Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch kháng ung thư phổi của exosome tế bào tua máu dây rốn trữ đông

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:79

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm đánh giá khả năng kích thích miễn dịch chống ung thư in vitro của các Exosome thu nhận từ tế bào tua được phân lập và nhân nuôi từ máu dây rốn người. Các kết quả nghiên cứu sẽ là tiền đề cho việc phát triển liệu pháp vắc xin mới phòng chống ung thư phổi.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch kháng ung thư phổi của exosome tế bào tua máu dây rốn trữ đông

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC ------------------------------------------ Lê Thị Huyền NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH KHÁNG UNG THƢ PHỔI CỦA EXOSOME TẾ BÀO TUA MÁU DÂY RỐN TRỮ ĐÔNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội, tháng 12 năm 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC ------------------------------------------ Lê Thị Huyền NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH KHÁNG UNG THƢ PHỔI CỦA EXOSOME TẾ BÀO TUA MÁU DÂY RỐN TRỮ ĐÔNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Mã số: 8420101.4 Chuyên ngành: sinh học thực nghiệm Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Hƣng PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Đại học Quốc gia Hà Nội đã tài trợ kinh phí cho đề tài với mã số QG.18.09 để đề tài được thực hiện và tiến hành đúng tiến độ. Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Hưng và PGS. TS. Hoàng Th Mỹ Nhung người hướng dẫn trực tiếp của tôi đã giúp tôi rất nhiều trong quá trình hoàn thành nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn hai người hướng dẫn đã tận tình giúp đỡ tôi trong đ nh hướng nghiên cứu, giải đáp thắc mắc, khó khăn đồng thời chỉ dạy tôi những bài học quý giá. Nếu không có sự hướng dẫn và giúp đỡ này, luận văn này của tôi sẽ không được hoàn thành một cách trọn vẹn. Tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. BS. Nguyễn Thanh Liêm - Viện trưởng Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec, ThS. Bùi Việt Anh – Trưởng nhóm Liệu pháp miễn d ch - Trung tâm công nghệ cao - Bệnh viện Đa khoa quốc tế Vinmec đã tạo điều kiện cho tôi có cơ hội được thực tập tại phòng thí nghiệm hiện đại bậc nhất Việt Nam được tiếp cận với những kỹ thuật, trang thiết b tiên tiến. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Trần Th Tuyết Trinh, ThS. Chu Th Thảo, TS. Thân Th Trang Uyên, ThS. Nguyễn Văn Phòng ThS. Nguyễn Đắc Tú, CN. Hoàng Hương Diễm, CN. Trần Trung Nghĩa CN Bùi Th Hồng Huế CN. Đỗ Th Hoài Thu, CN. Phạm Th Cường và những cán bộ của Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec đã hỗ trợ nhiệt tình cho tôi trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Bên cạnh đó tôi gửi lời cảm ơn tới ThS. Bùi Th Vân Khánh cùng các bạn, anh, ch tại phòng thí nghiệm Ung thư thực nghiệm – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội vì sự giúp đỡ và khuyến khích tôi trong suốt thời gian làm việc cùng nhau.
