Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phương pháp xác định một số Steviol glycosides trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:83

Thêm vào BST

Báo xấu

62
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của Luận văn nhằm xây dựng một quy trình phân tích hiệu quả trong lĩnh vực đánh giá chất lượng sản phẩm thực phẩm với chỉ tiêu là nhóm Steviol glycosides. Để hiểu rõ hơn mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của Luận văn này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phương pháp xác định một số Steviol glycosides trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------ LƢU THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ STEVIOL GLYCOSIDES TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------- LƢU THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ STEVIOL GLYCOSIDES TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 Cán bộ hƣớng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng TS. Trần Cao Sơn Hà Nội - 2020
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN......................................................................................3 1.1. Tổng quan về cây cỏ ngọt………………………………………………………3 1.1.1. Giới thiệu……………………………………………………………………..3 1.1.1.1. Thực vật học..………………………………………………………………3 1.1.1.2. Tác dụng.……………………………..…………………………………….4 1.1.1.3. Liều dùng an toàn ở ngƣời………………………………………………….6 1.1.2. Thành phần hóa học trong cây cỏ ngọt……………………………………….7 1.2. Tổng quan về Steviol glycoside………………………………………………...8 1.2.1. Giới thiệu……………………………………………………………………..8 1.2.2. Tính chất vật lý, hóa học……………………………………………………10 1.2.3. Ứng dụng thực tế của Steviol glycosides…………………………………...11 1.3. Các phƣơng pháp xác định Steviol glycosides…………………...…………...12 1.3.1. Sắc ký lớp mỏng…………………………………………………………….13 1.3.2. Phƣơng pháp quang phổ…………………………………………………….14 1.3.3. Phƣơng pháp điện di mao quản……………………………………………..15 1.3.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ…………………………………………17 1.3.5. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao UV-Vis/PDA…………………….19 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................27 2.1. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………………….27 2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………27 2.3. Đối tƣợng nghiên cứu………………………………………………………...27 2.4. Nguyên vật liệu – thiết bị, dụng cụ…………………………………………..28
2.4.1. Nguyên vật liệu……………………………………………………………..28 2.4.2. Thiết bị, dụng cụ……………………………………………………………28 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu...…………………………………..……………….29 2.5.1. Phƣơng pháp phân tích……………………………………………………..29 2.5.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu…………………………………………………….31 2.5.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp………………………………...32 2.5.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu………………………………………………….33 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................34 3.1.Lựa chọn các điều kiện phân tích sắc ký……………………………………..34 3.1.1. Khảo sát nồng độ đệm……………………………………………………..34 3.1.2. Khảo sát pH pha động……………………………………………………..36 3.1.3. Khảo sát nhiệt độ cột………………………………………………………38 3.1.4. Điều kiện tối ƣu phân tích một số Steviol glycosides bằng HPLC………..39 3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu………………………………………………..40 3.2.1. Khảo sát dung môi chiết mẫu………………………………………………40 3.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu………………………………………………..41 3.2.3. Khảo sát thời gian chiết mẫu……………………………………………….42 3.2.4. Khảo sát điều kiện làm sạch qua SPE……………………………………...42 3.3. Thẩm định phƣơng pháp…………………………….……………………….44 3.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn…………………………………………………….44 3.3.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp………………..46 3.3.3. Độ lặp lại…………………………………………………………………..47 3.3.4. Đánh giá độ thu hồi………………………………………………………..51 3.4. Phân tích mẫu thực tế………………………………………………………..56 KẾT LUẬN............................................................................................................60 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 62 PHỤ LỤC ..............................................................................................................68
LỜI CẢM ƠN Luận văn này đƣợc hoàn thành với sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của các Thầy Cô, gia đình và bạn bè, đồng nghiệp. Với tình cảm chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng và TS. Trần Cao Sơn là những ngƣời thầy đã tận tâm hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các quý Thầy, Cô trong Bộ môn Hóa Phân tích, khoa Hóa Học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tâm huyết truyền dạy kiến thức và luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi đƣợc học tập, nghiên cứu tại đây. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện, TS. Vũ Thị Trang và các anh chị đồng nghiệp tại khoa Dinh dƣỡng và phụ gia thực phẩm, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình làm luận văn. Lời sau cùng, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những ngƣời thân trong gia đình, tới những ngƣời bạn, tới lãnh đạo và các đồng nghiệp khoa Dinh dƣỡng và Phụ gia thực phẩm – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã luôn động viên, ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn.
