intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:103

Thêm vào BST
Báo xấu
70
lượt xem 8
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn thực hiện với 2 mục tiêu chính sau đây: Xây dựng quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S. suis ở bệnh phẩm người; xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện để bộc lộ DNA của S. suis.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ Đặng Thị Kiều Oanh NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN  QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP  Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
  2. Hà Nội – 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ Đặng Thị Kiều Oanh NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN  QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP  Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC        NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHAN LÊ THANH  HƯƠNG
  3. Hà Nội ­ 2013
  4. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    LỜI CẢM ƠN Để  hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ  lòng biết  ơn sâu sắc tới   PGS.TS. Phan Lê Thanh Hương, Trưởng Khoa Vi Khuẩn, Trưởng Phòng Vi   khuẩn hô hấp, Viện Vệ  sinh dịch tễ  Trung  ương đã tận tình hướng dẫn,   động viên và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thanh Thủy –   Trưởng Khoa An toàn sinh học ­ Quản lý chất lượng, Viện Vệ sinh dịch tễ   Trung  ương và tập thể  Khoa   đã tạo mọi điều kiện về  thời gian cho tôi   thực hiện đề tài. Tôi xin cảm  ơn tập thể Phòng Vi khuẩn hô hấp, Viện Vệ sinh dịch tễ   Trung  ương học đã chỉ  bảo, giúp đỡ, chia sẻ  tận tình cho tôi những kinh   nghiệm chuyên môn trong quá trình làm thực nghiệm. Tôi xin gửi lời cảm  ơn chân thành đến các thầy, các cô trong Khoa   sinh học, đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh vật học, trường Đại   học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi   trong quá trình học tập. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn luôn động viên tinh thần để tôi   hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày   tháng  năm 2013 Học viên Đặng Thị Kiều Oanh Đặng Thị Kiều Oanh                                                                                           Cao học  K18
  5. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    Đặng Thị Kiều Oanh                                                                                           Cao học  K18
  6. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    MỤC LỤC  Capsular polysaccharide   .................................................................................                                                                                  10         Deoxyribonucleic acid   ....................................................................................                                                                                     10         Polymerase chain reaction   ..............................................................................                                                                               10         ĐẶT VẤN ĐỀ                                                                                                      ..................................................................................................      1  1.1. GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis.suis                                                                      ..................................................................      3  1.1.1. Giới thiệu chung   ....................................................................................                                                                                     3       1.1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán                                                                                                                              5 ...........................................................................................................................       1.1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis   .................................................................                                                                  7        1.2. SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƯỜI CỦA S.suis                                                           .......................................................       16  1.3. BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG                                                                                        ...................................................................................       20  1.3.1. Đường lây truyền   ................................................................................                                                                                 20         1.3.2. Triệu chứng   .........................................................................................                                                                                          