Ngoài ra, tôi xin cảm ơn trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội nơi đã cho tôi không chỉ kiến thức về Sinh học mà còn có một tầm nhìn mới về nhận thức Khoa học sự sống và các thầy cô bộ môn Sinh học Tế bào, những người kiên nhẫn dạy cho tôi kiến thức cơ bản cũng như truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm, giúp tôi có thể trở thành một nhà khoa học thực sự. Cuối cùng, tôi gửi lời biết ơn chân thành nhất tới gia đình và bạn bè thân yêu đã tin tưởng, cho tôi nguồn động lực dồi dào thúc đẩy tôi vượt qua mọi khó, thử thách. Hà Nội, tháng 12 năm 2019 Học viên Lê Th Huyền
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ Từ Tiếng Việt BSA Bovine serum albumin Albumin từ huyết thanh bê BCA Bicinchoninic acid Axit bicinchoninic Tế bào đơn nhân máu cuống CBMC Cord blood mononuclear cell rốn CD Cluster of differeniation Cụm biệt hóa Carboxyfluorescein succinimidyl CFSE Thuốc nhuộm huỳnh quang ester CTL Cytotoxic T lymphocyte Tế bào T gây độc DC Dendritic cell Tế bào tua Dex Dexosome Exosome tiết từ tế bào tua Endosomal sorting complex Phức hệ vận chuyển được ESCRT required for transport yêu cầu Cục Quản lý Thực phẩm và FDA Food and Drug Administration Dược phẩm Hoa Kỳ Granulocyte-macrophage colony- Yếu tố kích thích tạo cụm GM-CSF stimulating factor dòng hạt-mono iDC Immature dendritic cell Tế bào tua chưa trưởng thành Các chồi mọc phía bên trong ILVs Intraluminal vesicels Endosome IL Interleukin Interleukin mDC Mature dendritic cell Tế bào tua trưởng thành Tế bào ức chế có nguồn gốc MDSCs Myeloid-derived suppressor cells tủy xương Tế bào tua có nguồn gốc từ moDC Monocyte-derived Dendritic cell tế bào mono Major Histocompatibility Phức hệ phù hợp tổ chức MHC Complex chính MNC Mononuclear cell Tế bào đơn nhân
MVBs Multivesicular bodies Thể đa bào NK Natural killer Tế bào giết tự nhiên Ung thư phổi không tế bào NSCLC Non small cell lung cancer nhỏ OD Optical density Mật độ quang PS Performance status Thể trạng bệnh nhân SCLC Small cell lung cancer Ung thư phổi tế bào nhỏ Transporter associated with Bộ máy vận chuyển kháng TAP antigen processing nguyên đặc hiệu Th T helps Tế bào T bổ trợ TNF - α Tumor necrosis factor alpha Yếu tố hoại tử khối u alpha Treg Regulatory T cells Tế bào T điều hòa Thuốc nhuộm huỳnh quang 7AAD 7-amino-actinomycin D 7ADD
MỤC LỤC Chƣơng 1 - TỔNG QUAN .......................................................................................3 1.1. Thực trạng ung thƣ phổi .............................................................................................. 3 1.1.1. Thực trạng ung thư phổi............................................................................................ 3 1.1.2. Đáp ứng miễn d ch trong ung thư phổi ..................................................................... 4 1.1.3. Các phương pháp điều tr ung thư phổi .................................................................... 7 a) Điều tr đích .................................................................................................................... 7 b) Liệu pháp miễn d ch ....................................................................................................... 8 1.2. Tế bào tua ...................................................................................................................... 9 1.2.1. Đ nh nghĩa tế bào tua .................................................................................................... 9 1.2.2. Con đường trình diện kháng nguyên của tế bào tua ................................................... 11 1.2.3. Cơ chế biệt hóa tế bào tua in vitro .............................................................................. 12 1.3. Exosome ....................................................................................................................... 14 1.3.1. Đ nh nghĩa Exosome ................................................................................................... 