y TÕch, c¸c dßng b¹ch ®µn chän läc ë Th¸i Lan, Trung Quèc, c¸c loµi B¹ch ®µn lai ë Brazin, C«ngg« vµ «xtr©ylia, c©y V©n sam (Picea), Th«ng radiata (Pinus radiata) ë Niu Dil©n, Th«ng caribª (Pinus caribaea) vµ Th«ng lai (P. caribaea x P. elliottii) ë «xtr©ylia,…vv [23].
9 T¸c gi¶ Darus H. Ahmad thuéc ViÖn nghiªn cøu l©m nghiÖp Malaysia (Forest Research Institute) ®· nu«i cÊy in vitro c©y Keo tai tîng (Acacia mangium) b»ng m«i trêng MS cã bæ sung 3% sucrose, 0.6% agar vµ 0.5 mg/l BAP cho giai ®o¹n nh©n chåi. Nh÷ng chåi cã chiÒu cao >0.5 cm ®îc cÊy vµo m«i trêng t¹o rÔ vµ chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng tèt nhÊt cho t¹o rÔ lµ IBA ë nång ®é 1000ppm víi tû lÖ ra rÔ lµ 40% [28]. W.Nitiwattanachai [37] ®· nu«i cÊy thµnh c«ng c©y Keo l¸ trµm (Acacia auriculiformis). M«i trêng nh©n nhanh chåi lµ MS (1962) + 10 µM BAP + 0.5 µM IBA, m«i trêng sö dông cho t¹o rÔ lµ White (1963) + 2 µM IBA + 1 µM NAA. Còng víi c©y Keo tai tîng, V.J.Hartney vµ céng sù thuéc (Division of Forest Research) ®· s¶n xuÊt c©y con thµnh c«ng b»ng nu«i cÊy chåi in vitro. M«i trêng nu«i cÊy ®îc sö dông lµ WPM + 3% sucrose + 0.8% agar + 1µM BAP + 1 µM NAA. NhiÖt ®é trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy duy tr× ë 250C (  40). Giai ®o¹n khö trïng mÉu ®Ó t¹o vËt liÖu ban ®Çu t¸c gi¶ ®· sö dông muèi hypochlorite 4% vµ khö trïng trong thêi gian 20 phót [33]. 1.4.2. ë ViÖt Nam. MÆc dï cßn nhiÒu khã kh¨n cÇn gi¶i quyÕt, song trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, viÖc ¸p dông c¸c biÖn ph¸p nh©n gièng in vitro vµo nghiªn cøu vµ thùc tiÔn s¶n xuÊt trong l©m nghiÖp ®· thu ®îc kÕt qña ®¸ng khÝch lÖ. Mét sè c¬ së ®· tiÕn hµnh nh©n gièng in vitro ë quy m« c«ng nghiÖp nh ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy – Phï Ninh – Phó Thä, L©m trêng thùc nghiÖm Yªn LËp – Qu¶ng Ninh, C«ng ty Gièng c©y L©m nghiÖp Trung ¬ng, …vv. §ång thêi, mét sè tØnh vµ ®Þa ph¬ng ®· thµnh lËp phßng nu«i cÊy in vitro ®Ó phôc vô cho c«ng t¸c gièng c©y trång vµ ®· cã nh÷ng thµnh c«ng bíc ®Çu. M«i trêng dïng trong nh©n gièng in vitro cho c¸c loµi c©y th©n gç rÊt ®a d¹ng. M«i trêng kho¸ng MS (Murashige & Skoog, 1962) [26] lµ m«i trêng c¬ b¶n, giµu dinh dìng thÝch hîp cho c¸c loµi thùc vËt nãi chung. M«i
10 trêng nµy kh«ng chØ ®¬n thuÇn sö dông trong nu«i cÊy m« mµ nã cßn ®îc sö dông trong nu«i cÊy tÕ bµo, nu«i cÊy ph«i v« tÝnh, nu«i cÊy h¹t phÊn, bao phÊn…vv. M«i trêng MS c¶i tiÕn (Murashige & Skoog medium including Nitsch vitamins, 1969) [27]. §©y lµ m«i trêng MS (1962) ®îc bæ sung thªm mét sè lo¹i vitamin. M«i trêng ®îc nghiªn cøu vµ c«ng bè bëi Nitsch n¨m 1969, m«i trêng nµy ®îc sö dông ®Ó nu«i cÊy nhiÒu loµi c©y kh¸c nhau trong ®ã cã c©y MËn (Prunus spp), c©y «liu (Olea europaea)…vv. M«i trêng WPM (Woody Plant Medium) ®îc Mccown ®a ra vµo n¨m 1980 lµ m«i trêng thêng ®îc dïng ®Ó nu«i cÊy c¸c loµi c©y gç. §· cã nhiÒu c«ng tr×nh nu«i cÊy in vitro sö dông m«i trêng nµy nh nh©n gièng th«ng (Loblolly pine, Pinus taeda) ë Mü [29]. HiÖn nay, ë ViÖt Nam còng cã nhiÒu nghiªn cøu sö dông m«i