21         1.3.3. Biện pháp phòng bệnh   ........................................................................                                                                         22         1.3.4. Biện pháp chống dịch   ..........................................................................                                                                           23         1.3.5. Nguyên tắc điều trị   ..............................................................................                                                                               23         1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM                                ............................       24  1.4.1.  Nuôi cấy phân lập   ..............................................................................                                                                               24         1.4.2. Nhuộm Gram   ........................................................................................                                                                                         24         1.4.3. Phản ứng catalase   ................................................................................                                                                                 24         1.4.4. Xét nghiệm định danh, định typ:   .........................................................                                                          24         1.4.5. Phát hiện vi khuẩn S. suis b ằng ph ản  ứng Realtime PCR   ...............                25         1.5. PHƯƠNG PHÁP PCR                                                                                                 ............................................................................................       26 1.5.1. Giới thiệu v ề ph ương pháp khuếch đại gen (polymerase chain   reaction – PCR)    .............................................................................................                                                                                              26         1.5.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR   .................................................                                                  27         1.5.3. Giới thiệu v ề ph ản  ứng PCR đa mồi   .................................................                                                  31         CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU                ...........       37  2.1 .VẬT  LIỆU NGHIÊN CỨU                                                                                         .....................................................................................       37  2.1.1. Chủng vi khu ẩn s ử dụng trong nghiên cứu    ......................................                                       37         2.1.2. Dịch não tủy nền    ................................................................................                                                                                 38        Đặng Thị Kiều Oanh                                                                                           Cao học  K18
  7. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học     2.1.3. Dịch não tủy của bệnh nhân đượ c chẩn đoán lâm sàng viêm màng  não cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi   được xây dựng trong đề tài):     ......................................................................                                                                       38         2.1.4. Sinh phẩm nghiên cứu:   ........................................................................                                                                         38         2.1.5. Trang thi ết bị, dụng c ụ   .......................................................................                                                                        41         2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:                                                                              ........................................................................       41  2.2.1. Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô phỏng   ..............................................                                               42        2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S. suis và một số yếu   tố chủ yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn   .........................................                                          48         2.2.3. Nghiên cứu tối ưu chu trình nhiệt    .....................................................                                                      49         2.2.4. Nghiên cứu tối ưu các thành phần tham gia ph ản  ứng    ....................                     51        2.2.5. Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố  độc lực của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi đượ c xây dựng trong   nghiên cứu. Tính ổn định của PCR đa mồi.   .................................................                                                  52        2.2.6. Đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi (khả năng bắt cặp chéo)  với những vi khuẩn phổ bi ến gây hội chứng lâm sàng viêm màng não   giống S. suis   ...................................................................................................                                                                                                    52        2.2.7. Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm để tách chiết DNA của S. suis                                                                                                                            53 .........................................................................................................................        2.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP                                 .............................       54  2.3.1. Tiêu chuẩn xác định chẩn đoán dương tính và âm tính   ....................                     54         2.3.2. Các chỉ số tính toán độ tin cậy và giá trị của phương pháp [3, 4]   ...    55         CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN                                                  ..............................................       57 3.1.   XÂY   DỰNG   QUY   TRÌNH   PCR   ĐA   MỒI   PHÁT   HIỆN   TRỰC   TIẾP   Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN                    ................       57  3.1.1. Tạo bệnh ph ẩm mô phỏng   .................................................................                                                                  57         3.1.2. Lựa chọn các cặp mồi và tổ hợp mồi  phù hợp:     .............................                              58        3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng PCR đa mồi phát hiện S.   suis và một số yếu tố độc lực phổ biến   ......................................................                                                       60                                                                                                                                                       ......................................................................................................................................       61                                                                                                                                                .......................................................................................................................................       61 3.1.4. Tối ưu hóa các thành phần tham gia ph ản  ứng PCR đa mồi phát   hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến   .........................                          62         .........................................................................................................................................                                                                                                                                            65      Đặng Thị Kiều Oanh                                                                                           Cao học  K18
  8. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học     .........................................................................................................................................                                                                                                                                            65      3.1.5. Độ nhạy và tính ổn định của quy trình PCR đượ c xây dựng (khả   năng lặp lại kết quả)   .....................................................................................                                                                                      67                              Độ lặp lại của kỹ thuật                                                                                 .............................................................................       68                         (10 lần thử nghiệm)                                                                                     .................................................................................       68             1                                                                                                                                 ............................................................................................................................       68                0/10                                                                                                                         ....................................................................................................................       68  3.1.6. Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi (tính đặc hiệu)   với những vi khuẩn phổ bi ến gây bệnh cảnh lâm sàng giống S. suis   .......        