14 1.3.2. Cơ chế hình thành Exosome ....................................................................................... 15 a) Cơ chế hình thành Exosome phụ thuộc ESCRT ........................................................... 16 b) Cơ chế hình thành Exosome không phụ thuộc ESCRT................................................ 17 1.3.3. Chức năng trình diện kháng nguyên của Exosome có nguồn gốc từ tế bào tua ......... 18 a) Khả năng trình diện kháng nguyên lớp MHC-I của Exosome có nguồn gốc từ tế bào tua...................................................................................................................................... 18 b) Khả năng trình diện kháng nguyên lớp MHC-II của Exosome có nguồn gốc từ tế bào tua...................................................................................................................................... 19 1.4. Ứng dụng của tế bào tua và Exosome trong điều trị ung thƣ ................................. 21 1.4.1. Ứng dụng tế bào tua trong điều tr ung thư tại Việt Nam ........................................... 21 1.4.2. Ứng dụng Exosome trong điều tr ung thư ................................................................. 22 1.5. Máu cuống rốn trữ đông – nguồn cung cấp tế bào mono........................................ 24 Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................26 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................................. 26 2.2. Hóa chất và thiết bị ..................................................................................................... 28 2.2.1. Hóa chất ...................................................................................................................... 28 2.2.2. Thiết b ........................................................................................................................ 29
2.2.3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao .......................................................................................... 30 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................... 31 2.3.1. Nuôi cấy dòng tế bào ung thư biểu mô phế nang phổi A549 ..................................... 31 2.3.2. Tách chiết và xác đ nh nồng độ protein tổng số từ dòng tế bào ung thư biểu mô phế nang phổi A549 ..................................................................................................................... 31 2.3.3. Rã đông máu cuống rốn trữ đông ............................................................................... 33 2.3.4. Phân lập tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn trữ đông ................................................ 33 2.3.5. Nuôi cấy, biệt hóa và trưởng thành tế bào đơn nhân thành tế bào tua ........................ 34 2.3.6. Thu hoạch tế bào tua DC và môi trường nuôi cấy tế bào tua DC ............................... 35 a) Thu hoạch môi trường nuôi cấy tế bào tua DC ............................................................. 35 b) Thu hoạch tế bào tua ..................................................................................................... 35 2.3.7. Thu nhận Exosome từ môi trường nuôi cấy tế bào tua máu cuống rốn trữ đông ....... 36 2.3.8. Phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi....................................... 36 a) Phân lập tế bào đơn nhân máu ngoại vi ........................................................................ 36 b) Phân lập tế bào Lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi ....................................... 37 2.3.9. Đánh giá ảnh hưởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trưởng của tế bào lympho T ............................................................................................................................................ 38 2.3.10. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô phế nang phổi A549 của tế bào lympho T đã cảm ứng ........................................................................................................... 