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Association of Official Analytical AOAC Hiệp hội các cộng đồng phân tích Communities Lƣợng ăn vào hằng ngày ADI Acceptable Daily Intake chấp nhận đƣợc TLC Thin-layer chromatography Sắc ký lớp mỏng CE Capillary Electropherosis Điện di mao quản High-performance thin-layer HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao chromatography HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao GC Gas chromatography Sắc ký khí GC-MS Gas chromatography mass spectrometry Sắc ký khí khổi phổ LC-MS Liquid chromatography mass pectrometry Sắc ký lỏng khối phổ MDL Method detection limit Giới hạn phát hiện phƣơng pháp MQL Method quantification limit Giới hạn định lƣợng phƣơng pháp MS Mass spectrometry Khối phổ PDA Photometric Diode Array Mảng Diot quang RP- Reverse phase high performance liquid Sắc ký lỏng pha đảo HPLC chromatography SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extration Chiết pha rắn UV-Vis Ultraviolet - Visible Tử ngoại – Khả kiến
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Lá cây cỏ ngọt ................................................................................................ 3 Hình 1.2: Khung cấu trúc cơ bản của Steviol glycosides .............................................. 8 Hình 1.3: Thành phần chính của Steviol glycosides trong lá cỏ ngọt: a. Stevioside; b. Rebaudioside A ......................................................................................... 9 Hình 2.1: Hệ thống thiết bị HPLC-PDA ..................................................................... 29 Hình 2.2: Quy trình xử lý mẫu dự kiến ........................................................................ 31 Hình 3.1: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động 5mM. ........................................................................................................... 35 Hình 3.2: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động 10mM .......................................................................................................... 35 Hình 3.3: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động 20mM .......................................................................................................... 35 Hình 3.4: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động 50mM .......................................................................................................... 36 Hình 3.5: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở pH = 7 ........................................... 37 Hình 3.6: Ảnh hƣởng của pH đến độ phân giải của Stevioside và Rebaudioside A.....37 Hình 3.7: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 20oC ................... 38 Hình 3.8: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 40oC ................... 38 Hình 3.9: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 60oC ................... 39 Hình 3.10: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycoside ở nhiệt độ cột 79oC .................. 39 Hình 3.11: Hàm lƣợng của các Steviol glycosides khi sử dụng các dung môi chiết khác nhau .................................................................................................... 