trêng nµy [27]. M«i trêng Litvay lµ m«i trêng mµ tªn m«i trêng ®îc lÊy tõ tªn t¸c gi¶ nghiªn cøu ra (Litvay J.D, 1985). §©y còng lµ m«i trêng ®îc t¸c gi¶ sö dông ®Ó nu«i cÊy c©y th«ng nãi chung (Pinus) [31]. M«i trêng WV3 (Westvaco3 Medium, 1997) lµ m«i trêng ®· ®îc sö dông ®Ó nu«i cÊy c©y th«ng, c©y d¬ng [30]. Mét sè loµi c©y trång rõng quan träng, mét sè loµi c©y quý hiÕm ®· ®îc nghiªn cøu vµ s¶n xuÊt. C©y B¹ch ®µn (Eucalyptus), c©y TÕch (Techtona grandis), c©y H«ng (Paulownia fortunei) ®· ®îc ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy Phï Ninh s¶n xuÊt ë quy m« c«ng nghiÖp; c©y Keo lai (A. mangium x A. auriculiformis) c©y TrÇm giã (Aquilaria crassna Pierri), c©y Tre tµu (sinocalamus latiflus), Tre m¹nh t«ng (Dendrocalamus asper) vµ nhiÒu loµi c©y kh¸c ®· nghiªn cøu thµnh c«ng. C¸c kÕt qu¶ nµy cho thÊy bíc ®Çu cã nhiÒu triÓn väng cho s¶n xuÊt c©y con gièng chÊt lîng cao. Mai §×nh Hång, 1995 ®· ®a ra m«i trêng nu«i cÊy in vitro c©y b¹ch ®µn ur« dßng U6 nh sau: m«i trêng nh©n chåi lµ MS + 3% ®êng + 4.5 g/l agar + 0.5 mg/l BAP + 0.25 mg/l NAA. M«i trêng t¹o rÔ vµ c©y con hoµn chØnh lµ MS 1/4 nång ®é + 1.5 % ®êng + 5 g/l agar + 1 mg/l IBA [6].
11 N¨m 1998 nhãm t¸c gi¶ cña ViÖn Sinh häc nhiÖt ®íi, Së NN&PTNT Kiªn Giang vµ Trêng §¹i häc N«ng l©m Tp.HCM ®· nghiªn cøu vµ ®a ra m«i trêng nu«i cÊy c©y TrÇm h¬ng (Aquilaria crassna) lµ WPM + 0.1 mg/l BA + CW (10%) cho ph¸t sinh chåi. M«i trêng thuËn lîi cho t¹o chåi vµ nh©n nhanh chåi lµ WPM + BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) [13]. Còng víi c©y trÇm, §oµn ThÞ Mai vµ céng sù, 2005 (Trung t©m gièng c©y rõng – ViÖn khoa häc l©m nghiÖp) ®· ®a ra m«i trêng nh©n chåi thÝch hîp lµ MS c¶i tiÕn bæ sung 1.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l kinetin. M«i trêng ra rÔ thÝch hîp nhÊt lµ 1/2 MS c¶i tiÕn bæ sung 2.0 mg/l IBA [9]. Vò Ngäc Phîng vµ céng sù (ViÖn Sinh häc nhiÖt ®íi) n¨m 2002 ®· c«ng bè nghiªn cøu nh©n gièng in vitro c©y Tre tµu (Sinocalamus latiflorus) vµ Tre m¹nh t«ng (Dendrocalamus asper). MÉu vËt ®îc lÊy tõ h¹t vµ ®îc khö trïng b»ng hypoclorit canxi trong 15 phót, HgCr2 trong 5 phót. Qua nhiÒu c«ng thøc thÝ nghiÖm, nghiªn cøu thu ®îc kÕt qu¶ sau: T¹o chåi tõ h¹t tèt trªn m«i trêng MS cã BA 3 mg/l vµ Kinetin 1 mg/l; nh©n chåi tèt trªn m«i trêng MS cã BA 2mg/l vµ kinetin 1 mg/l; chåi, c©y con ra rÔ vµ sinh trëng thµnh c©y hoµn chØnh tèt trªn m«i trêng cã nång ®é kho¸ng MS gi¶m 1/2 vµ IBA 10 mg/l [15]. Nh©n gièng v« tÝnh c©y H«ng (Paulownia fortunei) b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy m« (§oµn ThÞ ¸i ThuyÒn vµ céng sù, 2005). MÉu nu«i cÊy t¹o vËt liÖu ban ®Çu tõ chåi ®Ønh vµ chåi bªn. MÉu vËt ®îc khö trïng b»ng hypoclorit canxi trong 20 phót sau ®ã cÊy vµo c¸c lo¹i m«i trêng kh¸c nhau. KÕt qu¶ thu ®îc nh sau: m«i trêng thÝch hîp nhÊt cho t¹o chåi vµ nh©n nhanh chåi lµ MS c¶i tiÕn cã bæ sung 30 g/l ®êng, 8 g/l agar, 5 mg/l BA vµ 0.1 mg/l NAA. M«i trêng t¹o rÔ vµ c©y con hoµn chØnh tèi u lµ 1/2 dinh dìng kho¸ng MS + 20g/l ®êng + 0.1 mg/l NAA + 1.0 g/l than ho¹t tÝnh [18].