40 2.3.11. Phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy ......................................................... 41 2.3.12. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................................ 42 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................43 3.1. Kết quả thu nhận protein tổng số từ dòng tế bào ung thƣ A549 ............................ 43 3.2. Rã đông máu cuống rốn trữ đông ............................................................................. 44 3.3. Phân lập tế bào mono từ máu cuống rốn trữ đông .................................................. 44 3.4. Kết quả biệt hóa tế bào mono thành tế bào DC ....................................................... 47 3.4.1. Hình thái tế bào ........................................................................................................... 47 3.4.2. Các dấu ấn bề mặt tế bào ............................................................................................ 49 3.5. Kết quả phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi.................... 52 3.6. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trƣởng của tế bào lympho T ........................................................................................................................... 53
3.7. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thƣ biểu mô phế nang phổi A549 của tế bào lympho T đã cảm ứng ........................................................................................... 56 Chƣơng 4 - KẾT LUẬN.........................................................................................59 Chƣơng 5 - KIẾN NGHỊ .......................................................................................60 Chƣơng 6 – TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................61
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cơ chế ung thư phổi thoát khỏi giám sát miễn d ch [29] ..........................4 Hình 1.2: Vai trò của PD1 và CTLA-4 trong đáp ứng miễn d ch kháng khối u. ......7 Hình 1.3: Các phương pháp điều tr ung thư phổi .....................................................8 Hình 1.4: Sự hình thành các quần thể tế bào tua [69]..............................................10 Hình 1.5: Con đường trình diện kháng nguyên của tế bào tua ................................12 Hình 1.6 : GM-CFS điều hòa sự phát triển của DC qua các tín hiệu phân từ khác nhau [86] ..................................................................................................................13 Hình 1.7: Qúa trình giải phóng Exosome từ thể đa bào MVEs [24] .......................15 Hình 1.8: Cơ chế hình thành Exosome theo con đường phụ thuộc ESCRT [30] ....17 Hình 1.9: Con đường trình diện kháng nguyên của Exosome từ tế bào tua [47] ....21 Hình 2.1: Mẫu máu cuống rốn trữ đông tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec ..26 Hình 2.2: Bản tự nguyện chấp thuận tham gia hiến tặng mẫu sinh học tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec .................................................................................27 Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm .................................................................................31 Hình 2.4: Máu cuống rỗn trữ đông chia làm 4 phần sau ly tâm với Ficoll..............34 Hình 2.4: Máu ngoại chia làm 4 phần sau ly tâm với Ficoll....................................37 Hình 3.1: Tế bào trên buồng đếm hồng cầu khi nhuộm với thuốc nhuộm Turck ...45 Hình 3.2: Tế bào đơn nhân trước và sau khi loa bỏ tế bào trôi nổi sau 2 giờ nuôi cấy ............................................................................................................................46 Hình 3.3: Quần thể tế bào trước và sau khi phân lập tế bào mono ..........................47 Hình 3.4: Hình thái tế bào mono biệt hóa thành tế bào DC.....................................49 Hình 3.5: Phân tích theo phương pháp dòng chảy tế bào các dấu ấn bề mặt tế bào vào ngày D1, D6 và D7............................................................................................50 Hình 3.6: Tỷ lệ trung bình các dấu ấn bề mặt. .........................................................52