40 Hình 3.12: Hiệu suất thu hồi (H%) của các Steviol glycosides khi làm sạch trên cột C18 và HLB ................................................................................................ 43 Hình 3.13: Quy trình xử lý mẫu tối ƣu......................................................................... 44 Hình 3.14: Đồ thị tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ RebA ............................ 45 Hình 3.15: Đồ thị tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ Stevioside ..................... 45
Hình 3.16: Kết quả phân tích tổng hàm lƣợng Steviol glycosides của mẫu cỏ ngọt và đƣờng ăn kiêng ........................................................................................... 57 Hình 3.17: Kết quả phân tích tổng hàm lƣợng Steviol glycosides của mẫu nƣớc giải khát ............................................................................................................. 58
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Cấu trúc của các chất nhóm Steviol glycosides và độ ngọt so với đƣờng sucrose .......................................................................................................... 9 Bảng 1.2: Mức quy định giới hạn sử dụng Steviol glycosides trong thực phẩm ......... 11 Bảng 1.3: Tóm tắt kết quả một số phƣơng pháp xác định Steviol glycosides ............. 23 Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đến thời gian lƣu của nhóm chất Steviol glycosides ....................................................................................... 37 Bảng 3.2: Hàm lƣợng của các chất Steviol glycosides (mg/g) thu đƣợc với dung môi chiết khác nhau .................................................................................... 41 Bảng 3.3: Hàm lƣợng của các chất Steviol glycosides ở các nhiệt độ khác nhau ....... 41 Bảng 3.4: Hàm lƣợng Steviol glycosides (mg/g) thu đƣợc với thời gian chiết khác nhau............................................................................................................. 42 Bảng 3.5: Quy trình làm sạch qua SPE ........................................................................ 43 Bảng 3.6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của các chất Steviol glycosides .................................................................................................. 44 Bảng 3.7: Đƣờng hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ Steviol glycosides ................................................................................................... 46 Bảng 3.8: Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (MDL) và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp (MQL) của các Steviol glycosides ....................................... 47 Bảng 3.9: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu lá cỏ ngọt ......... 48 Bảng 3.10: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu đƣờng ăn kiêng... ........................................................................................................ 49 Bảng 3.11: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu nƣớc ngọt.. .... 50 Bảng 3.12: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu lá cỏ ngọt ........ 52 Bảng 3.13: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu đƣờng ăn kiêng. .......................................................................................................... 53 Bảng 3.14: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu nƣớc giải khát. 54 Bảng 3.15: Bảng kết quả độ thu hồi so với yêu cầu của AOAC .................................. 55