69        3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ BỆNH PHẨM ĐƠN GIẢN, DỄ THỰC HIỆN  ĐỂ  BỘC LỘ  DNA CỦA VI KHUẨN Streptococcus suis ĐẠT HIỆU QUẢ  (ĐÁNH   GIÁ BẰNG KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CỦA PCR ĐA MỒI)                                               ..........................................       70 3.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI KHI   ÁP DỤNG VỚI BỆNH PHẨM LÂM SÀNG                                                                     .................................................................       75 3.3.1. Kết quả nuôi cấy phân lập/xác định đượ c vi khuẩn từ bệnh phẩm:                                                                                                                               75 .........................................................................................................................       3.3.2. Các chi số đánh giá độ chính xác và giá trị hữu ích của các phươ ng   pháp   .................................................................................................................                                                                                                                  76         KẾT LUẬN                                                                                                        ...................................................................................................       80  TÀI LIỆU THAM KHẢO                                                                                ............................................................................       83 Đặng Thị Kiều Oanh                                                                                           Cao học  K18
  9. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vi khuẩn liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi  điện tử  3 (http://genome.jgi­psf.org/strsu/strsu.home.html) 3       Hình 1.2: Khuẩn lạc S. suis trên môi trường thạch máu cừu và  thạch máu ngựa 4                 Hình 1.3. Bệnh nhân bị nhiễm S. suis  (http://www.pig333.com/what_the_experts_say/streptococcus­suis­ zoonotic­epidemic­in­asia_4091/) 22 Hình 1.4.  Sơ đồ phản ứng PCR  27 (http://fmel.ifas.ufl.edu/buzz/csPCR.shtml) 28 Hình 3.1. Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 1 đến tổ  hợp 8) 58 Hình 3.2.Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 9 đến tổ  hợp 16) 59  Hình 3.3. PCR đa mồi với các điều kiện phản ứng tối ưu phát hiện  trực tiếp S. suis trong bệnh phẩm 62 Hình 3.4. Thử nghiệm hàm lượng các mồi với nồng độ mỗi mồi là  20pmol/µl 64 Hình 3.5. Thử nghiệm hàm lượng mồi với nồng độ mồi khác nhau 65 Hình 3.6. Thử nghiệm Quy trình PCR đã xây dựng trên mẫu bệnh  phẩm  66 với các thể tích mẫu khác nhau  66 Hình 3.7. Mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và 2 yếu tố độc lực của vi  khuẩn bởi PCR đa mồi đã hoàn thiện (kết quả với bệnh phẩm mô  phỏng) 67 Đặng Thị Kiều Oanh                                                                                           Cao học  K18
  10. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    Hình 3.8. Kiểm tra tính đặc hiệu của tổ hợp gen mồimồi & quy trình  PCR đa mồi 69 Hình 3.9.  Xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy ở nhiệt độ 850C và  900C trong 60 phút 71  Hình 3.10. Hiệu quả xử lý dịch não tủy ở nhiệt độ 800C với thời gian  ủ khác nhau 72 Hình 3.11. Hiệu quả xử lý dịch não tủy bằng Kit và bằng nhiệt độ  800C/60’ 73 Hình 3.12. Hiệu quả xử lý dịch não tủy của bệnh nhân ở  800C/60’(đánh giá bởi PCR      đơn mồi) 74 Hình 3.13. Ứng dụng quy trình PCR đa mồi đã được xây dựng trên  mẫu bệnh phẩm 75 Đặng Thị Kiều Oanh                                                                                           Cao học  K18
  11. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    DANH MỤC BẢNG   Bảng 1.1. Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis                                ............................      4 Bảng 2.1. Một số trình tự mồi chủ yếu (primer) được sử dụng trong   nghiên cứu [11,25,39,41]                                                                                   ...............................................................................       40  Bảng 2.2.  Các tổ hợp mồi được sử dụng trong thử nghiệm                    ................       48  Bảng 2..3. Các chu trình PCR đa mồi được thử nghiệm                            ........................       50  Bảng 2.3. Bảng số liệu cơ bản để tính toán các chỉ số                              ..........................       55 Bảng 2.4. Mức độ LR+, LR ­  liên quan  đến khả năng mắc bệnh và   không mắc bệnh                                                                                               ...........................................................................................       56 Bảng 3.1. Kết quả khẳng định lại đặc tính của vi khuẩn dùng làm   mẫu                                                                                                                     .................................................................................................................       