Hình 3.8: Sự tăng sinh tế bào lympho T CD3+ khi nhuộm CSFE. .........................54 Hình 3.9: Hoạt tính gây độc lên tế bào A54 của tế bào Lympho T. ........................57 Hình 3.10: Tỷ lệ hoạt tính gây độc tế bào (mẫu 1) ..................................................58
DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Một số thử nghiệm về biệt hóa tế bào tua với các tổ hợp cytokine khác nhau ..........................................................................................................................14 Bảng 1.2: So sánh tiềm năng liệu pháp miễn d ch dựa trên DC và Dex .................22 Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm ..........................................................28 Bảng 2.1: Thiết b sử dụng trong thí nghiệm ...........................................................29 Bảng 2.2: Dụng cụ và vật tư sử dụng trong thí nghiệm ...........................................30 Bảng 2.3: Chuẩn b mẫu chuẩn dung d ch protein...................................................32 Bảng 2.5: Thiết kế thí nghiệm tế bào Lympho T cảm ứng với DC và Exosome ....39 trên đĩa 12 giếng .......................................................................................................39 Bảng 2.6: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng gây độc tế bào A549 của ..........40 tế bào Lympho T ......................................................................................................40 Bảng 2.7: Kháng thể sử dụng trong phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy ..................................................................................................................................41 Bảng 3.1: Số lượng MNC thu được từ máu cuống rỗn trữ đông .............................45 Bảng 3.2: Hiệu suất phân lập tế bào mono ..............................................................47 Bảng 3.3: Giá tr trung bình các dấu ấn bề mặt biểu hiện trên tế bào tua ở giai đoạn nuôi cấy ngày (Đơn v : %) ......................................................................................51
MỞ ĐẦU Tại Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung, gánh nặng ung thư ngày càng trở nên nghiêm trọng đòi hỏi sự quan tâm đặc biệt của toàn xã hội. Theo ghi nhận Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (International Agency for Research on Cancer, IARC) năm 2018, mỗi năm ở nước ta có khoảng 164.671 ca mới mắc, tỷ lệ mới mắc trên 100.000 dân là 151 4; đứng thứ 130 trên 186 quốc gia có báo cáo số liệu ung thư. Trong đó tỷ lệ mắc mới ung thư phổi chiếm thứ hai với 14 4% sau ung thư gan. Phần lớn người b bệnh ung thư phổi đến khám và điều tr ở giai đoạn muộn nên việc điều tr càng khó khăn tốn kém và thời gian sống ngắn. Các phương pháp điều tr ung thư truyền thống hiện nay như phẫu thuật, xạ tr , hóa tr … thường gây ra các tác dụng phụ đối với người bệnh như: đau đớn, mệt mỏi chán ăn khó thở, ho, thiếu máu, rụng tóc, chất lượng cuộc sống giảm. Vì vậy, thực tế này đòi hỏi những phương pháp điều tr mới hiệu quả hơn ít tác dụng phụ, cải thiện chất lượng sống và kéo dài thời gian sống cho người bệnh hơn so với các hình thức điều tr truyền thống. Hiện nay, liệu pháp miễn d ch được chú trọng đặc biệt, ngày càng trở thành phương thức điều tr ứng dụng rộng rãi trong điều tr ung thư sau khi thực hiện thủ thuật loại bỏ khối u, xạ tr , hóa tr . Liệu pháp này giúp tăng cường hệ miễn d ch của cơ thể, nhận diện được những kháng nguyên của khối u mà trước đó không được phát hiện. Khi các tế bào ung thư này được phát hiện, hệ thống miễn d ch sẽ loại bỏ chúng ra khỏi cơ thể một cách hiệu quả. Hơn thế nữa, liệu pháp sử dụng tế bào miễn d ch không gây xâm lấn và ít gây đau đớn cho người bệnh. Đây là một liệu pháp đầy hứa hẹn trong việc điều tr ung