Bảng 3.16: Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên nguyên liệu đƣờng cỏ ngọt, cây cỏ ngọt, đƣờng ăn kiêng ....................................................................... 56 Bảng 3.17: Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên mẫu trà giảm cân và nƣớc giải khát ...................................................................................................... 57
ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay lƣợng đƣờng con ngƣời tiêu thụ ngày càng cao do thói quen trong bữa ăn hàng ngày, dẫn đến nguy cơ về các bệnh béo phì, tiểu đƣờng ngày càng tăng. Để ngăn ngừa nguy cơ này, các loại đƣờng thông thƣờng đang có xu hƣớng đƣợc thay thế bằng các chất phụ gia tạo ngọt nhƣng không sinh năng lƣợng nhƣ saccharin, natri cyclamate, sucralose, acefulfame K và aspartame. Các loại đƣờng này có ƣu điểm là rẻ tiền và tiện dụng nhƣng nhƣợc điểm là có thể gây ảnh hƣởng xấu đến sức khoẻ con ngƣời nếu sử dụng với một thời gian kéo dài. Vì vậy hiện nay tâm lý chung của ngƣời tiêu thụ, đặc biệt ngƣời bị tiểu đƣờng là tìm về với những sản phẩm thiên nhiên, trong đó nhóm những chất tạo ngọt thiên nhiên ví dụ nhƣ cây cỏ ngọt có nhiều ƣu thế và đang đƣợc ƣa chuộng nhất. Nhóm Steviol glycosides là nhóm hợp chất tạo ngọt tự nhiên thu đƣợc từ loài cỏ ngọt, có mức độ ngọt gấp 75 – 300 lần so với đƣờng kính [13]. Đây là loại chất tạo ngọt không sinh năng lƣợng, có tác dụng trong điều trị bệnh tiểu đƣờng, hạ đƣờng huyết, béo phì, sâu răng, tăng huyết áp, kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng viêm. Nhiều sản phẩm nhƣ kẹo, bánh ngọt, đƣờng cho ngƣời ăn kiêng và các loại nƣớc ngọt đã đƣợc sản xuất sử dụng chất tạo ngọt Steviol glycosides. Mặc dù đây là các hợp chất thu đƣợc từ thiên nhiên, không sinh năng lƣợng khi tiêu thụ vào cơ thể, nhƣng Ủy ban chuyên gia quốc tế về phụ gia thực phẩm (JECFA) vẫn đƣa ra mức hấp thụ hàng ngày chấp nhận đƣợc đối với các hợp chất này (mức ADI) là 4 mg/kg trọng lƣợng cơ thể. Hiện nay tại Việt Nam chƣa có nhiều phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng các chất nhóm Steviol glycosides trong thực phẩm, chỉ có một vài nghiên cứu về phân tích và chiết tách các thành phần này trong nguyên liệu thô. Do đó, việc xây dựng đƣợc một phƣơng pháp phân tích đồng thời các hợp chất này là rất cần thiết và có ý nghĩa thực tế trong việc cung cấp thông tin cần thiết cho các nhà quản lý và ngƣời tiêu dùng để lựa chọn và điều chỉnh hợp lý khẩu phần dinh dƣỡng hàng ngày. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đƣợc sử dụng rất phổ biến hiện nay và 1