12 Ch¬ng 2 Môc tiªu, ®èi tîng, néi dung vµ ph¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. Môc tiªu nghiªn cøu.  X¸c ®Þnh m«i trêng (m«i trêng ho¸ häc vµ m«i trêng vËt lý) phï hîp ®Ó nh©n gièng hai dßng b¹ch ®µn ur« PN46 vµ PN47 b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro.  T¹o ra c©y con hoµn chØnh b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro cho 2 dßng PN46 vµ PN47.  HuÊn luyÖn c©y trong èng nghiÖm vµ cÊy c©y con ra vên ¬m. 2.2. §èi tîng nghiªn cøu. Chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu nh©n gièng cho hai dßng PN46 vµ PN47. Hai dßng nµy ®· ®îc ®· ®îc tuyÓn chän vµ trång kh¶o nghiÖm dßng v« tÝnh t¹i Gia Thanh – Phó Thä cho kÕt qu¶ tèt. 2.2.1. Mét sè ®Æc ®iÓm chÝnh cña dßng PN46. C©y mÑ cña dßng PN46 lµ c©y tréi ®îc chän tõ rõng trång b¹ch ®µn E.urophylla tuæi 7 t¹i x· TÒ LÔ huyÖn Thanh S¬n tØnh Phó Thä. Rõng ®îc trång b»ng c©y con tõ nguån h¹t cã xuÊt xø vïng Lewotobi (Indonesia). C©y tréi chän tuyÓn cã c¸c ®Æc ®iÓm sau:  ChiÒu cao vît chiÒu cao quÇn thô 27% (27,0m so víi 21,3m) ®¹t 45 ®iÓm.  §êng kÝnh 1,3m lµ 18 cm so víi quÇn thô vît 26% (21,0cm so víi 16,7cm) ®¹t 30 ®iÓm.  Th©n c©y th¼ng ®Òu (6 ®iÓm); cµnh nhá ®Ñp (4 ®iÓm); gãc ph©n cµnh (3 ®iÓm); tØa cµnh tèt (3 ®iÓm); t¸n l¸ c©n ®èi (3 ®iÓm) c©y kh«ng chÏ n¹ng (3 ®iÓm)
13 Tæng sè ®iÓm lµ 97 ®iÓm (®¹t tiªu chuÈn c©y u tó). C©y tuyÓn chän ®îc dÉn gièng vµ trång kh¶o nghiÖm dßng v« tÝnh t¹i Gia Thanh-Phó Thä cho kÕt qu¶ tèt. 2.2.2. Mét sè ®Æc ®iÓm chÝnh cña dßng PN47. C©y mÑ cña dßng PN46 lµ c©y tréi ®îc chän tõ rõng trång b¹ch ®µn E.urophylla tuæi 7 t¹i x· TÒ LÔ huyÖn Thanh S¬n tØnh Phó Thä. Rõng ®îc trång b»ng c©y con tõ nguån h¹t cã xuÊt xø vïng Lewotobi (Indonesia). C©y tréi tuyÓn chän cã ®Æc ®iÓm sau:  ChiÒu cao vît chiÒu cao quÇn thô 63% (26,0m so víi 16,0m) ®¹t 45 ®iÓm.  §êng kÝnh 1,3m lµ 18 cm so víi quÇn thô vît 43% (22,5cm so víi 15,7cm) ®¹t 30 ®iÓm.  Th©n c©y th¼ng ®Òu (5 ®iÓm); cµnh nhá ®Ñp (4 ®iÓm); gãc ph©n cµnh (3 ®iÓm); tØa cµnh tèt (3 ®iÓm); t¸n l¸ c©n ®èi (3 ®iÓm) c©y kh«ng chÏ n¹ng (3 ®iÓm) Tæng sè ®iÓm lµ 96 ®iÓm (§¹t tiªu chuÈn c©y u tó). Sö dông hÖ thèng cho ®iÓm cña ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy. 2.2.3. KÕt qu¶ kh¶o nghiÖm 2 dßng v« tÝnh PN46 vµ PN47 C©y tuyÓn chän cña 2 dßng PN46 vµ PN47 ®îc nh©n gièng vµ trång kh¶o nghiÖm dßng v« tÝnh t¹i Gia Thanh-Phó Thä n¨m 1998. Rõng trång ë 5,5 tuæi cho kÕt nh sau (Phô lôc 2.1 vµ 2.2): 2.2.4. C©y cÊp dßng (c©y cung cÊp vËt liÖu nu«i cÊy). Hai dßng b¹ch ®µn ®· ®îc chän läc ë trªn ®îc nh©n gièng b»ng ph¬ng ph¸p gi©m hom vµ trång lµm c©y cÊp dßng t¹i vên ¬m cña ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy. C©y lÊy mÉu lµ c©y 1 tuæi trång ë bÇu ®Êt.