thư. Tế bào tua là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp gây đáp ứng miễn d ch tế bào T ngăn chặn sự phát triển khối u. Và trong những thập kỷ gần đây vắc xin dựa trên tế bào tua đã và đang trở thành một chiến lược quan trọng trong liệu pháp miễn d ch điều tr ung thư. Tuy nhiên sử dụng tế bào tua trong điều tr ung thư có một số nhược điểm như các tế bào tua thường khó lưu trữ và phải đòi hỏi quá trình thu nhận phức tạp cũng như cần nhiều kỹ thuật đánh giá chất lượng tế bào. Gần đây các exosome tiết từ tế bào tua (Dex) chỉ ra những chức năng đáp ứng miễn d ch tương tự và được 1
phát triển để sử dụng như là một cách thay thế. Giống như DC Dex biểu hiện các phức hệ phù hợp tổ chức chính (MHC lớp 1, MHC lớp 2), các phân tử đồng kích thích và các thành phần khác tương tác với các tế bào miễn d ch. Trong những năm gần đây liệu pháp ghép tế bào tua đồng loài đã được nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng và tế bào máu dây rốn chính là một nguồn thay thế đầy tiềm năng trong liệu pháp miễn d ch đồng loài điều tr ung thư. Sử dụng các exosome phân lập từ các tế bào tua máu dây rốn làm vắc xin phòng chống ung thư chính là hướng nghiên cứu mới, khắc phục được các nhược điểm của các phương pháp khác. Dựa trên cơ sở đó chúng tôi thực hiện đề tài: “nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch kháng ung thƣ phổi của exosome tế bào tua máu dây rốn trữ đông” để đánh giá khả năng kích thích miễn d ch chống ung thư in vitro của các Exosome thu nhận từ tế bào tua được phân lập và nhân nuôi từ máu dây rốn người. Các kết quả nghiên cứu sẽ là tiền đề cho việc phát triển liệu pháp vắc xin mới phòng chống ung thư phổi. 2
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.1. Thực trạng ung thƣ phổi 1.1.1. Thực trạng ung thƣ phổi Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất và cũng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới do chẩn đoán muộn và điều tr hạn chế ở cả nam giới và nữ giới [31]. Dựa trên ước tính của GLOBOCAN 2018, có khoảng 2,1 triệu trường hợp mắc mới (chiếm 11,6% tổng số trường hợp ung thư mới) và 1,7 triệu trường hợp tử vong liên quan đến ung thư phổi (chiếm 18,4% tổng số trường hợp tử vong). Hầu hết các trường hợp ung thư phổi được chẩn đoán ở giai đoạn cuối khi khối u đã di căn khi đó chi phí điều tr tốn kém nhưng hiệu quả thấp, tỷ lệ tái phát cao. Hút thuốc là yếu tố nguy cơ hàng đầu gây nên ung thư phổi và chiếm đến 80% cái chết do ung thư phổi [74]. Thời gian sử dụng thuốc lá cũng như số lượng tiêu thụ thuốc lá/ngày tỷ lệ thuận với nguy cơ mắc ung thư phổi. Bên cạnh đó tiếp xúc với radon (khí ga tự nhiên-chất gây ung thư tự nhiên), ami-ăng asen không khí ô nhiễm… cũng là những yếu tố tăng nguy cơ ung thư phổi. Ngoài ra, một số yếu tố liên quan đến ung thư phổi di truyền cũng đã được chứng minh như đột biến soma trong gen TP53 đột biến gene EGFR, gen mã hóa cho thụ thể nicotine acetylcholine [30, 47]. Ung thư phổi được chia làm hai loại dựa theo theo loại tế bào b ảnh hưởng: ung thư phổi tế bào nhỏ chiếm 15% (small cell lung cancer (SCLC)) và phần lớn là ung thư phổi không tế bào nhỏ (non-small cell lung cancer (NSCLC)) chiếm 85% bao gồm các loại: ung thư biểu mô tuyến (chiếm 40%) ung thư biểu mô vẩy (25-30%) và ung thư tế bào lớn (5-10%) [74]. Tùy thuộc vào loại ung thư cũng như giai đoạn bệnh mà bệnh nhân có các phác đồ điều tr khác nhau. Tuy nhiên, mặc dù có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán và điều tr ung thư phổi vẫn là căn bệnh gây ra nhiều thách thức cho các bác sỹ lâm sàng do đáp ứng bệnh không tốt, tỷ lệ bệnh nhân ung thư phổi sống trên 5 năm là dưới 5% [51]. Vì vậy, nhu cầu làm rõ cơ chế gây bệnh, áp dụng phối hợp các phương pháp điều tr là cần thiết để có thể nâng cao hiệu quả chữa bệnh và kéo dài thời gian sống của bệnh nhân. 3