phƣơng pháp này cho thấy khả năng tách cao đối với các hợp chất đƣờng cỏ ngọt với nhiều ƣu điểm nhƣ độ nhạy và độ chính xác cao, hóa chất phổ biến, quy trình phân tích đơn giản. Từ những luận giải nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp xác định một số Steviol glycosides trong thực phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng” đƣợc thực hiện với mong muốn đóng góp phần nhỏ vào việc xây dựng một quy trình phân tích hiệu quả trong lĩnh vực đánh giá chất lƣợng sản phẩm thực phẩm với chỉ tiêu là nhóm Steviol glycosides. 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây cỏ ngọt 1.1.1. Giới thiệu 1.1.1.1. Thực vật học Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) là một loài thực vật thuộc chi Stevia, thuộc họ hoa hƣớng dƣơng (Asteraceae) [40]. Cỏ ngọt là cây lâu năm có thân rễ khoẻ, ít phân nhánh, mọc nông từ 0-30 cm tuỳ thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nƣớc ngầm của đất. Cỏ ngọt có dạng thân bụi, chiều cao 50-60 cm, thâm canh tốt có thể đạt 80-120 cm. Lá mọc từng cặp đối nhau hình thập tự, mép lá có từ 12-16 răng cƣa, lá hình trứng ngƣợc, lá trƣởng thành dài Hình 1.1. Lá cây cỏ ngọt khoảng 50-70 mm rộng 17-20 mm [24]. Về đặc tính sinh học của cây cỏ ngọt: Sau khi gieo hạt 9-10 ngày thì mọc, nhiệt độ thích hợp cho việc nẩy mầm từ 20-25oC, ẩm độ 60-85%, nhiệt độ dƣới 15oC hạt không nẩy mầm, trên 35oC hạt sẽ chết. Nhiệt độ thích hợp nhất cho cây phát triển từ 25-30oC, độ ẩm 70-75%. Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao cây sinh trƣởng chậm. Cỏ ngọt là cây ƣa độ ẩm vừa phải, nếu úng ngập, hạn hán lâu đều gây hại và có thể chết cây [40]. Cây cỏ ngọt có nguồn gốc từ các vùng của Brazil và Paraguay (Nam Mỹ) hiện đƣợc trồng ở nhiều nơi trên thế giới để làm chất tạo ngọt và làm thuốc, là nguồn gốc của các sản phẩm làm ngọt đƣợc gọi chung là stevia và đƣợc bán dƣới nhiều tên thƣơng mại khác nhau [11]. Các hợp chất hóa học tạo ra vị ngọt của nó là các glycosides steviol khác nhau (chủ yếu là Stevioside và Rebaudioside ), có độ 3
ngọt gấp 75 lần 300 lần so với đƣờng mía [10]. Ngày nay, nhiều nƣớc trên thế giới đã phát triển việc dùng loại cây này trong đời sống. 1.1.1.2. Tác dụng Đƣờng cỏ ngọt có độ ngọt gấp nhiều lần so với đƣờng mía và có thể đƣợc sử dụng thay thế cho đƣờng mía. Các hợp chất này khi tiêu hóa không bị phá vỡ cấu trúc hóa học, không chuyển hóa trong cơ thể con ngƣời, không tạo ra năng lƣợng an toàn cho những ngƣời cần kiểm soát lƣợng đƣờng trong máu. Điều này có ý nghĩa vô cùng lớn, đặc biệt là trong bối cảnh của hiện nay, con ngƣời đang tìm kiếm những thực phẩm tự nhiên và an toàn đối với sức khỏe do tỷ lệ ngƣời mắc bệnh tiểu đƣờng và béo phì tăng cao và mối lo ngại đối với an toàn thực phẩm ngày càng tăng khi các chất làm ngọt hóa học đang đƣợc sử dụng rộng rãi [10]. Steviol glycosides đƣợc coi là an toàn [13]; tuy nhiên, các nghiên cứu trên động vật cho thấy có một số tác động bất lợi do steviol aglycone [10]. Khi sử dụng đƣờng cỏ ngọt ở ngƣỡng hàm lƣợng cao trong thời gian dài có thể ảnh hƣởng bất lợi tới sức khỏe. Tại nhiều nƣớc trên thế giới, Stevioside đƣợc dùng làm chất tạo vị ngọt thay thế các loại đƣờng mía hoặc đƣờng hóa học [2]. Cỏ ngọt phơi khô, sấy khô có thể làm trà. Bột lá khô có thể trộn với bột làm bánh để thay thế đƣờng. Trong đầu thập niên 1970, ngƣời Nhật bắt đầu trồng cây và đƣa vào sản xuất công nghiệp để thay thế các chất làm ngọt nhân tạo nhƣ cyclamate hay saccharin. Nhật Bản cũng là Quốc gia đầu tiên ở châu Á sử dụng Stevioside nhƣ một chất làm ngọt trong