14 B¶ng 2.1. KÕt qu¶ trång kh¶o nghiÖm dßng PN46 t¹i Gia Thanh - Phó Thä ë 5,5 tuæi H vn Wh D 1.3 Wd ThÓ tÝch S BÖnh l¸ Dßng (m) (%) (cm) (%) V (dm3) (%) (%) PN46 18.6 a 8.9 13.4 a 8.0 127.5 a 100 0 PN2 15.3 bc 4.0 12.7 ab 7.7 102.5 b 95 25 U16 13.7 cd 9.5 9.5 def 16.4 49.8 efg 100 25 ®/c 11.7 e 21.6 9.1 ef 25.2 43.8 fgh 75 20 B¶ng 2.2. KÕt qu¶ trång kh¶o nghiÖm dßng PN 47 t¹i Gia Thanh - Phó Thä ë 5,5 tuæi Dßng H vn Wh D 1.3 Wd ThÓ tÝch S BÖnh l¸ (m) (%) (cm) (%) V (dm3) (%) (%) PN47 16.5 a 8.7 12.4 a 10.2 103.6 a 97 0 PN3d 16.2 ab 11.4 12.3 a 14.0 100.3 ab 77 0 PN2 14.9 bcde 4.7 12.4 a 11.1 92.2 abc 96 0 PN14 14.3 cdefg 5.7 11.3 abc 12.7 73.5 cdefg 93 7 U6 13.7 defg 11.0 11.1 abc 18.0 71.3 cdefgh 90 0 Gu8 15.2 abc 7.8 10.4 bcde 10.8 68.3 defghi 100 0 U16 13.8 defg 7.3 10.4 bcde 10.5 59.4 efghikl 100 0 ®/c 11.5 k 27.2 9.1 efg 28.1 41.4 iklm 77 39 Ghi chó: c¸c kÝ hiÖu a,b,c...biÓu thÞ c¸c dßng cã cïng kÝ hiÖu lµ kh«ng sai kh¸c nhau ë møc ®é tin cËy 95 %. KÕt qu¶ chi tiÕt vÒ sinh trëng chiÒu cao vµ sinh trëng ®êng kÝnh ë c¸c ®é tuæi kh¸c nhau ®îc tr×nh bµy ë phô biÓu 2.2.