57 Bảng 3.2. Các tổ hợp mồi thích hợp được lựa chọn trong thí nghiệm                                                                                                                            59 .........................................................................................................................     Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các chu trình PCR đến khả năng phát hiện   S.suis                                                                                                                   ...............................................................................................................       60 Bảng 3.4. Khả năng phát hiện vi khuẩn và các yếu tố độc lực khi thay   đổi điều kiện quy trình PCR đa mồi                                                             .........................................................       61 Bảng 3.5. Thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi được khảo sát                                                                                                                            62 .........................................................................................................................     Bảng 3.6. Tính ổn định của Quy trình PCR khi thực hiện trên mẫu   bệnh phẩm                                                                                                        ....................................................................................................       68 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý bệnh phẩm   dùng/không dùng kit                                                                                         .....................................................................................       70 Bảng 3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR đa mồi so   với phương pháp nuôi cấy phân lập (chuẩn vàng) với n = 144                 .............       76 Đặng Thị Kiều Oanh                                                                                           Cao học  K18
  12. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    Bảng 3.9. So sánh kết quả ba hai phương pháp: PCR đơn mồi, đa mồi   và nuôi cấy phân lậpNCPL                                                                             .........................................................................       77 Bảng 3.10. Các chỉ số đánh giá độ chính xác và sự hữu ích của phương   pháp PCR đa mồi  và nuôi cấy phân lập (n=153)                                         .....................................       77 Đặng Thị Kiều Oanh                                                                                           Cao học  K18
  13. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bbp Base pair C (­)  Chứng âm C (+) Chứng dương Cps Capsular polysaccharide DNA Deoxyribonucleic acid DNT Dịch não tủy Eef Extracellular factorr Mrp Muramidase­released protein NCPL Nuôi cấy phân lập PCR Polymerase chain reaction Pư Phản ứng Sly Suiis lysin S.suis Streptococcus suis VMN Viêm màng não VK Vi khuẩn Đặng Thị Kiều Oanh                                                                                           Cao học  K18
  14. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm 1960s trên thế giới và vài năm gần đây tại khu vực châu Á  trong đó có Trung Quốc và Việt Nam, luôn có sự cảnh báo về tầm nghiêm trọng  của vi khuẩn Streptococcus suis (S. suis) như  một tác nhân gây bệnh nguy hiểm   cho người và có tiềm năng gây các vụ bùng phát dịch. Tại Việt Nam, nhiễm trùng cấp tính ở người do S. suis đã và đang được coi  là một bệnh nhiễm trùng mới nổi, có khả năng gây tỷ lệ tử vong và di chứng cao.  Rất nhiều trường hợp mắc bệnh có các biểu hiện lâm sàng rất nặng như: nhiễm  khuẩn huyết, viêm màng não có ban xuất huyết và hoại tử, hội chứng sốc nhiễm   trùng nhiễm độc liên cầu. Số liệu lâm sàng sơ bộ của một số viện và bệnh viện   lớn như  Viện Các Bệnh truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia, Bệnh viện Chợ  Rẫy, Bệnh viện Trung ương Huế đã cho thấy S. suis là một trong những nguyên  nhân chủ  yếu gây bệnh nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ   ở  người lớn   tại Việt Nam. Ở  các nước có nền kinh tế  phát triển, việc chẩn đoán   S. suis  bởi các kỹ  thuật nuôi cấy phân lập kinh điển hoặc phát hiện kháng nguyên đặc hiệu bằng   các kỹ thuật miễn dịch học, thậm chí các kỹ thuật sinh học phân tử rất phổ biến.   Ở  Việt Nam, vì sự  không đồng bộ  về  cơ  sở  vật chất, trang thiết bị cũng   như  sự  không  ổn định về  kỹ  năng thực hành chẩn đoán phòng thí ngiệm, những  phương pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm chẩn đoán S. suis rất khó có thể áp  dụng rộng rãi. Tuy nhiên trong các phương pháp hiện đại, nhanh và chính xác,  phương pháp PCR đa mồi (nhân gen đa mồi) là phương pháp có tính khả  thi hơn  cả  về  mặt kinh tế  và kỹ  năng thực hiện so với phương pháp PCR định lượng   (Real time PCR). Với phương pháp PCR đa mồi, chúng ta có thể  đồng thời phát  Đặng Thị Kiều Oanh                                   1   Cao học K18