ngành công nghiệp thực phẩm và dƣợc phẩm. Chúng chiếm 40% thị trƣờng chất làm ngọt trong năm 2005 tại đất nƣớc này và là nƣớc tiêu dùng lớn nhất thế giới [13]. Cỏ ngọt hiện nay đƣợc trồng và tiêu thụ ở nhiều nƣớc châu Á nhƣ: Trung Quốc (từ năm 1984), Hàn Quốc, Thái Lan và Malaysia [24]. Nó cũng đƣợc tìm thấy ở Nam Mỹ và Israel [13]. Ngƣời dân Trung Quốc xem cỏ ngọt nhƣ một dƣợc liệu thiên nhiên rất tốt để giúp làm giảm cân, giúp ăn ngon và tiêu hóa tốt. Hiện nay chất tạo ngọt Stevioside đang đƣợc sử dụng trong kẹo gum, bánh ngọt và trong các loại nƣớc ngọt nhƣ Coca Cola,…. Hơn nữa, ở các Quốc gia Châu Á và 4
Nam Mỹ đƣờng cỏ ngọt đƣợc công nhận và đƣợc cho phép sử dụng nhƣ một chất phụ gia. Ngƣợc lại các Quốc gia phƣơng Tây (Anh, Pháp, Hoa Kỳ, Úc Châu, Canada, v.v…) lại chƣa công nhận đƣờng cỏ ngọt là chất phụ gia để tạo vị ngọt nhƣ các chất aspartame, natri cyclamate mà chỉ đƣợc xem là một loại thực phẩm bổ sung. Tại Việt Nam, từ năm 1988, cỏ ngọt đã đƣợc nhập và trồng ở nhiều vùng nhƣ Hà Giang, Cao Bằng, Hà Tây, Lâm Đồng... Từ năm 1990 Công ty Dƣợc liệu TWI hƣớng dẫn kỹ thuật trồng trên diện tích sản xuất công nghiệp để cung ứng cho nhu cầu trong nƣớc và xuất khẩu. Cỏ ngọt không tạo năng lƣợng nên rất thích hợp để giảm cân. Cỏ ngọt không làm bẩn răng, không gây sâu răng, bảo vệ vệ sinh răng miệng và cũng giúp vào việc làm lành các vết thƣơng ngoài da, bổ tim, lợi tiểu, làm giảm huyết áp ở những ngƣời huyết áp cao, và đặc biệt nhất là đối với những ngƣời bị bệnh tiểu đƣờng, cỏ ngọt giúp tuyến tụy trong việc tiết chất insulin. Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cỏ ngọt có thể mang lại lợi ích điều trị chống tăng đƣờng huyết, chống viêm, chống khối u, chống tiêu chảy, lợi tiểuvà tác dụng điều hòa miễn dịch. Một số tác dụng của cây cỏ ngọt đã đƣợc đánh giá [14]: - Hỗ trợ điều trị đau dạ dày: Trong cây cỏ ngọt có khá nhiều hoạt chất giúp giảm các cơn đau và chứng bệnh đƣờng tiêu hóa, đặc biệt là rối loạn dạ dày. Do vậy, cây cỏ ngọt chính là một loại thuốc bổ giúp chống lại các bệnh rối loạn dạ dày, giảm đau và tiêu hóa tốt. - Chăm sóc răng miệng: Nhờ chứa nhiều hoạt chất kháng khuẩn mạnh, sử dụng nƣớc cây cỏ ngọt súc miệng thƣờng xuyên giúp ngăn ngừa chảy máu chân răng ở những ngƣời mắc bệnh viêm lợi và giúp chăm sóc tốt hơn cho răng miệng. - Chăm sóc da: cỏ ngọt đƣợc xem là một nguyên liệu tự nhiên chăm sóc da khá tốt, có tác dụng giảm tiết bã nhờn, làm giảm các vết nhăn, giúp làn da trở lên sáng trắng hơn, chống viêm da và ngăn ngừa mụn trứng cá. 5
- Chăm sóc tóc: Giúp tóc đẹp, mƣợt và giảm các vấn đề về gàu và da đầu. - Giải nhiệt, lợi tiểu: Có tác dụng giúp thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu hiệu quả. Cây cỏ ngọt có thể sử dụng kết hợp với các loại nhân trần, cam thảo, trà atiso uống mỗi ngày nhƣ nƣớc bình thƣờng, không chỉ giúp thanh nhiệt, giải độc, loại nƣớc này còn có công dụng lợi tiểu hiệu quả. - Trị tiểu đƣờng, béo phì, cao huyết áp: Nghiên cứu trên 40 bệnh nhân cao huyết áp độ tuổi 50 cho thấy uống chè cỏ ngọt trong một tháng, kết quả huyết áp ổn định hơn, lợi tiểu, ngƣời khỏe và hoạt bát hơn. Cỏ ngọt và Stevioside có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu chất đƣờng và chất bột của ngƣời