1.1.2. Đáp ứng miễn dịch trong ung thƣ phổi Một trong số các loại tế bào miễn d ch có chức năng quan trọng việc tiêu diệt khối u là tế bào lympho T gây độc (CTL - cytotoxic T Lymphocytes). Tế bào CTL hoặc tế bào giết tự nhiên NK (Natural killer cell) được huy động nhờ sự trình diện các kháng nguyên ung thư chủ yếu bởi tế bào tua (Dendritic cell-DC) và đại thực bào. Tuy nhiên, chức năng trình diện kháng nguyên trong ung thư ác tính thường b suy giảm. Chức năng phòng thủ chống ung thư được cân bằng và sau đó vượt quá mức do điều hòa đáp ứng miễn d ch. Hình 1.1: Cơ chế ung thƣ phổi thoát khỏi giám sát miễn dịch [22] Ung thư phổi trốn thoát khỏi giám sát miễn d ch nhờ vào các tế bào gây ức chế miễn d ch trong vi môi trường khối u: tế bào T điều hòa Treg, tế bào ức chế có nguồn gốc tủy xương MDSCs, đại thực bào hoặc ức chế hoạt hóa tế bào T thông qua các chốt kiểm soát miễn d ch Vai trò bảo vệ cơ thể cũng như quá trình phát triển khối u là kết quả tương tác giữa các tế bào ung thư và hệ thống miễn d ch được gọi là ―chỉnh sửa miễn d ch‖ 4
(immunoediting) bao gồm ba pha riêng biệt: loại trừ, cân bằng và trốn thoát [70]. Trong giai đoạn loại trừ đáp ứng miễn d ch cấp tính, bao gồm hệ miễn d ch bẩm sinh và đáp ứng, nhận diện và tiêu diệt các tế bào ung thư thông qua một quá trình gọi là giám sát miễn d ch trước khi chúng phát triển thành một khối u [70]. Các dòng tế bào ung thư thoát khỏi pha loại trừ duy trì trạng thái không hoạt động trong pha cân bằng tiếp theo, trong thời gian này, sự phát triển khối u không xảy ra nhưng khả năng miễn d ch của các tế bào khối u tiếp tục được đ nh hình dưới áp lực miễn d ch chọn lọc từ hệ miễn d ch đáp ứng. Hệ quả của áp lực chọn lọc là quá trình ức chế miễn d ch trung gian khối u làm thay đổi quần thể tế bào khối u, dẫn đến trốn thoát miễn d ch và tăng trưởng khối u [70]. Các tế bào khối u bước vào pha trốn thoát miễn d ch có thể tạo ra trạng thái ức chế miễn d ch trong vi môi trường khối u bao gồm: tế bào ung thư nguyên bào sợi, tế bào nội mô đại thực bào, tế bào tua, tế bào lympho và các chất ngoại bào với nhiều chất trung gian như cytokine chemokine các yếu tố tăng trưởng và enzyme [55]. Các loại tế bào gây ức chế miễn d ch chính được tìm thấy trong vi môi trường khối u là tế bào T điều hòa (regulatory T cells (Treg)), tế bào ức chế có nguồn gốc tủy xương (myeloid-derived suppressor cells (MDSCs)) và các đại thực bào liên quan đến khối u (tumor-associated macrophages (TAM)) [42, 55]. - Tỷ lệ cao Treg trong các khối u liên quan đến tiên lượng xấu ở nhiều loại ung thư khác nhau bao gồm: ung thư phổi không tế bào nhỏ ung thư dạ dày, tế bào gan, tụy, tế bào thận ung thư vú và ung thư cổ tử cung. Treg (biểu hiện các marker bề mặt CD4, CD25 và yếu tố phiên mã Foxp3) ức chế chức năng và sự tăng sinh của các tế bào T CD4+, CD8+ đặc hiệu khối u và tế bào NK. Dựa theo nghiên cứu của Shigematsu và cộng sự (2012), quần thể tế bào Treg có tỷ lệ cao hơn đáng kể trong khối u và các hạch lympho so với máu ngoại vi trong ung thư phổi [56]. Tương tự, sự biểu hiện của Foxp3 có trong khoảng một phần ba người bệnh mắc NSCLC và tỷ lệ Foxp3/CD8 là chỉ số dự đoán đáp ứng hóa tr ở người bệnh giai đoạn tiến triển [38]. - Trong NSCLC, MDSCs được xác đ nh bằng các dấu ấn bề mặt: CD11+CD14- CD15+CD33+. MDSCs cảm ứng các tế bào Treg, hạn chế sự tăng sinh tế bào T chức 5
năng (effector T cell) thông qua sản xuất các phân tử ức chế miễn d ch khác nhau. MDSCs hoạt hóa arginase, tổng hợp oxit nitric (NO), tạo các gốc oxy tự do (radical oxygen species ROS) và tiêu thụ cystein làm ức chế hoạt hóa các tế bào T và biệt hóa các loại tế bào nhớ [46]. Ở bệnh nhân ung thư phổi, MDSCs có khả năng tạo ra IL-10 MMP9 và TGFβ kích thích sự hình thành mạch và di căn. Sự biểu hiện quá mức COX2 trong ung thư phổi và quá trình chuyển tiếp trung biểu mô (epithelial- mesenchymal transition EMT) có vai trò quan trọng trong ức chế đáp ứng miễn d ch kháng khối u của MDSCs. - TAM là các đại thực bào tập trung tại các khối u rắn, có vai trò trong sự tăng trưởng, tiến triển và di căn của khối u, bao gồm đại thực bào phân cực M1 (kháng khối u) và đại thực bào M2 (thúc đẩy tăng trưởng và di căn khối u). Nghiên cứu của Ma J và cộng