15 ¶nh 2.1. C©y tréi dßng PN47 ¶nh 2.2. C©y tréi dßng PN46 C©y cÊp dßng Cµnh lÊy mÉu ¶nh 2.3. C©y cÊp dßng vµ cµnh lÊy mÉu cña 2 dßng PN26 vµ PN47
16 2.2.5. VËt liÖu nu«i cÊy (mÉu cÊy). MÉu nu«i cÊy (explant) lÊy tõ chåi bªn cña c©y cÊp dßng. MÉu ®îc lÊy ë chåi 15 ngµy tuæi, sinh trëng tèt, kh«ng s©u bÖnh. Chåi ®îc c¾t bá phÇn ngän non, mét phÇn cuèng l¸ vµ toµn bé phiÕn l¸. MÉu cÊy cã chiÒu dµi tõ 1.5- 3.0 cm, ®êng kÝnh tõ 2-3 mm, mang tõ 2-3 n¸ch l¸ trong ®o¹n tõ l¸ thø 3 ®Õn l¸ thø 6 . §Ò tµi tiÕn hµnh nghiªn cøu ë phßng thÝ nghiÖm vµ vên ¬m t¹i ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy thuéc x· Phï Ninh huyÖn Phï Ninh tØnh Phó Thä. 2.3. Néi dung nghiªn cøu. §Ó ®¹t ®îc môc tiªu nghiªn cøu, ®Ò tµi thùc hiÖn c¸c néi dung díi ®©y: 1. Khö trïng mÉu nu«i cÊy ë c¸c nång ®é kh¸c nhau cña HgCl2 vµ Ca(OCl)2 trong c¸c kho¶ng thêi gian kh¸c nhau ®Ó t×m ra chÊt khö trïng mÉu thÝch hîp. 2. Thö nghiÖm thêi gian nu«i mÉu ë ®iÒu kiÖn l¹nh (tñ l¹nh) sau khi c¾t mÉu tõ m«i trêng tù nhiªn vµo nu«i cÊy in vitro ë c¸c kho¶ng thêi gian kh¸c nhau. 3. Nu«i cÊy mÉu trong 5 lo¹i m«i trêng vµ x¸c ®Þnh m«i trêng thÝch hîp cho giai t¹o vËt liÖu khëi ®Çu vµ nh©n nhanh chåi. 4. Thö nghiÖm ¶nh hëng cña vitamin B2 tíi hÖ sè nh©n chåi (HSNC) vµ tû lÖ chåi h÷u hiÖu (TLCHH) cña qu¸ tr×nh nu«i cÊy. 5. Thö nghiÖm ¶nh hëng cña mét sè chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng vµ ¶nh hëng phèi hîp cña chóng ®Õn HSNC vµ TLCHH. 6. Thö nghiÖm ¶nh hëng cña mét sè chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng vµ ¶nh hëng phèi hîp cña chóng ®Õn hiÖu qu¶ cña giai ®o¹n t¹o c©y hoµn chØnh (giai ®o¹n t¹o rÔ). 7. Thö nghiÖm ¶nh hëng cña thêi gian huÊn luyÖn ®Õn tû lÖ sèng vµ sinh trëng chiÒu cao cña c©y con ë giai ®o¹n vên ¬m.
17 8. So s¸nh HSNC, TLCHH, tû lÖ chåi ra rÔ vµ tû lÖ sèng cña c©y con t¹i vên ¬m cña 2 dßng PN46, PN47 víi dßng PN14. 2.4. Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu. S¬ ®å nghiªn cøu nh©n gièng in vitro hai dßng b¹ch ®µn PN46 vµ PN47 C©y cÊp dßng ë vên ¬m (®èi tîng cÇn nh©n gièng). Xö lý cho n¶y chåi vµ c¾t mÉu. Khö trïng mÉu nu«i cÊy CÊy mÉu M«i trêng t¸i sinh chåi (giai ®o¹n t¹o vËt liÖu khëi ®Çu). 5 lo¹i m«i trêng kh¸c nhau ®Ó t×m ra m«i trêng thÝch hîp nhÊt. Nu«i mÉu trong tñ l¹nh. T¨ng tû lÖ sèng cña mÉu nu«i cÊy. M«i trêng nh©n nhanh chåil. M«i trêng ®îc bæ sung auxin, cytokinin, vµ c¸c chÊt kh¸c víi tû lÖ thÝch hîp nh»m t¨ng kh¶ n¨ng nh©n nhanh chåi. M«i trêng t¹o rÔ (t¹o c©y con hoµn chØnh). M«i trêng ®îc bæ sung auxin vµ mét sè chÊt kh¸c nh»m t¹o rÔ cho chåi in vitro. HuÊn luyÖn c©y trong b×nh. HuÊn luyÖn ë c¸c kho¶ng thêi gian kh¸c nhau. CÊy c©y ra bÇu ®Êt. 2.4.1. Khö trïng mÉu cÊy Sau khi khö trïng, ®Ó chåi cÊy tiÕp tôc sinh trëng vµ kÝch thÝch chåi ngñ ph¸t triÓn thµnh chåi non. MÉu ®îc cÊy vµo m«i trêng dinh dìng trong èng nghiÖm, v× ®©y lµ giai ®o¹n khëi ®Çu, chóng t«i cha t×m ®îc m«i trêng nu«i cÊy thÝch hîp nªn mÉu ®îc cÊy vµo m«i trêng MS + 3% ®êng + 4.5 g/l agar + 0.5 mg/l BAP + 0.25 mg/l NAA, pH =7. (M«i trêng nu«i cÊy in