bệnh, vì thế sẽ làm giảm đƣờng huyết. Liều dùng theo thử nghiệm ở Braxin là mỗi lần 0,25 g steviosid (hoặc 2,5 g lá cỏ ngọt), ngày 4 lần, uống trong nhiều ngày. Ngoài ra cỏ ngọt và Stevioside còn chữa béo phì do có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu đƣờng và tinh bột của cơ thể, nên cũng có tác dụng chữa béo phì. Liều dùng 0,5 – l g steviosidchiara dùng 3-4 lần trong ngày, uống nhiều ngày. Lá cỏ ngọt hoặc Stevioside còn thƣờng dùng làm chất điều vị cho các loại trà thuốc. Tại Việt Nam, cũng đã có một số chế phẩm trà thuốc có cỏ ngọt nhƣ trà actisô - stevia. Trà sâm quy - stevia có sâm, tam thất, đƣơng quy, thục địa, táo, long nhãn, ngũ gia bì và cỏ ngọt. Trà túi lọc Sotevin có dừa cạn, hoa cúc, hoa hoè và cỏ ngọt. 1.1.1.3. Liều dùng an toàn ở người Tính an toàn của steviol glycosides đã đƣợc xác nhận trong nhiều nghiên cứu độc tính bao gồm độc tính cấp tính và bán cấp tính, độc tính sinh sản, độc tính di truyền và gây ung thƣ. Do đó, steviol glycosides đƣợc coi là an toàn đối với cơ thể ngƣời. Một số nghiên cứu Nồng độ Stevioside trong một số nƣớc giải khát ở Nhật Bản đƣợc ghi nhận là 0,005 - 0,007%. Nếu một ngày uống 1 lít nƣớc thì lƣợng steviosid đƣa vào cơ thể là 0,05 - 0,07 g tƣơng ứng với khoảng lg lá Cỏ Ngọt. Đây là liều lƣợng an toàn, đã đƣợc Chính phủ Nhật cho phép. Ủy ban chuyên gia quốc tế 6
về phụ gia thực phẩm (JECFA) đƣa ra mức tiêu thụ chấp nhận hàng ngày đối với các hợp chất này, mức ADI là 4 mg/kg trọng lƣợng cơ thể. 1.1.2. Thành phần hóa học trong cây cỏ ngọt. Chất cơ bản tạo nên độ ngọt tự nhiên của loại cây cỏ ngọt là các hợp chất Steviol glycosides, hợp chất này ngọt gấp 300 lần đƣờng mía (saccarose) [13], không lên men, ít năng lƣợng và có vị rất thơm ngon, những ngƣời phải kiêng đƣờng nhƣ bệnh nhân tiểu đƣờng có thể sử dụng hợp chất này để thay thế đƣờng trong các bữa ăn hàng ngày. Cỏ ngọt thƣờng đƣợc thu hái, phơi khô và có thể sử dụng cho mọi lứa tuổi. Thành phần trong lá (tính theo % chất khô) chứa 6,2% protein, 5,6% chất béo, 52,8% carbohydrate, 15% Stevioside và khoảng 42% chất hòa tan trong nƣớc là các diterpenoid glycosides và gồm có Stevioside (5 – 10%), rebauvioside A (2 – 4%), rebauvioside C (1 – 2%), và dulcoside A (0,5 – 1%), một số hợp chất khác là rebauvioside B, D và E. Chất ngọt Stevioside có vị ngọt gấp 300 lần hơn đƣờng mía (saccharose). Stevioside rất ổn định ở nhiệt độ cao 198oC (388 độ F), không bị sạm màu và caramel hóa [11]. Bên cạnh Stevioside, Rebaudioside có hàm lƣợng ít hơn nhƣng ngọt hơn Stevioside 1,2 – 1,5 lần. Ngoài ra, trong thành phần cỏ ngọt chứa một hàm lƣợng thấp các chất: stigmasterol, sitosterol, campesterol, flavonoid, và cosmosiin, caryophyllen, spathuienol. Một số khoáng đa lƣợng và vi lƣợng đƣợc tìm thấy trong cỏ ngọt là Ca, Mg,…Về mặt sinh vật học, sự hiện diện của gibberellin A20 trong cỏ ngọt đã chứng minh steviol có thể chuyển hóa thành gibberillin. Phần chiết stevia có tính chất ức chế rotavirus, chống vi khuẩn Helicobacter pylori, đƣợc ứng dụng trong điều trị khối u [21]. Những flavonoid trong cây (4,75%) có tính chất chống vi khuẩn Bacillus subtilus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli... Các thí nghiệm trên chuột cho thấy chất này ức chế sự phát triển ung thƣ da. 7