  15. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    hiện được sự có mặt của vi khuẩn S. suis, xác định được typ huyết thanh (typ 2)  và có thể  một hoặc vài gen độc lực của vi khuẩn. Phương pháp này giúp tiết   kiệm sinh phẩm, thời gian, công sức và có độ đặc hiệu cao.  Chính vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề  tài “Nghiên cứu phát triển và  hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để  phát hiện trực tiếp  Streptococcus suis  từ dịch não tủy của người” với 2 mục tiêu chính sau đây:   ­ Xây dựng quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp  S. suis ở bệnh phẩm  người;   ­ Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện để  bộc lộ  DNA của S. suis. Đặng Thị Kiều Oanh                                   2   Cao học K18
  16. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis.suis 1.1.1. Giới thiệu chung Streptococcus suis  là  vi khuẩn Gram dương, kỵ  khí tùy tiện, kích thước  khoảng   1µm,   không   có   lông,   không   sinh   nha   bào.   Trong   bệnh   phẩm,   chúng  thường xếp thành chuỗi hoặc thành đôi (Hình 1.1).  S.suis  có yếu tố  quyết định  kháng nguyên liên quan đến nhóm D theo phân loại của Lancefield, mặc dù về  mặt di truyền, vi khuẩn này không có sự liên quan đến thành viên khác của nhóm  này. Thời điểm ban đầu, theo hệ  thống phân loại của  Lancefield, S. suis thuộc  nhóm R, S và T tương  ứng với các type huyết thanh 2, 1 và 15 [36]. Nhưng đến  năm 1995, dựa vào cấu trúc vỏ  các nhà khoa học đã nghiên cứu được  S.suis  có  tổng cộng 35 type huyết thanh (từ typ 1 đến typ 34 và typ 1/2 ) [48] nhưng typ 32  và 34 vừa được chứng minh là  Streptococcus orisratti.  Mặc dù vậy, các chủng  gây bệnh cho người đáng chú ý là typ 1, 2, 14, chúng có thể thay đổi theo vùng và   theo thời gian [50]. Nhưng typ 2 gây bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng ở lợn và là   kiểu huyết thanh phổ biến nhất  ảnh hưởng đến con người rộng rãi trên toàn thế  giới, có rất ít trường hợp gây bệnh ở người do typ 1 và typ 14. Hình 1.1: Vi khuẩn liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi điện tử  (http://genome.jgi­psf.org/strsu/strsu.home.html) Vi khuẩn S. suis phát triển trong điều kiện môi trường có 5­ 10% CO2, mọc  trên các môi trường nuôi cấy giàu chất dinh dưỡng như  môi trường thạch máu,   Đặng Thị Kiều Oanh                                   3   Cao học K18
  17. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    thạch Chocolate, nhưng mọc tốt nhất trên môi trường Columbia, nhiệt độ  thích   hợp 370C, nhưng có thể  phát triển được  ở  một khoảng nhiệt độ  rất rộng 10 –   450C, pH thích hợp 7–7,2. Sau 24 giờ, ở 37 0C, vi khuẩn mọc tạo những khuẩn lạc   nhỏ, tròn, lồi, bờ đều, màu xám hoặc trong suốt, hơi nhầy. S. suis  gây tan huyết dạng  alpha  trên môi trường thạch máu cừu và tan  huyết dạng beta trên môi trường thạch máu ngựa (Hình 1.2).                    Hình 1.2: Khuẩn lạc S. suis trên môi trường thạch máu cừu và thạch máu ngựa Mặc dù chức năng của 20­30% bộ  gen chưa được biết nhưng nhiều  gen đóng vai trò trong  bệnh  sinh nhiễm trùng đã được nghiên cứu. Đó là  những gen chịu trách nhiệm sản xuất polysacarit, vận chuyển vỏ, các yếu  tố  hạn  chế   sắt,  yếu  tố   ly  giải,  các   protein  liên  quan   đến  độc  lực,  các  enzym, hệ thống arginine deminase và các protein gắn IgG. Có 17 chủng S.  suis  đã được giải trình tự  gen. Tùy từng chủng, bộ  ben có kích thước từ  2,01 đến 2,18 Mb với tỷ  lệ  GC từ  41 đến 41,7%. Trong bộ  gen của 17  chủng chứa từ  1607 đến 2427 gen và có từ  1559 đến 2334 loại protein  (Bảng 1.1).  Bảng 1.1. Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis Chromosomes [13]    Scaffolds or contigs [3]    SRA or Traces [0]    No data [1] Tình  KT  GC TT Vi sinh vật Chr Plasmids Gene Protein trạng (Mb)  % 1 S. suis 05ZYH33 1 ­ 2.1 41.1 2,254 2,186 Đặng Thị Kiều Oanh                                   4   Cao học K18
  18. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    Tình  KT  GC TT Vi sinh vật Chr Plasmids Gene Protein trạng (Mb)  % 2 Streptococcus suis P1/7 1 ­ 2.01 41.3 2,011 1,824 Streptococcus suis  3 1 1 2.17 41 2,136 1,947 BM407 Streptococcus suis  4 1 ­ 2.1 41.1 2,253 2,185 98HAH33 5 Streptococcus suis A7 1 ­ 2.04 41.2 2,064 1,974 6 Streptococcus suis D12 1 ­ 2.18 41.3 2,190 2,078 7 Streptococcus suis D9 1 ­ 2.18 41 2,196 2,074 8 Streptococcus suis GZ1 1 ­ 2.04 41.4 2,047 1,977 9 Streptococcus suis JS14 1 ­ 2.14 41.2 2,174 2,066 10 Streptococcus suis SC84 1 ­ 2.1 41.1 2,068 1,898 11 Streptococcus suis SS12 1 ­ 2.1 41.2 2,161 2,079 12 Streptococcus suis ST1 1 ­ 2.03 41.4 2,097 1,987 13 Streptococcus suis ST3 1 ­ 2.03 41.3 2,053 1,952 Streptococcus suis  14 ­ ­ 1.64 41.7 1,607 1,559 05HAS68 Streptococcus suis  15 ­ ­ 2.14 41.1 2,162 2,119 89/1591 16 Streptococcus suis R61 ­ ­ 2.39 41.2 2,427 2,334 17 Streptococcus suis S735 ­ ­ ­ ­ ­ Nguồn: NCBI > Genomes & Maps > Genome 1.1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán *Vỏ polysacarit của vi khuẩn  S. suis có lớp vỏ  polysacarit chắc chắn (capsular polysaccharide ­ cps). Việc   định  typ huyết thanh vi  khuẩn  dựa trên cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ  này.  