sự đã chỉ ra rằng mật độ M1 có trong khối u ở nhóm người mắc NSCLC có tỷ lệ sống dài cao hơn so với nhóm người có có tỷ lệ sống thấp [41]. Trong khi đó sự biểu hiện của IL-17 và prostaglandin E2 (PGE2) trong vi môi trường khối u kích thích M2 biệt hóa và chiếm ưu thế [40]. Ngoài ra, ức chế miễn d ch còn xảy ra thông qua hai chốt kiểm soát miễn d ch CTLA-4 (T-lymphocyte-associated protein 4) và PD-1(Programmed death 1). CTLA-4 là phân tử có cấu trúc tương đồng với thụ thể đồng kích thích CD28, cạnh tranh liên kết với các phối tử CD80/CD86 biểu hiện trên bề mặt tế bào trình diện kháng nguyên [49]. Nhờ có ái lực cao, CTLA-4 ngăn cản thụ thể CD28 liên kết với CD80/CD86, do đó cung cấp tín hiệu ức chế đến tế bào T ngăn cản quá trình tế bào T hoạt hóa. Ghi nhận ở người mắc NSCLC cho thấy tỷ lệ CTLA4 nội bào cao hơn so với tỷ lệ tế bào lympho T CD4+ [24]. Giống như CTLA-4, PD-1 cũng ức chế hoạt động của tế bào T thông qua giảm tín hiệu đồng hoạt hóa của thụ thể CD28 nhưng không cạnh tranh trong tương tác với CD80/CD86, mà ức chế hoạt tính của thụ thể CD28. PD-1 biểu hiện trên bề mặt tế bào T đã hoạt hóa liên kết với các phối tử PD-L1/PD-L2 biểu hiện trên bề mặt ở các tế bào ung thư dưới tác động IFN-γ do tế bào Th đã tiết ra, cung cấp tín hiệu ức chế trong pha chức năng (effector phase) đáp ứng tế bào T, giảm sản xuất cytokine tăng sinh tế bào [14]. 6
Hình 1.2: Vai trò của PD1 và CTLA-4 trong đáp ứng miễn dịch kháng khối u. CTLA-4(A) cạnh tranh liên kết với phân tử CD28 trong liên kết với phân tử đồng kích thích CD80/86 và PD-1(B) giảm hoạt tính CD28 khi liên kết với PD-L1 hoặ PD-L2 [60]. 1.1.3. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ phổi SCLC ít phổ biến trong ung thư phổi nhưng khả năng lây lan sang các v trí khác trong cơ thể cao. Vì vậy, hóa tr là phương pháp ưu tiên trong SCLC. Phẫu thuật hiếm khi sử dụng đôi khi được áp dụng để lấy các mẫu sinh thiết mô xác đ nh loại ung thư phổi mắc phải. Trong khi đó NSCLC chiếm phần lớn trong ung thư phổi, có xu hướng phát triển chậm và mất nhiều thời gian để xâm lấn nên các phương pháp điều tr cục bộ: phẫu thuật và/hoặc xạ tr , hóa tr là phương pháp điều tr chính. Tuy nhiên, các phương pháp điều tr truyền thống trên thường gây ra nhiều tác dụng phụ cho người bệnh như: giảm sức khỏe, gây mệt mỏi chán ăn rụng tóc... Vì vậy hiện nay, một số phương pháp mới trong điều tr ung thư đang được tập trung nghiên cứu và phát triển, nổi bật là phương pháp điều tr đích và liệu pháp miễn d ch. a) Điều trị đích 7
NSCLC thường liên quan đến mức độ biểu hiện thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì EGFR (Epidermal growth factor receptor) với tần xuất cao, chiếm khoảng 40-80% bệnh nhân. Dựa theo hai con đường hoạt hóa chính: PI3K / AKT / mTOR và RAS / RAF / MEK / MAPK, EGFR kích thích tăng trưởng khối u, xâm lấn cục bộ, tạo mạch, tự thực bào (autophagy), và chuyển hóa tế bào [35]. Do đó điều tr đích là phương pháp sử dụng thuốc nhắm vào các phân tử đích để ngăn chặn con đường thúc đẩy khối u tiến triển và kiểm soát bệnh tốt trong khoảng thời gian dài. Có khoảng 22 loại thuốc điều tr đích đã được Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ FDA (U.S. Food and Drug Administration) công nhận trong điều tr ung thư phổi bằng cách ức chế các gene đảm nhận các nhiệm vụ khác nhau như: EGFR, VEGF (vascular endothelial growth factor-yếu tố tăng trưởng nội mô thành mạch) TP53 ALK ROS1 BRAF… Phẫu thuật Liệu pháp miễn d ch Xạ tr Phương pháp điều tr Ung thư phổi Điều tr đích Hóa tr Hình 1.3: Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ phổi Phẫu thuật, xạ tr , hóa tr điều tr đích và liệu pháp miễn d ch. b) Liệu pháp miễn dịch Mặc dù đã có những tiến bộ mạnh mẽ trong điều tr NSCLC, hầu hết các bệnh nhân đều trải qua giai đoạn tiến triển của bệnh đáp ứng không tốt sau hai hoặc nhiều hơn hai chu kỳ hóa tr liệu, nên việc phát triển các phương pháp điều tr mới là cần thiết. Liệu pháp miễn d ch chính là một bước ngoặt mới, là lựa chọn thay thế và bổ sung cho điều tr 8