1.2. Tổng quan về Steviol glycoside 1.2.1. Giới thiệu Steviol glycosides là một nhóm glycoside có nguồn gốc từ cây cỏ ngọt , có thể đƣợc sử dụng làm chất làm ngọt. Bao gồm tám diterpene glycoside: Stevioside, steviolbioside, Rebaudiosides A, B, C, D và E, và dulcoside A. Steviol glycoside trong cỏ ngọt đã đƣợc báo cáo là ngọt hơn từ 30 đến 320 lần so với sucrose. Chúng có cấu trúc tƣơng tự nhau steviol aglycon ở C-4 và C-13 liên kết với mono-, di- hoặc trisaccharide: glucose hoặc rhamnose hoặc cả hai [11]. Khung cấu trúc của nhóm Steviol glycosides và thành phần chính đƣợc thể hiện trong hình 1.2 và 1.3. Cấu trúc bảy chất phân tích trong nhóm Steviol glycosides và độ ngọt so với đƣờng sucrose đƣợc thể hiện trong bảng 1.1. Hình 1.2: Khung cấu trúc cơ bản của Steviol glycosides 8
a. b. Hình 1.3: Thành phần chính của steviol glycosides trong lá cỏ ngọt: a. Stevioside; b. Rebaudioside A Bảng 1.1: Cấu trúc của các chất nhóm Steviol glycosides và độ ngọt so với đường sucrose Độ ngọt so 1 2 Hợp chất Chuỗi R Chuỗi R với sucrose [24]. Stevioside β – Glc β-Glc-β-Glc (2 1) 300 Steviolbioside H β - Glc - β - Glc (2 1) 100-125 β - Glc - β - Glc (2 1) Rebaudioside A β – Glc 250-50 β - Glc – (3 1) β - Glc - β - Glc (2 1) Rebaudioside B H 300-350 β - Glc – (3 1) β - Glc - α - Rha (2 1) Rebaudioside C β – Glc 50-120 β - Glc – (3 1) β - Glc - β - Glc β - Glc - β - Glc (2 1) Rebaudioside D 250-450 (2 1) β - Glc – (3 1) 9
Độ ngọt so Hợp chất Chuỗi R1 Chuỗi R2 với sucrose [24]. Dulcoside A β – Glc β - Glc - α - Rha (2 1) 50-120 1.2.2. Tính chất vật lý, hóa học Stevioside là một loại bột trắng, tan tốt trong nƣớc, ethanol, methanol và không nên sử dụng trực tiếp. Khi đun nóng ở 100oC trong 1 giờ, dung dịch Stevioside ở pH 3-9 cho thấy vị ngọt ít thay đổi và không thay đổi ở 22oC trong 5 tháng [29,33]. Tuy nhiên, sự phân hủy xảy ra ở pH=10. Ngoài ra, có ghi nhận một số thay đổi của Stevioside và Rebaudioside trong đồ uống có ga do bị acid hóa với phosphor và acid citric trong quá trình bảo quản ở 37oC. Gia nhiệt ở 60oC trong 6 ngày làm mất 0% - 6% độ ngọt. Tiếp xúc ánh sáng mặt trời trong vòng 1 tuần không ảnh hƣởng đến Stevioside, nhƣng dẫn đến mất 20% Rebaudioside A. Nhờ độ ổn định cao, Stevioside là một chất làm ngọt phù hợp cho thực phẩm kể cả nấu chín và cho đồ uống. Stevioside còn ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật trong khoang miệng [26]. Trong số các thành phần của cỏ ngọt, Rebaudioside A đƣợc đặc biệt quan tâm nhờ hƣơng vị đƣợc yêu thích. Trong thực tế, Stevioside lại là chất chiếm phần lớn trong nhóm (60-70% tổng hàm lƣợng glycoside) nhƣng có dƣ vị đắng cùng hƣơng vị cam thảo còn Rebaudioside A chiếm khoảng 30-40% tổng hàm lƣợng glycoside và không có dƣ vị đắng (hậu vị cam thảo kéo dài lâu) [26]. Nếu Rebaudioside A có hàm lƣợng bằng Stevioside có thể loại bỏ dƣ vị đắng của sản phẩm. Tác dụng làm ngọt của các chất này hoàn toàn là hƣơng vị, không đƣợc tiêu hóa do không xảy ra phản ứng đƣờng phân khi ăn vì cơ thể ngƣời không thể chuyển hóa stevia. Do đó, các chất này có ít giá trị dinh dƣỡng, là chất có thể thay thế đƣờng tự nhiên cho bệnh nhân tiểu đƣờng và những ngƣời trong chế độ ăn kiêng kiểm soát carbohydrate [41]. 10