Trong các loại typ huyết thanh, các typ 1,2,7 và 9 được cho là có liên quan nhiều   hơn đến bệnh nhiễm trùng liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn. Tuy nhiên, khả  năng  nhiễm   đa   typ   cũng   có   thể   xảy   ra.   Lớp   vỏ   typ   1   bao   gồm   các   loại   đường:  Galactose, glucose, N­acetyl glucosamine, N­acetyl galactosamine và sialic acid. Ở  typ 2, N­acetyl glucosamine được thay thế  bằng rhamnose. Đặc điểm cấu trúc   của lớp vỏ các typ khác chưa được nghiên cứu sâu.  *Suilysin  Đặng Thị Kiều Oanh                                   5   Cao học K18
  19. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    Suilysin  là một yếu tố  gây tan huyết được  mã  hóa bởi gen sly  của  S. suis.  Protein  suilysin  thuộc nhóm các độc tố  kết hợp với cholesterol và có độ  tương   đồng cao với pneumolysin (yếu tố ly giải tế bào của Streptococcus pneumoniae).  Gen sly có mặt  ở  hầu hết các typ. Nghiên cứu của Takamatsu và cs (2002)  cho rằng gen  sly  có thể  có nguồn gốc ngoại lai.   Suilysin  có khả  năng gây tổn  thương tế  bào và làm tăng khả  năng xâm nhập của vi khuẩn (thí nghiệm được  tiến hành in vitro sử dụng các tế bào biểu mô và các tế bào miễn dịch). Ngoài ra,   suilysin  còn  có  thể   "khởi   động"   cho  quá   trình   sản   xuất   và   tác   động   của   các   cytokine. Thí nghiệm sử  dụng các dạng đột biến của sly cho thấy mức độ   ảnh  hưởng khác nhau của suilysin tùy thuộc vào vật chủ, loại tế bào và loại đột biến.  Tuy kháng thể chống suilysin có tác dụng bảo vệ nhất định, các thử nghiệm  gây nhiễm trên động vật với các chủng mang   suilysin  cho rằng  suilysin  không  phải là yếu tố thiết yếu cho độc lực của liên cầu khuẩn.  *Hệ thống Arginine deminase  Năm 2002 Winterhoff và các cộng sự  đã xác định được 2 protein bề mặt vi  khuẩn có kích thước 47 kDa và 53 kDa. Hai protein này có mức độ  tương đồng   cao   với   hệ   thống  arginine   deminase  (ADS)   của  S.   pyogenes.  Protein   47   kDa  tương   đồng   với  ornithine   carbamoyl   transferase  còn   53   kDa   tương   đồng   với  streptococcal acid glycoprotein (SAGP).  ADS là hệ thống enzym cung cấp ATP từ quá trình biến đổi arginine thành  ornithine. Hoạt động của ADS có thể  xảy ra  ở  độ  pH thấp. Hệ  thống ADS có   mặt trong tất cả các chủng vi khuẩn S. suis *Protein được giải phóng do muramidase (muramidase­released protein; mrp) và  yếu tố ngoại bào (extracellular factor­ ef) Hai yếu tố  mrp và ef hiện diện  ở hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập từ  động vật bị  bệnh nhưng tần số xuất hiện của chúng không cao  ở  các động vật  Đặng Thị Kiều Oanh                                   6   Cao học K18
  20. Luận văn thạc sĩ                                                                                                Vi sinh vật  học    truyền bệnh.  Ở các chủng gây bệnh trên người, một số  nghiên cứu cho thấy tỷ  lệ 69, 6% số chủng phân lập được mang gen mrp. Mrp và ef cũng được coi là các yếu tố chỉ thị cho S. suis typ 2. Các chủng vi  khuẩn có độc lực yếu cũng có khả năng sản sinh mrp và biến thể của ef (ký hiệu  là ef*). Với các chủng thuộc typ 2, 5 allen của gen mã hóa ef đã được xác định.  Biến thể  mrp  nhỏ  (small  mrp;  mrps) hiện diện  ở  typ 1 và  mrp  lớn (large  mrp;  mrp*) có mặt  ở  typ 9. Các chủng Canada không có mrp và ef. Đã có nghiên cứu  gây nhiễm trên lợn cho rằng typ 1 và 2 do đột biến thiếu hoàn toàn hai protein này  có độc lực chẳng khác gì vi khuẩn thể  hoang dại. Tuy vậy vai trò của chúng   trong đáp  ứng miễn dịch vẫn cần được làm sáng tỏ  bằng các thí nghiệm gây  nhiễm thực nghiệm.  *Các yếu tố độc lực khác  Chúng ta đã biết rằng rất nhiều  yếu tố  có liên quan và chịu  ảnh hưởng  ở  những giai đoạn khác nhau của quá trình bệnh lý. Cũng như  vậy,  đối với vi   khuẩn S. suis, gần 40 gen khác nhau đã được tìm thấy (theo Smith và cs, 2001).   Các gen này mã hóa cho các protein có chức năng như: yếu tố  điều hòa, vận   chuyển, đảm nhận chức năng đối với quá trình sinh lý của bản thân vi khuẩn và   cả  các nhóm chưa xác định được chức năng. Một nghiên cứu gây nhiễm bằng  chủng S. suis có độc lực yếu và bổ sung thêm các gen từ các chủng gây bệnh đã   tìm thấy chuỗi nucleotide có kích thước 3kb mang thông tin quan trọng liên quan  đến độc lực của vi khuẩn.  Năm 2004, Allen và cs. đã xác định yếu tố làm tan có khả năng hỗ trợ cho sự  xâm nhập của vi khuẩn qua tác động đến acid hyaluronic (tương tự như tác động   của nhiều loại vi khuẩn khác).  1.1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis Quá trình xâm nhập Đặng Thị Kiều Oanh                                   7   Cao học K18
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.11: Bộ Luận Văn Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Tài Chính Ngân Hàng
172 tài liệu
836 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
7=>1